이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토파지는 최적의 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필요한 품질 관리 메커니즘입니다. 기능 장애β세포 미토파지는 인슐린 분비를 불충분하게 만듭니다. 미토파지의 고급 정량적 평가는 종종 유전자 보고자의 사용을 필요로 합니다. 유세포 분석을 통해 미토파지를 정량화하기 위한 미토콘드리아 표적 pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 mt-Keima 마우스 모델은 β 세포에서 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율은 미토파지를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 유전자 미토파지 리포터를 사용하는 것은 복잡한 유전자 마우스 모델 또는 주요 인간 섬과 같이 transfection하기 어려운 세포로 작업할 때 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 MtPhagy를 사용하여 1차 섬에서 β세포 미토파지를 정량화하는 새로운 보완 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy는 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아가 미토파지 중 리소좀과 같은 낮은 pH 환경에 있을 때 형광 강도를 증가시키는 pH에 민감한 세포 투과성 염료입니다. MtPhagy 염료를 β세포를 선택하는 Zn2+ 표지자인 Fluozin-3-AM 및 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)와 결합하여 미토콘드리아 막 전위를 평가함으로써 유세포 분석을 통해 β세포에서 미토파지 플럭스를 특이적으로 정량화할 수 있습니다. 이 두 가지 접근 방식은 매우 상호 보완적이어서 수많은 β세포 모델에서 미토콘드리아 품질 관리를 평가하는 데 유연성과 정확성을 제공합니다.
서론
췌장 β세포는 대사 요구를 충족시키기 위해 인슐린을 생산하고 분비하며, β세포 기능 장애는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 고혈당증과 당뇨병 발병의 원인이 됩니다. β-세포는 미토콘드리아 에너지 및 대사 출력을 통해 포도당 대사와 인슐린 분비를 결합하며, 이는 기능적 미토콘드리아 질량 1,2,3의 예비력에 의존합니다. β세포는 최적의 β세포 기능을 유지하기 위해 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의존하여 노화되거나 손상된 미토콘드리아를 제거하고 기능적인 미토콘드리아 질량을 보존합니다4. 선택적 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)은 미토콘드리아 품질 관리 경로의 핵심 구성 요소입니다.
살아있는 세포의 미토파지 평가는 종종 미토파지 중에 발생하는 미토콘드리아 pH의 변화에 의존합니다. 미토콘드리아는 약알칼리성 pH를 가지고 있으며, 건강한 미토콘드리아는 일반적으로 pH 중성 세포질에 존재합니다. 미토파지(mitophagy) 동안, 손상되거나 기능장애를 일으킨 미토콘드리아는 선택적으로 자가포식체에 통합되고 결국 산성 리소좀 내에....
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프로토콜
이 프로토콜에 제시된 동물 연구는 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 이 연구에는 15주 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD)을 섭취한 20주 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.
1. 염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가(방법 1)
- 쥐 섬 준비 및 처리
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
- 앞서 설명한 방법 2,10에 따라 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD, 60kcal% 지방19) 마우스에서 섬을 분리합니다.
- 100 units/mL 항진균제-항생제, 50 units/mL 페니실린-스트렙토마이신, 1 mM 나트륨 피루브산, 10 mM HEPES 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI 배지에서 37°C에서 밤새 배양 섬 샘플을 채취합니다( 재료 표 참조). 이 ....
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
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결과
염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가
이 염료 기반 접근법은 죽은 세포를 배제하기 위해 DAPI뿐만 아니라 Fluozin-3-AM, TMRE, MtPhagy를 사용하여 유전자 리포터 없이 일차 마우스 β세포 내의 미토파지 플럭스를 분석하도록 최적화되었습니다. 이러한 염료를 발리노마이신과 짝을 이루어 미토파지를 유도함으로써, 이 프로토콜은 일차 마우스 β-세포에서 미토파지 플럭스를 선택적으로 측정하기 위한 염료 기반 방법을 개략적으로 설명한다18. 이 MtPhagy 방법을 사용하여 표시된 데이터의 경우, 대사 스트레스가 미토파지 플럭스에 미치는 영향을 평가하기 위해 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD, 60kcal% 지방)을 먹인 쥐에서 분리된 섬에서 기저 및 발리노마이신 유도 미토파지를 모두 분석했습니다. 관심 집단을 식별하기 위해 처리되지 않은 RFD 섬을 사용하여 세포를 게이트했습니다. FSC 및 SSC 전압은 먼저 .......
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토론
이 프로토콜은 해리된 1차 마우스 섬에서 미토파지 플럭스를 정량화하기 위한 두 가지 보완적인 방법을 설명했습니다. mt-Keima 방법을 사용하여 미토파지의 증가는 산성(561nm)/중성(405nm) 세포의 증가된 비율로 정량화된 반면, MtPhagy 방법에서는 증가된 미토파지 플럭스가 FluozinhighMtPhagy높은TMRE낮은 세포 집단의 증가로 정량화되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 미토파지 플럭스에 대한 신속하고 정량적이며 세포 β 특이적 평가가 가능합니다.
두 방법 모두 간단한 접근 방식입니다. 그러나 이 프로토콜의 특정 단계는 품질과 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 이러한 단계에는 (1) 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 적절한 섬 해리, 그러나 섬 생존력을 보장할 수 있을 만큼 충분히 경미한 분리, (2) 관심 집단을 올바르게 식별하기 위한 게이팅의 신중한 설정, (3) 미토파지 플럭스의 편향.......
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공개 사항
SAS는 Ono Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 보조금을 받았으며 Novo Nordisk의 컨설턴트입니다.
감사의 글
E.L-D. NIH(T32-AI007413 및 T32-AG000114)의 지원을 인정합니다. SAS는 JDRF(COE-2019-861), NIH(R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), 재향군인회(I01 BX004444), Brehm 가족 및 Anthony 가족의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항생제-항진균제 | 생명 기술 | 15240-062 | |
| Attune NxT 유세포 분석기 | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치 | 317275 | |
| 지방산 무료 열 충격 BSA 분말 | Equitech | BAH66 | |
| 소 태아 혈청 | Gemini Bio | 900-108 | |
| 플루오진-3AM | 써모피셔 사이언티픽 | F24195 | 100 &뮤; g Fluozin-3AM 분말은 51 &mu에서 재구성되었습니다. L DMSO 및 51 μ L Pluronic F-127은 1mM 재고에 도달합니다. |
| 기코 RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy 염료 | Dojindo | MT02-10 | 5 μ g MtPhagy 분말은 50 &mu로 재구성되었습니다. L DMSO는 100 &mu에 도달합니다. M 재고. |
| MtPhagy 염료 | Dojindo | MT02-10 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x ddH2O 인산염 완충 식염수에 1:10을 희석하여 프로코톨에 사용되는 용액 |
| , 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x ddH2O 피루브산 나트륨(100x)에 1:10을 희석하여 프로코톨에 사용되는 용액 |
| 기술 | 11360-070 | 5 μ g MtPhagy 분말은 50 &mu로 재구성되었습니다. L DMSO는 100 &mu에 도달합니다. M 재고. | |
| TMRE [테트라메틸로다민, 에틸 에스테르, 과염소산염] | Anaspec | AS-88061 | TMRE 분말은 100 &mu에 도달하기 위해 DMSO에서 재구성되었습니다. M 재고. |
| 트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드 | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin 분말이 DMSO에서 재조정되어 250nM 스톡에 도달합니다. |
참고문헌
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility ge....
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재인쇄 및 허가
