여기서는 사내 세포외 소포체 조직 인자 활성 분석에 대해 설명합니다. 활성 기반 분석 및 항원 기반 분석은 인간 혈장 샘플에서 세포외 소포체의 조직 인자를 측정하는 데 사용되었습니다. 활성 기반 분석은 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높습니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직 인자(TF)는 인자 (F) VII 및 FVIIa에 대한 막관통 수용체입니다. TF/FVIIa 복합체는 FIX와 FX를 모두 활성화하여 응고 캐스케이드를 시작합니다. TF는 세포외 소포체(EV)의 형태로 세포에서 순환계로 방출됩니다. TF 양성(+) EV의 수준은 암, 박테리아 및 바이러스 감염, 간경변을 포함한 다양한 질병에서 증가하며 혈전증, 파종성 혈관 내 응고, 질병 중증도 및 사망률과 관련이 있습니다. 혈장에서 TF+ EV를 측정하는 방법에는 항원 기반 분석과 활성 기반 분석의 두 가지가 있습니다. 데이터에 따르면 활성 기반 분석은 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높습니다. 이 백서는 2단계 FXa 생성 분석을 기반으로 하는 당사의 사내 EVTF 활성 분석에 대해 설명합니다. FVIIa, FX 및 칼슘을 TF+ EV 함유 샘플에 첨가하여 항 TF 항체의 존재 유무에 따라 FXa를 생성하여 TF 의존성 FXa 생성과 TF 독립적 FXa 생성을 구별합니다. FXa에 의해 절단된 발색 기질은 FXa 수준을 결정하는 데 사용되며, TF 농도를 측정하기 위해 relipidated recombinant TF로 생성된 표준 곡선이 사용됩니다. 이 자체 EVTF 활성 분석은 상용 TF 활성 분석보다 민감도와 특이도가 높습니다.
서론
혈액 응고는 인자 (F) VII/VIIa와 조직 인자(TF)1의 결합으로 시작됩니다. TF/FVIIa 복합체는 FIX와 FX를 모두 활성화하여 혈액 응고를 활성화한다1. 전체 길이, 멤브레인 결합 TF에는 암호화와 활성의 두 가지 형태가 있습니다. 또한, 대안적으로 접합된 형태의 TF(asTF)가 있습니다. 세포막의 바깥쪽 엽단에 있는 스핑고미엘린과 포스파티딜콜린은 TF를 암호화된 상태로 유지합니다 2,3,4. 세포가 활성화되거나 손상되면 인지질 스크램블라제는 포스파티딜세린 및 기타 음전하를 띤 인지질을 바깥쪽 전단으로 전달합니다1. 세포의 활성화는 또한 산성 스핑고미엘라아제를 외부 전단지로 전위시켜 스핑고미엘린을 세라마이드로 분해합니다5. 이 두 메커니즘은 암호화된 TF를 활성 형식으로 변환합니다. 또한 단백질 이황화 이소머라제가 암호화된 TF에서 Cys186과 Cys209 사이의 이황화 결합 형성을 매개하여 TF....
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프로토콜
이 연구는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐(University of North Carolina at Chapel Hill)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호: 14-2108).
1. 헌혈자의 혈액 채취
- 깨끗한 정맥 천자를 사용하여 21G 바늘로 전방 정맥에 전혈을 채취합니다. 혈액의 처음 3mL는 혈관 주위 세포의 TF를 포함할 수 있으므로 폐기하십시오.
- 2.7 또는 1.8mL(튜브 크기에 따라 다름)의 혈액을 3.2% 구연산나트륨(0.109mol/L)이 포함된 바큐테이너에 넣습니다. 튜브를 과도하게 채우거나 부족하게 채우지 마십시오. 채혈 직후 튜브를 부드럽게 뒤집어 시트르산나트륨을 분산시킵니다.
- 가공 전에 튜브를 운반하는 경우 교반을 피하십시오. 채혈 후 2시간 이내에 혈장을 준비합니다.
2. 네거티브 대조군 혈장의 제조
알림: samples는 최종 동결 전에 얼음 위에 놓아서는 안 됩니다.
- 건강한 지원자의 전혈을 사용하여 음성 대조 ....
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결과
성공적인 결과는 ≥0.5pg/mL의 양성 대조군과 <0.5pg/mL의 음성 대조군을 제공합니다. 양성 대조군을 위해 >1.0pg/mL EVTF 활성을 가진 높은 LPS 반응기를 찾는 것이 가장 좋습니다. 대표적인 결과는 LPS 활성화 유무에 관계없이 건강한 기증자 11명의 전혈에서 혈장에서 분리한 EV의 EVTF 활성을 보여줍니다(그림 4). 11명의 기증자 중 6명(기증자 2, 4, 5, 8, 10, 11명)은 중등도에서 높은 LPS 반응자였고, 11명의 기증자 중 5명(기증자 1, 3, 6, 7, 9)은 낮은 LPS 반응자였다.
그림 1
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토론
여기에서는 자체 EVTF 활성 분석의 프로토콜이 제시됩니다. 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. EV 펠릿을 재구성할 때, EV 펠릿이 보이지 않더라도 EV 펠릿의 위치에서 위아래로 피펫팅하는 것이 중요합니다. EV 펠릿의 불완전한 재구성은 샘플의 EVTF 활성 값의 위음성 또는 과소 평가를 초래합니다. 둘째, 칼슘 없이는 FXa 생성이 불가능하기 때문에 프로토콜 단계 6.5에서 HBSA-Ca(+)를 사용하는 것이 중요합니다. 셋째, EDTA-테트라소듐을 사용하지만 EDTA-디소듐을 사용하지 않고 FXa 생성을 막는 것은 FXa가 발색 기질을 절단하는 능력을 억제하기 때문에 매우 중요합니다.
각 시약에 대해 다음과 같은 보관 및 사용 방법을 권장합니다. 분석 완충액과 재구성 된 기질을 4 °C에 보관하고 다 떨어질 때까지 반복적으로 사용합니다. 2-3주 이내에 기판이 떨어지지 않으면 노랗게 변하기 때문에 버립니다. 재조합 TF, 항체, FVIIa 및 FX는 -80°C에.......
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공개 사항
공개할 상충되는 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH NHLBI R35HL155657(N.M.)과 John C. Parker 교수직(N.M.)의 지원을 받았습니다. 도움이 되는 의견을 주신 Ms. Sierra J. Archibald에게 감사드립니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20,000 x g 원심분리기용 1.5mL 튜브 | 모든 회사 | N/A | Fisher Scientific(카탈로그 번호: 05-408-129)의 튜브를 사용합니다. |
| 1.5 mL 튜브, 초원심분리기, | 모든 회사 | N/A | 우리는 Beckman Coulter의 것을 사용합니다 (카탈로그 번호: 357448) |
| 15 mL 튜브 | , 모든 회사 | N/A | 우리는 VWR (카탈로그 번호: 89039-666)의 것을 사용합니다 |
| . BD Vacutainer Safety-Lok 혈액 수집 세트 12 인치. 튜빙 및 루어 어댑터 | BD | 367281 | |
| 96 웰 플레이트 | 모든 회사 | N / A | 우리는 Globe Scientific (카탈로그 번호 : 120338)의 것을 사용합니다. |
| BD Vacutainer 구연산염 튜브 | BD | 363083 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | A9418 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| 1.5 mL 튜브 용 원심 분리기 | 모든 회사 | N / A | 우리는 Centrifuge 5417R (Eppendorf)을 사용합니다. |
| 15 mL 튜브용 원심분리기 | 모든 회사 | N/A | Centrifuge 5810R (Eppendorf)을 사용합니다. |
| D-(+)-포도 | 시그마 Aldrich | G7021 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 이수화물 | 시그마 Aldrich | E6511 | |
| Hepes | 시그마 Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | 효소 연구소 | HFVIIa | 용액은 HBSA-Ca(+)로 희석해야 합니다. |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | 용액은 HBSA-Ca(+)로 희석해야 합니다. |
| 억제성 마우스 항-인간 조직 인자 IgG, 클론 HTF-1 | 피셔 사이언티픽 | 550252 | |
| 대장균 O111:B4 | 시그마 알드리치 | L2630 | 다양한 E. coli. 리포다당류마다 단핵구를 활성화할 수 있는 잠재력이 다릅니다. |
| 마우스 IgG | 시그마 알드리치 | I5381 | |
| 페파크롬 FXa 8595 | 효소 연구소 | 085-27 | |
| 플레이트 리더 | 어떤 회사 없음 | 10873566 | |
| Sodium chloride의 | Fisher Scientific | S271-500 | |
| 초원심분리기 | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| 초원심분리기 로터 | Beckman Coulter | TLA-55 |
참고문헌
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.
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