이 프로토콜은 압력-부피 전도도 기법을 사용하여 좌심실 압력 및 부피를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 약물이 심장에 미치는 영향을 지속적으로 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
심장 기능 감소는 다른 장기에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 좌심실 압력-부피 관계는 심장 기능을 평가하는 유효한 방법으로 간주됩니다. 심장 기능의 실시간 모니터링은 약물 평가에 중요합니다. 가슴이 닫힌 상태에서 압력-부피 카테터의 중요한 구성 요소인 소형 변환기는 오른쪽 경동맥을 통해 쥐의 좌심실로 들어갑니다. 이 장치는 실험 중 심장 기능의 변화를 압력-부피 루프의 형태로 시각화합니다. 심실의 실제 부피는 쥐의 좌측 경정맥에 20% 염화나트륨 용액 50μL를 주입하여 혈액의 전도도를 변경하여 계산됩니다. 쥐의 심실강의 실제 부피는 압력-부피 전도도 카테터를 사용하여 알려진 부피의 혈액 전도도를 측정하여 계산됩니다. 이 프로토콜은 약물이 심장에 미치는 영향을 지속적으로 관찰할 수 있도록 하고 심혈관 질환에서 특수 민족 약물 사용에 대한 이론적 근거를 촉진할 것입니다.
서론
심혈관 질환은 세계에서 사망률이 가장 높다1. 그 원인으로는 관상동맥 협착증(심근 허혈), 관상동맥 폐색(심근경색), 허혈 재관류 손상등이 있다 2. 심장은 수축기 및 이완기 주기가 일정하기 때문에 신체에서 가장 에너지를 많이 요구하는 부분 중 하나입니다. 따라서 관상동맥이 충분한 에너지와 산소를 유지하는 데 어려움을 겪으면 필연적으로 심장 기능이 저하되어 다른 장기에 부정적인 영향을 미친다 3,4. 심장은 순환계의 발전소이며 심장 기능은 합리적으로 평가해야 합니다.
심실압과 부피 관계에 의한 심장 기능 평가는 종합적인 방법으로 간주된다5. 전체 심장 주기 동안 심실 압력과 부피의 실시간 변화는 압력-부피 루프를 구성합니다. 심실 압력-부피 루프를 통해 심실의 다양한 단계와 에너지 측면에서 심장 기능 및 예비 용량을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 정상 심실은 수축기 말단 부피가 작으며 박동 작용과 효율이 5,6,7입니다.
압력-부피 전도 카테터 기술은 좌심실의 상태를 감지하기 위한 침습적 방법입니다. 연속 실시간 압력-체적 루프(8)를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 압력 체적 전도도 카테터는 강력한 도구이며, 식염수 교정 중 심근 평행 전도도의 in vivo 분석 및 큐벳 교정에서 혈액 전도도의 in vitro 측정을 포함하여 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 위해서는 건전한 처리 절차가 필수적입니다3.
페놀산의 일종인 페룰산(Ferulic acid, FA)은 아베나 사티바(Avena sativa)와 리구스티쿰 추안시옹 호르트(Ligusticum chuanxiong hort 9,10)와 같은 식물계에 널리 분포되어 있습니다. 페룰산은 혈압과 부정맥을 낮추는 약리학적 효과가 있습니다. FA는 여러 기능을 가진 생체 활성 천연 제품입니다. FA는 산화 손상에 저항하고, 염증 반응을 줄이고, 혈소판 응집을 억제하고, 관상 동맥 심장 질환 및 죽상 동맥 경화증을 예방할 수 있다11. 그러나 페룰산에 대한 대부분의 연구는 심장의 한 측면에 초점을 맞추고 있으며, 순환계에서 페룰산의 효과가 평가된 경우는 드물다(12,13,14,15). 여기서는 경정맥 주사 중 페룰산 용액에 대한 심장 반응에 중점을 두고 케타민(50mg/kg)과 결합된 이소플루란 마취에 대한 폐쇄형 흉부 접근법을 설명합니다.
용액 준비, 변환기 준비, 실험 전 쥐 준비, 오른쪽 경동맥에 카테터 삽입 및 데이터 분석을 포함하여 밀폐된 흉부 조건에서 도구를 사용하는 전체 절차를 설명합니다. 실험 기간은 일반적으로 4시간 미만이며 다양한 실험 프로토콜에 의해 결정됩니다. 한 번의 실험으로 좌심실 압력, 부피 및 심박수와 같은 자세한 심장 정보를 얻을 수 있습니다.
프로토콜
동물 프로토콜은 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Experimental Animal Welfare Ethics Committee(기록 번호 2023-04)에서 검토 및 승인되었습니다. 본 연구에는 수컷 Sprague Dawley (SD) 랫트 (280 ± 20g, 8-10 주령)가 사용되었습니다. 쥐들은 동물의 방에 갇혀 있었고 자유롭게 마시고 먹을 수 있었다.
1. 용액 준비
- 작업 영역을 적절하게 촉촉하게 유지하는 데 사용할 0.9% NaCl 용액을 준비합니다.
- 20% 고긴장성 NaCl 용액을 제조하려면 2g의 NaCl을 이중 증류수(ddH2O) 10mL에 녹입니다. 심근의 병렬 전도도를 결정하기 위해서는 뇌실 내 액체의 전도도를 변경할 필요가 있습니다.
- 1% 효소 활성 분말 세제 용액을 준비합니다. 실험이 완료되면 이것을 사용하여 압력-부피 전기 카테터를 용액에 1-2시간 동안 담그십시오.
- 10mg의 페룰산을 20mL의ddH2O에 용해시켜 FA 용액을 제조합니다. 0.22μm 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다. 쥐에게 1mL/kg 페룰산 용액을 주입합니다.
2. 센서 준비
- 실험 시작 전에 약 30-60분 동안 37°C에서 0.9% NaCl 용액에 압력-부피 센서를 담그면 실험 데이터의 안정성이 용이해집니다.
- 실험 장치를 연결합니다. 압력-체적 루프를 측정하기 위한 시스템은 압력-체적 카테터, 두 개의 제어 장치, 기록 장치 및 컴퓨터 실행 소프트웨어로 구성됩니다. 소프트웨어의 압력-체적 루프 모듈은 참조 실험 절차를 제공합니다.
- 시작 버튼을 누르면 소프트웨어가 압력량 센서의 모니터링 데이터를 자동으로 기록합니다.
- Miro-Tip Pressure Volume(MPVS) 소프트웨어를 사용하여 압력과 전도도를 보정합니다.
3. 실험 전 쥐 준비
- 케타민(50mg/kg)과 펜타닐(0.25mg/kg)을 쥐에게 근육주사로 투여한다5.
- 쥐의 발가락을 꼬집어 반사 신경이 없는 마취 깊이를 확인합니다. 감정은 쥐의 생리적 상태에 영향을 미치며 통증은 심장 기능에 변화를 일으킨다16. 작은 동물성 면도기와 제모 크림을 사용하여 수술 부위의 털을 제거하십시오. 요오드포와 75% 알코올을 사용하여 피부를 닦아 무균 상태를 유지하십시오.
- 완전히 마취된 쥐를 등온 가열판에 고정시키고 뒷면이 가열판과 접촉하도록 합니다.
- 바셀린으로 코팅된 온도 프로브를 쥐의 직장에 삽입합니다. 가열판을 조정하여 쥐의 체온을 37°C ± 0.5로 유지합니다.
알림: 실험 중에는 기도가 막히지 않도록 해야 합니다.
4. 우측 경동맥에 카테터 삽입
- 쥐 목의 정중선 오른쪽에 있는 피부를 세로로 절개합니다. 4cm 정도 절개하고 근육과 결합 조직을 겸자로 분리합니다. 기관의 오른쪽에 위치한 경동맥이 보입니다. 쥐의 오른쪽 경동맥은 짙은 붉은색이고 맥박이 강하게 뛰며 흰색 미주 신경이 평행합니다.
- 겸자를 사용하여 경동맥을 다른 조직 및 신경과 분리합니다. 깨끗한 경동맥 아래에 3개의 5-0 수술 라인을 놓습니다. 멸균 0.9% 염화나트륨 용액을 수술 부위에 떨어뜨려 경동맥의 촉촉함을 유지합니다.
- 왼쪽 쇄골 위의 피부를 자르고 경정맥 주위의 조직을 벗겨냅니다. 그런 다음 왼쪽 경정맥 아래에 5-0 수술 실을 놓습니다.
- 동맥 클립을 사용하여 혈류를 근접하게 중단하고 마이크로 가위를 사용하여 혈관에서 혈류가 멈춘 부분을 자릅니다. 상처 단면에 소량의 혈액이 나타나는 것은 정상입니다. 혈액이 혈관에서 빠르고 간헐적으로 빠져나가는 경우 근위 수술 라인을 들어 올리고 동맥 클램프를 다시 적용합니다.
- 경동맥을 따라 단면에서 카테터를 좌심실 깊숙이 삽입합니다. 좌심실에 들어간 후 가장 낮은 수축기 혈압 값이 0mmHg에 가까운지 확인하십시오.
- 합리적인 압력-부피 관계를 얻으려면 심실의 압력-부피 카테터를 약간 조정하십시오. 과다출혈과 심장 박동으로 인한 카테터의 위치 변화를 방지하려면 수술 라인의 근위 말단을 결찰하십시오.
알림: 이 과정에서 쥐의 체온, 마취 수준, 압력 신호 및 전도도 신호는 안정적으로 유지되어야 합니다. 쥐의 호흡기는 열려 있어야 합니다.
5. 약물 주입 및 전도도 보정
- 심실실에서 압력량 카테터의 위치를 유지하고 데이터가 안정화된 후 수술 라인을 경정맥 원위부에 결찰하고 최대 1mL/kg의 페룰산 용액을 천천히 주입합니다. 5-10분 동안 관찰하십시오.
- 좌측 경정맥에서 20% NaCl 용액 50μL를 주입하여 심근에서 발생하는 평행 전도도를 제거합니다. 병렬 컨덕턴스의 체적 범위는 대략 130-280 μL5이었다. 이것을 2분 간격으로 3회 반복합니다.
- 쥐의 심실 압력 및 부피 검사 후 채혈 바늘을 사용하여 쥐의 복부 대동맥에서 혈액을 채취합니다. 채취한 혈액을 나트륨 헤파린 채취 튜브에 넣고 위아래로 2번 뒤집어 혈액 응고를 방지합니다. 왼쪽 경정맥을 통해 120mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 주입하여 실험용 쥐를 안락사시킵니다.
- 쥐 부피 보정 튜브를 사용하여 측정된 전도도를 실제 혈액량으로 변환합니다. 나트륨 헤파린과 혼합된 혈액을 교정 튜브의 오리피스에 순차적으로 넣으면 카테터가 다른 오리피스에서 혈액의 전도도 값을 감지하여 압력-부피 모니터링 모듈에 기록합니다.
6. 데이터 분석
- 알려진 혈액량의 측정된 전도도 값을 지정된 위치에 추가함으로써 소프트웨어는 자동으로 곡선을 플로팅하고 혈액의 전도도를 추정합니다. 테스트 중인 쥐의 혈액 전도도를 추론하기 위해 최소 3세트의 혈액 전도도 값을 사용합니다. 혈액 전도도는 개별화되어 있습니다. 테스트 중인 각 쥐에 대해 이 절차를 개별적으로 수행합니다.
- 고긴장성 식염수 보정: 고긴장성 식염수를 세 번 주입하여 얻은 데이터를 지정된 위치에 추가하여 소프트웨어는 병렬 전도도 평균을 계산하고 실험 데이터를 자동으로 보정합니다.
- 안정적인 혈압과 전도도 값을 가진 부위를 활용하여 쥐의 좌심실 기능을 분석합니다.
- 분석을 클릭하면 소프트웨어가 선택한 영역을 기반으로 EF(좌심실 박출률), SW(뇌졸중 작업) 및 CO(심박출량) 등 다양한 매개변수를 자동으로 계산합니다.
결과
각 검사(n = 3)는 압력-부피 전도도 카테터가 좌심실에 들어가는 것을 전제로 했습니다. 카테터가 경동맥에서 좌심실로 들어갈 때 압력 범위의 현저한 증가와 같은 중요한 신호 변화가 있습니다(그림 1). 압력-부피 관계의 그래픽 분석은 Y축에 부피(μL)를 표시하고 X축에 압력(mmHg)을 표시하여 완료됩니다. 쥐의 좌심실 압력은 10-105 mmHg 이내였고, 부피의 전도도 값은 65-115 μL 이내였다.
전체 심장 주기는 시계 반대 방향의 압력-부피 루프에 의해 형성됩니다(그림 2). 심장 기능의 현저한 변화는 쥐에게 ferulic acid를 투여한 후 관찰되었습니다(그림 3). 쥐의 좌심실 압력은 0-85 mmHg 이내였고, 체적의 전도도 값은 30-100 μL 이내였다.
그림 4에서 볼 수 있듯이 쥐의 경정맥에 고긴장성 식염수를 주입했을 때 좌심실 압력-부피 루프에 변화가 발생합니다. 심실강 내의 압력 및 전도도 신호를 직접 측정하기 때문에 좌측 경정맥을 통해 고긴장성 식염수를 주입하면 전도도 값이 증가할 수 있습니다. 심근의 간섭은 전도도 값의 변화를 여러 번 측정하여 제거할 수 있습니다.
압력 체적 컨덕턴스는 큐벳 교정에 사용되었습니다(그림 5). 이것은 측정된 전도도 값을 체적 값으로 변환하기 위한 것입니다.
그림 1: 압력-부피 전도도 카테터에 의해 생성된 경동맥과 심실의 다양한 압력-부피 루프. (A) 동맥과 심실 사이에는 압력과 전도도에 상당한 차이가 있습니다. (B) 심실에 소형 센서를 삽입하면 압력-부피 루프를 형성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 압력-부피 루프. 압력-부피 루프에는 이완기, 등용적 수축, 수축기 및 등용적 이완의 4단계가 포함됩니다. 압력-부피 루프의 면적은 한 번의 심장 수축에 의해 생성된 작업을 나타냅니다. 이완기 말기 용적(EDV)에서 수축기 말기 용적(ESV)을 빼면 심실 박적량이 산출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 좌심실 기능은 페룰산 용액을 주입한 후 쥐에서 영향을 받습니다. (A) 좌심실 압력-부피 루프가 영향을 받고 있습니다. (B) 박출률(EF)은 심실의 이완기 말기 용적과 관련된 뇌졸중 용적의 백분율을 나타냅니다: 심장 박동 수에 따른 좌심실 박출률의 변화. (C) 좌심실 말단 수축기 용적은 심장 박동 수가 증가함에 따라 변합니다. (D) 좌심실 말단-이완기 압력-부피 관계 심박수 증가에 따른 시간 상수 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 20% NaCl 용액을 정맥에 주입한 후 쥐의 좌심실의 압력 및 전도도 변화. (A) 전도도가 변경된 분석된 데이터. (B) 압력 볼륨 링이 전도도 증가로 인해 오른쪽으로 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 압력-부피 전도도 카테터는 쥐의 혈액으로 채워진 알려진 부피의 큐벳의 전도도를 측정하는 데 사용됩니다. (A) 다른 부피의 전도도. (B) 압력-부피 전도도 카테터로 측정한 전도도의 양호한 상관관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
다양한 심장 기능 상태에 대해 합리적인 투여 전략을 채택하는 것이 중요합니다. 압력-체적 전도도 카테터 기법은 좌심실 기능을 연구하는 가장 직관적인 방법이다5. 이 방법을 사용하면 심장 기능에 대한 약물의 효과를 전체 관점에서 연구할 수 있습니다. 실험의 다양한 단계를 자세히 설명합니다. 이것은 심장 기능을 연구하기 위한 어느 정도의 시설을 제공할 것이다.
압력 부피 전도도 카테터 기술은 가장 포괄적이고 엄격한 방법입니다. 단일 실험에서 절대값(압력 및 부피) 및 상대값(EF)을 포함하여 최대 30개의 지표에 대한 정보를 얻을 수 있으며 약물 대사에 대한 일부 정보도 얻을 수 있습니다.
쥐의 체온은 전체 실험 절차 동안 37°C ± 0.5로 유지되었습니다5. 실험 중 쥐의 출혈을 최소화해야 한다5. 실험 중에 쥐의 혈액량을 기록해야 한다17.
압력-체적 전도 카테터 기술은 심실의 상태를 실시간으로 감지할 수 있다18. 이 기술은 단일 약물 또는 약물 조합이 심장에 미치는 영향을 연구하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 전도도 카테터는 좌심실의 압력과 전도도를 직접 측정합니다. 이것은 테스트 중인 쥐의 체온 및 마취 정도와 밀접한 관련이 있습니다. 이 실험에서 페룰산 용액을 주입한 후 좌심실 기능의 변화는 수축기 말압 및 수축기 말기 용적의 감소를 포함하여 압력-부피 루프에 의해 명확하게 입증되었습니다(그림 2A). 쥐의 좌심실 박출률은 89.87%의 피크 값으로 유의하게 증가하였다(그림 2B). 쥐에서 좌심실의 수축기 말기 압력은 55.44μL의 최소값으로 현저히 감소되었습니다. 이는 이전에 보고된 바와 같이 혈압을 낮추는 페룰산의 약리학적 효과와 일치한다11.
식품 및 약용 식물에서 발견되는 특정 천연 화합물은 건강 유지에 기여할 수 있습니다. 페룰산은 다양한 중국 전통 의학의 중요한 활성 성분인 Ligusticum chuanxiong 및 Angelica sinensis19를 포함하여 식물에 널리 존재하는 페놀 화합물입니다. 현재 연구에 따르면 페룰산은 항염증, 항섬유화 및 항세포사멸 효과를 포함한 여러 생물학적 활성을 가지고 있습니다11. 음식에서 쉽게 구할 수 있는 이 천연 제품이 순환계의 심장 기능에 미치는 영향을 연구할 필요가 있지만, 연구에 따르면 심장 형태학적 구조에 긍정적인 영향을 미친다고 합니다12,20.
압력-부피 카테터를 실험동물의 심실에 배치하여 심실 압력과 전도도를 직접 얻을 수 있습니다. 식염수 교정 및 큐벳 교정은 실제 심실 부피를 얻기 위해 사용됩니다. 이 실험을 통해 심실 기능의 변화를 시각적으로 반영하는 연속적인 압력-부피 루프를 얻을 수 있습니다. 압박량 카테터로 심실실에 접근하는 방법에는 가슴이 열린 상태와 닫힌 가슴이 있는 상태의 두 가지가 있습니다. 열린 흉부 상태에서는 심실강에서 압력량 카테터의 위치를 제어하는 것이 더 쉽습니다. 가슴이 닫힌 상태에서 심실 기능을 측정하는 것은 동물의 호흡 보조가 필요하지 않으며 동물에게 덜 손상되며 성공률이 높습니다. 또한 압력 체적 루프는 압력 체적 카테터가 심실강에 있는지 여부를 결정하기 위해 폐쇄 흉부 조건에서 관찰됩니다. 이 카테터가 심근에 의해 압축되면 압력량 루프가 비정상적인 피크를 표시합니다.
심장은 몸 전체에 혈액을 공급하는 중요한 기관입니다. 심장 기능 평가에 대한 보다 합리적인 접근이 필요한데, 여기에는 심장 자체의 상태뿐만 아니라 부하 전과 후가 포함된다21. 압력-부피 루프는 전체 심장 주기에 걸쳐 중심 심실 챔버 압력 및 부피의 변화를 실시간으로 설명하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 소형 센서로 좌심실 기능을 측정하는 완전한 방법을 설명합니다. 실험 프로토콜에서 마이크로 센서 모델을 변경하면 돼지, 생쥐 등과 같은 다른 동물의 심장 기능을 측정 할 수 있습니다 4,8,22. 압력-부피 전도도 카테터를 사용하면 약물이 좌심실 압력 및 부피에 미치는 영향과 실험 대상의 순환계에 대한 전반적인 영향을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 약물이 심장에 미칠 수 있는 부정적인 영향을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
공개 사항
저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 쓰촨성 주요 R&D 프로젝트(2022YFS043)와 청두 중의약대학 청년재단 발전 인재 특별 프로젝트(QJJJ2022029)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 주사기 | Sartorius AG, 독일 | - | |
| 동물 온도 유지자 | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Dual Bio Amp | Millar, Inc., USA | DA-100 | |
| 효소-활성 분말 세제 | Alconox Inc., USA | 1104 | |
| Ferulic acid | Macklin Biochemical Co., Ltd, Shanghai, China | F900027 | |
| Mikro-Tip 카테터 트랜스듀서, SPR-838NR | Millar, Inc., 미국 | SPR-838NR | |
| Millar Miro-Tip 압력량(MPVS) Ultra | Millar, Inc., 미국 | SPR-869 | |
| 애완 동물 전기 가위 | Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd. | - | |
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., USA | PL3508 | |
| 염화나트륨, NaCl | Kelong 화학 시약, 청두, 중국 | KX829463 | |
| Veet 제모 크림 | Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd. |
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