자연 조건에서의 콜로라도 감자 딱정벌레 동면에 대한 실험적 연구

콜로라도 감자 딱정벌레 Leptinotarsa decemlineata Say (CPB)는 Solanaceae 식물의 중요한 해충으로, 주로 감자 Solanum tuberosum L입니다. 이 종의 지리적 범위는 1,600만^km2 이상이며 지속적으로 확장되고^있다.1. CPB는 겨울철 휴지기가 있으며 온대 지역에서는 동면이 필수입니다. 일시정지는 짧은 날의 광주기에 의해 유도되고 온도¹에 의해 조절됩니다. 이 딱정벌레는 성충 단계에서 토양에 굴을 파고 겨울을 납니다. 위도가 증가함에 따라 최대 절전 기간이 길어집니다. 온대 지역, 특히 그 범위의 북부 영토에서 월동은 8 월 -9 월부터 5 월 -6 월까지 최대 9 개월 동안 지속됩니다 (Noskov et al., personal observations). 이 기간 동안 CPB는 온대 지역의 다른 곤충과 마찬가지로 불리한 겨울 조건에 노출되어 추위에 대한 내성을 높여야 합니다. 동시에 딱정벌레가 토양과 접촉하면 다양한 기회 및 병원성 미생물에 의한 감염 위험이 증가합니다². 따라서 이 딱정벌레는 겨울잠을 자는 동안 일정 수준의 면역 체계 활동을 유지해야 하며, 이는 또한 에너지 비용이 많이 듭니다. 그럼에도 불구하고, 곤충이 감염에서 살아남는다 하더라도, 이 질병은 내한성을 감소시킬 수 있다³. 낮은 온도가 CPB의 겨울 사망률의 유일한 이유는 아니라는 점에 유의해야 합니다. 산소 부족도 중요한 역할을 하며, 일부 조건에서는 겨울철 사망률의 주요 요인이 될 수 있다 ^4,5.

CPB의 겨울철 자연 사망률은 매우 높을 수 있으며, 점토양토 토양에서 100%에 도달할 수 있는 것으로 알려져 있다⁶. 따라서 월동은 CPB 수명 주기에서 가장 중요한 기간 중 하나입니다. 그럼에도 불구하고 자연 조건에서 CPB 동면의 생리학, 면역 체계 활동, 생존 및 기타 매개변수에 대한 데이터는 여전히 제한적입니다. CPB 성인의 일시적 휴지기 및 냉기 쇼크에 대한 반응으로 유전자 발현 및 다양한 생리학적 매개변수에 대한 연구가^있습니다 7,8,9,10,11,12; 그러나 이러한 분석은 주로 온도, 습도 및 토착 병원균 부하의 자연적인 변동 없이 실험실 조건에서 일시정지 또는 저온 스트레스를 유도하여 수행되었습니다. 그럼에도 불구하고 자연 조건에서 토양에서 굴착하여 수집 한이 딱정벌레의 생리학에 대한 연구는 중요합니다. 1970년대-1980년대에 자연 조건 하에서 월동하는 CPB의 다양한 측면이 활발히 연구되었다 13,14,15,16,17,18. 반면에, 이 연구들은 겨울철에 토양에서 CPB를 굴착하는 것을 포함하지 않았다. 또한, CPB의 제어된 동면을 위한 기술 및 케이지에 대한 설명은 상세히 제공되지 않는다. 따라서 자연 환경에서 월동하는 CPB의 생리학에 대한 연구가 필요하다¹⁹.

이 연구의 목적은 자연 조건에서 CPB 성인의 통제된 동면 방법을 개발하고 테스트하는 것이었습니다. 제안된 방법은 대륙성 기후의 현장 조건 하에서 동면 중에 미생물학적, 면역학적 및 기타 분석을 위해 원하는 수의 CPB 개체를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 눈 아래 토양에서 월동하는 다른 곤충 종에 적용하고 적용 할 수 있습니다.

1. 동면을 위한 감금소의 묘사

참고: 실험의 목적에 따라 케이지 수가 달라집니다. 샘플링 날짜당 최소 3개의 케이지를 사용하십시오. 출현 할 딱정벌레의 수를 추정하려면 봄까지 토양에서 꺼내지 않을 최소 3 개의 추가 케이지를 준비하십시오.

1. 크기가 25 × 25 × 40cm(L × W × H)인 단단한 나무 프레임으로 만든 케이지를 사용하십시오.
2. 케이지 프레임을 만들려면 두께가 2cm, 너비가 4cm 이상인 나무 칸막이를 사용하십시오.
3. 개구부 크기가 5mm에서 3mm 이하인 스테인리스 스틸 메쉬로 케이지 내부를 덮×. 나무 스테이플러를 사용하여 메쉬를 고정하십시오.
4. 스테이플러로 스테인리스 스틸 메쉬를 바닥 바깥쪽에 고정합니다.
5. 케이지 내부에 밀도가 60g/^m2인 검은색 합성 지오텍스타일을 깔아줍니다.
   알림: 지오텍스타일은 딱정벌레의 탈출을 방지하는 추가 장벽 역할을 합니다. 활발하게 움직이는 곤충병원균 및 기생충과 관련된 실험에는 사용하지 마십시오.
6. 약 60cm 높이의 합성 반투명 통기성 천 튜브를 케이지 상단에 단단히 부착합니다.
7. 두 개의 강한 로프를 케이지 바닥에 교차시키고 고정하여 필요할 때 토양에서 빼냅니다.

2. 감금소의 임명

1. 흙에 40cm 깊이의 구멍을 파고 그 안에 케이지를 놓습니다.
2. 구멍에 마른 풀이나 건초를 놓습니다.
3. 건초나 마른 풀이 케이지의 벽과 토양 사이에 있도록 케이지를 내부에 놓습니다.
4. 곤충이 모이는 감자밭의 흙으로 새장을 채웁니다.
5. 방수 온도 및 습도 데이터 로거를 필요한 깊이의 케이지에 설치합니다.
   알림: 모든 제조업체의 데이터 로거를 사용할 수 있으며 저온에서 작동할 수 있어야 합니다.
6. 딱정벌레가 도입되기 3-4주 전에 각 케이지 안에 감자 묘목을 심고 적당히 물을 줍니다.
7. 케이지 외부에 설치된 재료 막대에 합성 섬유 튜브를 수직으로 고정합니다.

3. 월동 전 곤충 사육

1. 감자 식물의 끝자락에 있는 무농약 감자 밭에서 성인 딱정벌레를 수동으로 수집합니다.
   알림: 성충 딱정벌레는 유충과 상당히 다르며 줄무늬 딱지날개가 특징인 반면 유충은 빨간색입니다.
2. 채집한 딱정벌레를 새장에 넣기 전에 곤충에게 먹이를 줄 감자 꼭지가 들어 있는 15-20L 플라스틱 양동이(양동이당 최대 200마리)에 보관하십시오.
3. 통기성이 좋은 천으로 양동이를 덮으십시오.
   알림: 곤충을 양동이에 12시간 이상 보관하지 마십시오. 양동이 바닥에 딱정벌레가 쌓이는 것을 방지하기 위해 충분히 큰 감자 꼭지를 사용하십시오.
4. 합성 섬유 메쉬로 덮인 감자 식물에 200마리 이상의 CPB 개체를 놓지 마십시오.
5. 감자 꼭지를 다 먹었을 때 물이 담긴 플라스틱 병에 담긴 신선한 감자 꼭지를 넣고 그 후에 매일 감자 꼭지를 교체하십시오.
   알림: 항아리에 줄기를 고정하려면 면봉과 파라필름을 사용하십시오. 딱정벌레를 제거할 때 오래된 줄기를 주의 깊게 확인하십시오.
6. 모든 딱정벌레가 겨울을 나기 위해 토양에 굴을 파고 나면 막대기에서 합성 섬유 튜브를 풀고 천을 눕힙니다.

4. 겨울철 곤충 채집

1. 케이지 표면 위의 눈을 제거하십시오.
2. 강한 삽으로 양쪽의 케이지를 풉니다.
3. 로프를 사용하여 케이지를 흙에서 빼냅니다.
4. 케이지를 실험실로 가져옵니다.
   참고: 실험의 목적에 따라 동면 딱정벌레는 분석 전에 비활성화해야 할 수도 있습니다. 이 경우 딱정벌레를 토양에서 격리하는 동안 실험실의 온도는 ~ 2-5 °C 여야합니다.
5. 상자에서 흙을 조금씩 제거하고 큰 흙 조각을 조심스럽게 부수고 핀셋을 사용하여 딱정벌레를 분리하십시오.
6. 살아있는 딱정벌레와 시체를 분리하십시오. 살아있는 건강한 딱정벌레는 주변에 조밀한 토양을 만들어 공기 구멍(소위 요람)을 형성하므로 토양에서 쉽게 분리됩니다. 곰팡이에 의해 죽은 딱정벌레는 미라가 되거나 표면에 눈에 띄는 균사체가 있습니다. 세균으로 분해되는 곤충은 어둡습니다.
7. 체로 토양을 체로 쳐서 모든 딱정벌레가 격리되고 손상되지 않았는지 확인하십시오.
8. 진균 감염 또는 박테리아 분해 증상이 있는 시체를 개별 멸균 15mL 원심분리 튜브에 넣어 향후 식별을 위해 보관합니다.
9. 살아있는 딱정벌레는 0-2 °C의 온도에서 0-2 °C의 냉장고에 보관하여 축축한 면봉이 들어 있는 밀폐된 환기 용기에 분석할 때까지 보관합니다.

5. 장기 및 조직 샘플의 준비

1. 혈림프를 채취하려면 인슐린 바늘을 사용하여 딱지날개 아래 복부 측면에 구멍을 뚫습니다.
   알림: 월동 중에는 혈림프의 양이 현저히 감소하여 이 액체를 수집하기가 어렵습니다.
2. 장을 분리하려면 헤드 캡슐을 잘라내고 인산염 완충액이 있는 페트리 접시에 모든 내용물을 짜내고 장을 분리하고 지방과 말피기 혈관을 정화합니다.
3. 앞창자, 중창자, 뒷창자와 같은 장의 원하는 부분을 분리합니다.
4. 지방체를 분리하려면 장을 분리한 후 다른 조직과 분리하십시오.
   참고: 분리된 조직은 항산화 및 해독 효소의 활성 측정(예: 보충 그림 1), 면역 신호 전달 경로 유전자의 조절 분석(예: 보충 그림 2) 또는 곤충 장 내용물의 메타바코딩 등에 사용할 수 있습니다.

6. 시체에서 미생물의 분리

1. 시체에서 곤충병원성 곰팡이를 분리하려면 미라가 된 곤충을 멸균 습도 챔버에 넣습니다.
2. 0.4% 젖산이 있는 Sabouraud 포도당 한천에 도금하기 위해 딱정벌레의 내부 내용물에서 공중 분생포자(사용 가능한 경우) 또는 경화증을 사용하십시오.
   알림: 균사체와 분생포자가 있는 딱정벌레를 즉시 도금하십시오(습도 챔버에 두지 않고).
3. 박테리아 분해 증상이 있는 시체에서 박테리아를 분리합니다.
4. 딱정벌레의 머리를 자르고 내부 내용물을 짜낸 다음 박테리아 배지(Luria-Bertani 한천, 엔도 한천 및 담즙 에스큘린 한천)에 대한 후속 플레이팅을 위해 튜브에 모읍니다.
   알림: 현미경 및 분자 방법을 사용하여 병원체의 속과 종을 식별합니다. 필요한 경우 다른 기생충의 존재에 대한 분석을 수행 할 수 있습니다.

월동 CPB에 대한 아래 결과는 토양 온도, 생존 및 감염을 보여줍니다.

토양 온도 역학.
11월 말부터 4월 초까지 30cm 깊이의 케이지에서 영하의 온도가 기록되었습니다(그림 1). 이 기간의 평균 기온은 영하 3.3°C± 0.1°C(평균 ± 표준 오차)였습니다. 최저 기온은 2월 중순의 영하 7.9°C였다.

월동 CPB의 생존.
곤충의 사망률은 겨울잠을 자는 동안 나타났으며 출현하기 전 봄에 최대치에 도달했습니다. 딱정벌레의 초기 수는 2000 마리였으며 그 중 1470 마리가 5 월 말까지 생존했습니다. 겨울잠을 자는 동안 딱정벌레의 생존율은 61%였다(그림 2).

월동 CPB의 감염.
죽은 딱정벌레 530마리를 분석한 결과, 동면 기간 동안 53%는 세균 분해 증상을 보였고, 25%는 곰팡이 감염 증상을 보였다(그림 3). Beauveria 는 곤충병원성 곰팡이의 고립된 배양 중에서 지배적(45개의 분리물)을 차지했습니다. 메타리지움(Metarhizium), 동충하초 (=Isaria), 레카니실리움(Lecanicillium )은 훨씬 덜 흔했다(각각 두 개의 분리물). 세균 분해 증상이 있는 사체로부터 분리한 세균(n=30) 중에서, 바실러스(Bacillus), 스핑고박테리움(Sphingobacterium), 페리바실러스(Peribacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 세라티아(Serratia), 라넬라(Rahnella ) 및 글루타미치박터(Glutamicibacter) 속에 속하는 종들이 확인되었다(보충표 1).

그림 1: 토양 온도 역학. 수심 30cm에 설치된 방수 온도 데이터 로거로 측정한 토양 온도 역학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 겨울잠을 자는 콜로라도 감자 딱정벌레의 생존 기간. 새장을 파내고 11월, 1월, 4월, 5월에 살아남은 딱정벌레와 죽은 딱정벌레를 세었습니다. 막대는 살아남은 딱정벌레의 수를 나타냅니다. 수염은 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 월동하는 콜로라도 감자 딱정벌레 사체의 감염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료: 아래 보충 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1. 동면 중 CPB의 중장에서 비특이적 에스테라아제의 활성. 수염은 표준 오차를 나타냅니다. 글자가 다르면 시점 간에 유의한 차이가 있음을 나타냅니다(Dunn의 검정, P < 0.05).

보충 그림 2: 동면 중 CPB의 장과 지방체에서 전사 인자 NFkB(IMD 경로)의 발현 변화. 데이터는 8월 시점을 기준으로 접기 변경으로 표시됩니다. Rp4, Rp18 및 Arf19를 참조 유전자로 사용하였다. 수염은 표준 오차를 나타냅니다.

보충 표 1: 동면 중 죽은 CPB에서 분리된 박테리아의 16S rRNA(~800bp) 유전자 서열의 추정 식별.

저자는 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.