여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing
이 논문에서
요약
초록
경동맥은 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 목의 주요 혈관이지만, 경동맥 협착증은 플라크로 경동맥이 막힐 때 발생합니다. 단세포 수준에서 경동맥의 세포 구성을 밝히는 것은 경동맥 죽상동맥경화증 치료에 필수적입니다. 그러나 경동맥에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 세포 손상을 줄이면서 단세포 수준에서 정상 경동맥을 해리하는 데 적합한 프로토콜을 얻기 위해 콜라겐분해효소/DNase와 트립신의 분해 과정을 통합하여 2단계 소화 방법을 설계했습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 특히, 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피세포(EC), 대식세포 및 수지상세포(Mφ/DC)를 포함한 정상 경동맥의 다양한 세포 유형이 동시에 검출되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 갖는 다른 조직으로부터의 혈관의 단세포 현탁액을 제조하기 위해 적용될 수 있다.
서론
죽상동맥경화증은 고혈압, 고지혈증, 혈류역학 등의 위험인자와 관련된 만성 염증성 질환이다1. 경동맥 분기는 혈역학적 변화가 일어나기 쉬우며 경동맥 플라크 형성을 유발합니다. 경동맥 죽상동맥경화증의 임상적 양상은 뇌졸중, 일과성 뇌허혈과 같은 급성일 수도 있고, 재발성 일과성 뇌허혈, 혈관성 치매와 같은 만성일 수도 있다2. 기계적으로 경동맥 플라크는 병리학적 조건에서 서로 다른 혈관 벽 세포와 다양한 혈액 세포 간의 상호 작용의 결과입니다. 따라서 생리학적 및 병리학적 조건에서 경동맥의 단세포 아틀라스를 밝히는 것은 경동맥 플라크 발생을 예방하고 치료하는 데 특히 중요합니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석은 초고분해능과 동일한 세포 유형의 유기체에서 세포 이질성을 검출하기 때문에 생물학 연구의 가장 강력한 기술중 하나입니다 3,4. 연구자들은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 심혈관 질환5 및 암6과 같은 많은 분야에서 연구를 수행했습니다. 그러나 조직을 단일....
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프로토콜
아래에 설명된 모든 동물 시술은 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 재료 준비
- 칼슘과 마그네슘이 없는 1x PBS와 2.5U/mL 헤파린 나트륨염을 사용하여 관류 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음에서 예식하십시오.
- 1250 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 3000 U/mL DNase I을 HBSS로 희석하여 125 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 60 U/mL DNase I을 포함하는 해리 시약 A를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 0.25% EDTA-free 트립신 1mL(페놀 레드 제외) 1mL를 1x PBS 1mL로 희석하여 최종 농도 0.12% 트립신을 포함하는 해리 시약 B를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 1x PBS에 10% FBS 1.5mL와 5% FBS 10mL를 준비합니다. 1.5% FBS를 사용하여 경동맥을 모으고 사용하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 5% FBS를 사용하여 소화를 중화하고 실온(RT)에서 보관하십시오.
- ....
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결과
이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 설명합니다(그림 1). 이 2단계 세포 분해 방법은 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 쥐 경동맥 혈관벽을 효과적으로 해리하여 단일 세포 염기서열 분석을 위한 고품질 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 해리 후, 세포 농도 및 세포 생존율은 자동화된 세포 카운터에 의해 계산되었습니다. 명시야는 소화 후 경동맥 혈관 세포의 형태를 보여주었고, AOPI 이중 형광 염색은 세포 생존율을 동시에 검출했습니다(그림 2A,B). 특히, 해리 시약 A를 단독으로 사용하는 것과 비교했을 때, 경동맥 조직은 해리 시약 B와 병용할 때 더 철저하게 해리될 수 있습니다. 또한 9개의 동맥에서 생존 가능한 세포 수를 발견했으며, 평균 세포 직경은 2단계 세포 분해 후 단일 세포 염기서열 분석의 요구 사항을 충족했습니다(
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토론
여기에서는 야생형 마우스의 경동맥에서 콜라겐분해효소/DNase 및 트립신의 소화 과정을 통합하는 2단계 소화 방법을 구축한 고품질 단세포 현탁액을 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 품질 검사 후, 우리는 그것이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족한다는 것을 발견했습니다. 또한 VSMC, 섬유아세포, EC 및 Mφ/DC를 포함한 경동맥의 다양한 세포 유형이 단일 세포 데이터 처리 후 성공적으로 검출되었습니다.
경동맥 단세포 현탁액을 준비하는 현재의 방법은 여전히 부족합니다. Depuydt et al.은 37°C에서 30분 동안 콜라겐분해효소, DNase, 인간 알부민 분획 V 및 플라보피리돌을 결합하여 인간 경동맥 플라크로부터 단세포 현탁액을 얻었다15. 형광 활성화 세포 분류 후 내피 세포, 평활근 세포, 비만 세포, B 세포, 골수성 세포 및 T 세포를.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 자연과학재단(82070450 to C.T.and 82170466 to L.Z.)과 중국 박사후 과학 재단(China Postdoctoral Science Foundation)의 펠로우십(7121102223 to F.L.)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% EDTA 무함유 트립신 | Beyotime | C0205 | 0.25% EDTA 무함유 트립신 1mL를 1x PBS 1mL로 희석합니다. |
| 0.9% NaCl 식염수 용액 | Beyotime | ST341 | 헤파린 나트륨 용액을 최종 농도인 10 mg/mL |
| 1 mL 주사기 | SKJYLEAN | sk-r009 | 심장 관류 |
| 1.5 mL 원심 분리 튜브 | KIRGEN | KG2211W | 조직 조각 및 세포 현탁 |
| 20 mL 주사기 | SKJYLEAN | sk-r013 | 심장 관류 |
| 40 µ m 세포 여과기 | JETBIOFIL | css010040 | 소화되지 않은 조직 단편 |
| AO/PI 키트 | Hengrui Biological | RE010212 | 세포의 살아 있는지 죽었는지 확인하기 위해 |
| 자동 세포 카운터 | Countstar | Mira FL | 소화된 경동맥 혈관 세포의 세포 형태 및 세포 생존력을 분석하기 위해 |
| Cell Ranger 소프트웨어 | 10× 유전체학 | 3.0.2 | 크롬 단일 세포 RNA seq 출력을 처리하고 클러스터링 및 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 |
| 크롬 단일 세포 3'시약 키트 v3 | 10× 유전체학 | 1000075 | 의 단일 세포 RNA-seq 라이브러리를 준비하기 위해 |
| HBSS로 최종 농도 125 CDU/mL | |||
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | HBSS로 최종 농도 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | 소화 반응 종료 |
| : Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | 방 온도에서 보관하십시오 |
| Heparin 나트륨 염 | Solarbio Life Science | H8060 | 0.9% NaCl로 최종 농도 10 mg/mL로 희석 |
| 마이크로 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | 조직과 세포 펠릿을 스핀다운하는 데 적용 |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| 인산염 완충 식염수 | Solarbio Life Science | P1000 | 심장 관류 및 세포 재부유에 사용 |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | scRNA 염기서열 분석 데이터의 차원 축소, 시각화 및 분석 수행 |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | NEST | 703002 | 혈관 조직 배치 |
| 수조 | Jinghong | DK-S22 | 소화 온도를 37°C로 유지하십시오. 씨 |
참고문헌
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019). ....
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재인쇄 및 허가
