방법 논문

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

DOI:

10.3791/65865

⸱

2023년 9월 15일

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.

초록

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시험관 내 고형암의 종양 미세환경을 재현하는 검증된 암 모델의 부족은 전임상 암 연구 및 치료제 개발에 있어 여전히 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 복잡한 인간 종양 미세환경을 현실적으로 모델링하는 미세생리학적 시스템인 혈관화 미세종양(vascularized microtumor, VMT) 또는 종양 칩(tumor chip)을 개발했습니다. VMT는 역동적이고 생리적인 유동 조건에서 여러 인간 세포 유형을 공동 배양하여 미세유체 플랫폼 내에서 새로운 세포를 형성합니다. 이 조직 공학적 미세 종양 구조는 생체 내에서 새로 형성된 혈관과 마찬가지로 성장하는 종양 덩어리를 지원하는 살아있는 관류 혈관 네트워크를 통합합니다. 중요한 것은 약물과 면역 세포가 종양에 도달하기 위해 내피층을 통과해야 하며, 치료 전달 및 효능에 대한 생체 내 생리학적 장벽을 모델링해야 한다는 것입니다. VMT 플랫폼은 광학적으로 투명하기 때문에 조직 내에서 형광 표지된 세포를 직접 시각화하여 면역 세포 유출 및 전이와 같은 동적 과정에 대한 고해상도 이미징을 달성할 수 있습니다. 또한 VMT는 생체 내 종양 이질성, 유전자 발현 시그니처 및 약물 반응을 유지합니다. 거의 모든 유형의 종양을 플랫폼에 적용할 수 있으며, 신선한 수술 조직의 일차 세포가 VMT에서 성장하고 약물 치료에 반응하여 진정한 맞춤형 의학을 향한 길을 열었습니다. 여기에서는 VMT를 확립하고 종양학 연구에 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 혁신적인 접근 방식은 종양 및 약물 반응 연구를 위한 새로운 가능성을 열어 연구자들에게 암 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

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암은 전 세계적으로 주요 건강 문제로 남아 있으며 미국에서는 두 번째로 큰 사망 원인입니다. 미국 국립보건통계센터(National Center for Health Statistics)는 2023년 한 해에만 미국에서 190만 건 이상의 새로운 암 사례와 60만 명 이상의 암 사망자가 발생할 것으로 예상하고있다 1 효과적인 치료 접근법의 시급한 필요성을 강조하고 있다. 그러나 현재 임상시험에 진입한 항암제 중 5.1%만이 FDA 승인을 받고 있다. 유망한 후보 물질이 임상시험을 성공적으로 진행하지 못하는 것은 전임상 약물 개발 과정에서 2D 및 스페로이드 배양과 같은 비생리학적 모델 시스템을 사용하기 때문일 수 있다2. 이러한 고전적 암 모델에는 치료 내성 및 질병 진행의 주요 결정 요인인 기질 틈새, 관련 면역 세포 및 관류된 혈관과 같은 종양 미세환경의 필수 구성 요소가 부족합니다. 따라서 전임상 결과의 임상 번역을 개선하기 위해 인간 생체 내 종양 미세환경을 더 잘 모방하는 새로운 모델 시스템이 필요합니다.

조직 공학 분야는 빠르게 발전하고 있으며, 실험실 환경에서 인간의 질병을 연구하기 위한 개선된 방법을 제공하고 있습니다. 한 가지 중....

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프로토콜

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1. 설계 및 제작

  1. 장치 설계
    1. 미세유체 장치 제조의 경우 Si-웨이퍼(RCA-1 세척 및 2% 불화수소(HF) 처리)에 스핀 코팅된 SU-8 2μm 층을 사용하여 SU-8 금형을 만든 다음 앞서 설명한 대로 단일 마스크 포토리소그래피 단계를 수행합니다 8,9.
    2. SU-8 금형에서 4mm 두께의 폴리디메틸실록산(PDMS) 복제본을 주조하여 다운스트림 제조 단계를 위한 내구성 있는 폴리우레탄 금형을 생성합니다. 다양한 설계 반복을 사용할 수 있습니다 8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. 현재 반복에서는 표준 96웰 플레....

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결과

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여기에 설명된 프로토콜에 따라 VMO 및 VMT는 상업적으로 구매한 EC, NHLF 및 VMT의 경우 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 사용하여 확립되었습니다. 확립된 VMO는 또한 전이를 모방하기 위해 암세포와 관류되었습니다. 각 모델에서 공동 배양 5일째까지 혈관 네트워크는 조직 챔버를 가로지르는 중력 구동 흐름에 반응하여 자체 조립되어 영양분, 치료제, 암 또는 면역 세포를 기질 틈새로 전달하는 것과 같은 생체 내 전달을 위한 통로 역할을 합니다(그림 4). VMO는 그림 4A (배양 0일차)와 같이 mCherry 표지 EC를 조직 챔버에 도입하여 세포가 고르게 분포되도록 하여 처음 확립되었습니다. VMO 배양 2일째에 EC가 늘어나고 루멘화되기 시작하고(그림 4B), 4일째에 EC는 외부 미세유체 채널과 문합되어 연속적인 혈관 네트워크를.......

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토론

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신체의 거의 모든 조직은 혈관을 통해 영양분과 산소를 공급받기 때문에 체 외에서 사실적인 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 중요한 구성 요소입니다. 또한, 여러 악성 종양 및 질병 상태는 혈관 내피 기능 장애와 과투과성으로 정의된다3. 특히, 암에서 종양 관련 혈관 조직은 종종 관류가 잘 되지 않고, 파괴되고, 누출되어 종양에 대한 치료 및 면역 세포 전달에 장벽으로 작용합니다. 또한 혈관 구조는 암세포가 멀리 떨어진 조직에 씨앗을 뿌리기 위해 전이될 수 있는 통로 역할을 하며, 암세포의 성장과 전파를 더욱 촉진하면서 면역 반응을 약화시키는 세포 간 통신을 촉진합니다. 이러한 현상은 혈관 틈새가 치료 내성 및 암 진행에서 중요한 역할을 하고 전임상 연구 중에 종양 미세환경을 정확하게 모델링해야 할 필요성을 강조합니다. 그러나 표준 in vitro 모델 시스템은 적절한 기질 및 혈관 구성 요소를 포함하지 못하거나 동적 흐름 조건을 통합하지 못합니다. 현재 모.......

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공개 사항

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CCWH는 Aracari Biosciences, Inc.의 지분을 보유하고 있으며, 이 회사는 이 논문에 설명된 기술의 버전을 상용화하고 있습니다. 이 약정의 조건은 이해 상충 정책에 따라 University of California, Irvine에서 검토하고 승인했습니다. 다른 이해 상충은 없습니다.

감사의 글

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설명된 절차에 귀중한 의견을 제시해 주신 Christopher Hughes 박사 연구실 구성원과 플랫폼 설계 및 제작에 도움을 주신 Abraham Lee 박사 연구실의 협력자에게 감사드립니다. 이 작업은 UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378(CCWH) 및 TL1 TR001415 및 W81XWH2110393(SJH)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>제작
(3-메르캅토프로필)트리메톡시실란, 95% 시그마-알드리치175617-100G
Greiner Bio-One  &뮤; 투명 바닥 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트: Greiner Bio-One655096
메탄올 ≥ 99.8% ACSVWR 화학 BDHBDH1135-1LP
MILTEX 멸균 일회용 생검 펀치(플런저 포함), 직경 1mm,Integra Miltex33-31AA-P/25
PDMS 멤브레인PAX IndustriesHT-6240
플라즈마 클리너 PDC-001Harrick 플라즈마N/A
스무스 캐스트 385스무스 온N/A
SP Bel-Art Lab Companion 투명 폴리카보네이트 캐비닛 스타일 진공 데시케이터Bel-ArtF42400-4031
표준 뚜껑(응축 링 포함), 96웰 플레이트VWR82050-827
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트(PDMS)Dow4019862
세포 배양/로딩
BioTek Lionheart FX 자동화 현미경Agilent 
CELLvo Human Endothelial ProgenitorCells StemBioSysN/A
Collagen I, rat tailEnzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)Sigma-AldrichC5138
Corning Hank' s 균형 잡힌 소금 용액, 칼슘과 마그네슘이 없는 1XCorning21-021-CV
Corning  L-글루타민, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨이 함유된 DMEMCorning10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190144
EGM-2 내피 세포 성장 매체-2 BulletKitLonzaCC-3162
소 혈장에서 추출한 피브리노겐Neta ScientificSIAL-341573
Fibronectin 인간 플라즈마Sigma-AldrichF0895
Fluorescein isothiocyanate– 덱스트란 (70kDa)시그마-알드리치FD70S-1G
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴그마-알드리치G1890
양 고환에서 추출한 히알루로니다아제(유형 4)시그마-알드리치H6254
라미닌 마우스 단백질Gibco23017015
라이카 TCS SP8라이카N/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – 정상적인 인간 폐 섬유아세포LonzaCC-2512
Nikon Eclipse TiNikonN/A
파라포름알데히드 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4Electron Microscopy Sciences 15735-90-1L
PBMC - 말초 혈액 단핵 세포LonzaCC-2702
PBS, pH 7.4Gibco10010049
프리미엄 등급 소 태아 혈청(FBS), 열 비활성화Avantor Seradigm97068-091
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144
Quick-RNA Microprep KitZymo R1051
트롬빈Sigma-AldrichT4648
Triton X-100 (Electrophoresis),Fisher BioReagentsBP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드Gibco 12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드Gibco25300062
VasculifeLifeline Cell 기술LL-0003
CYT5MFAW 시 소 혈장에서 추출한 연구

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W.

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재인쇄 및 허가

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