방법 논문

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

DOI:

10.3791/65874

⸱

2023년 11월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Cancer Institute, and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

초록

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인간에서 조혈 세포 이식의 복잡성에도 불구하고 연구자들은 일반적으로 생쥐에서 정맥 주사 또는 대퇴 내(IF) 주사를 수행합니다. 쥐 모델에서 이 기술은 이식된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 파종 효율성을 향상시키기 위해 조정되었습니다. 이 논문은 BM에 존재하는 세포의 연속 특성화를 가능하게 하는 마우스의 IF 주입 및 다음과 같은 골수(BM) 흡인에 대한 자세한 단계별 기술 절차를 설명합니다. 이 방법은 정맥 주사로 생착하기 특히 어려운 세포 수가 적은 귀중한 샘플을 이식할 수 있습니다. 이 절차는 병리학적 분석에 중요한 이종 이식편의 생성을 용이하게 합니다. 말초혈액(PB)에 접근하는 것은 더 쉽지만, PB의 세포 구성은 HSPC의 틈새인 BM을 반영하지 않습니다. 따라서 BM 구획에 대한 접근을 제공하는 절차는 조혈을 연구하는 데 필수적입니다. 여기에 설명된 바와 같이 IF 주입 및 연속 BM 흡인은 마우스를 희생하지 않고 HSPC와 같이 BM에 농축된 세포의 전향적 검색 및 특성화를 가능하게 합니다.

서론

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혈액 시스템은 골수(BM)에 있는 조혈모세포(HSC)에 의해 평생 동안 유지됩니다1,2. BM 환경의 역동적인 변화를 연구하기 위해서는 정상 조혈과 악성 조혈의 생물학을 이해하는 것이 중요합니다 3,4. HSC를 인간 BM에 직접 이식하면 말초 혈액(PB) 주입보다 생착력이 높지만, 절차가 복잡하고 감염 위험이 높아 이 방법이 표준 관행의 일부가 되지 못합니다5. 생쥐의 경우, 동물을 희생시키지 않고 BM 접근을 용이하게 하는 절차는 조혈을 연속적으로 모니터링할 수 있는 자원을 제공합니다. 설명된 절차는 이식된 세포의 생착력이 높은 마우스를 생산하고 살아있는 마우스의 BM을 연속 샘플링할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 이 논문은 마우스-마우스 동종 이식 모델보다 생산하기가 더 어려운 인간 세포를 생착한 면역결핍 마우스를 사용하여 이종 이식 모델을 생산하는 데 중점을 둘 것입니다. 꼬리 또는 후안와 정맥을 통한 조혈모줄기세포와 전구세포(HSPC)를 이식하는 기존의 경우와 비교했을 때, 이 시술의 장점은 적은 양의 출발 물질로 높은 세포 생착을 할 수 있다는 것입니다.

생쥐의 BM 공동으로의 대퇴 내(IF) 세포 주입은 생체 내인간 HSPC를 연구하는 데 일반적으로 사용되지만, 6,7,8, 이 기술을 설명/촬영하는 공식적인 단계별 절차는 이전에 발표되지 않았습니다. 이 프로토콜은 적은 수의 이식된 세포에서 높은 생착을 가능하게 하고 BM을 연속적으로 샘플링하는 메커니즘을 가능하게 합니다. 또한, 이 방법을 활용하여 BM강에 직접 약물을 주입하는 것이 혈액 질환 치료에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 마우스를 희생하지 않고 조혈 세포가 있는 BM에 접근하는 데 도움이 됩니다.

이 프로토콜은 BM 포부에 사용되는 기술과 유사하다9. 주요 차이점은 이 논문과 함께 제공되는 비디오 프로토콜은 세포를 골수에 주입하는 안전한 절차를 자세히 설명하는 반면, 이전 논문은 정맥을 통해 세포를 이식한 다음 연속 BM 흡인을 수행했다는 것입니다. 이 프로토콜은 소수의 세포주(그림 1), 정상 제대혈(CB) 유래 HSPC(CD34+)(그림 2) 및 HSC(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)(그림 3), 정상 BM 유래 HSPC(CD34+CD38-)(그림 4), 환자 유래 백혈병 줄기세포(CD34+CD38-)(그림 5), CRISPR/Cas9 유전자 편집 정상 CB 유래 HSPC(CD34+) (그림 6) 및 급성 골수성 백혈병(AML)-iPSC(그림 7). 특히 정상적인 제대혈 유래 HSC의 경우 10개의 세포만으로 성공적으로 생착을 할 수 있었습니다. 이 방법은 변형되지 않았거나 유전자 편집된 원발성 인간 급성 골수성 백혈병 또는 CB 세포와 같은 희귀하거나 생성하기 어려운 세포 집단을 대상으로 수행하는 실험에 특히 유용합니다. 또한 이 절차는 다운스트림 실험에 즉시 사용할 수 있는 생착된 세포의 연속 분석을 위한 효율적인 방법을 설명합니다. 귀중한 시료를 낭비하지 않고 IF 주입을 보장하기 위해 이 기술을 공고히 하는 데 도움이 되는 Akaluc 기반 절차10가지 관행도 간략하게 설명했습니다.

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프로토콜

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6주에서 10주 된 수컷 또는 암컷 NOD. 이 프로토콜에는 Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스가 사용되었지만 모든 유형의 마우스에 적용할 수 있습니다. 조사는 실험 내용과 마우스의 종류에 따라 다르며, 마우스에 대한 조사 여부는 연구 목적에 따라 다릅니다. 여기에 설명된 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었으며 스탠포드 대학의 실험실 동물 관리에 대한 관리 패널(APLAC #22264)의 승인을 받았습니다. 모든 정상 혈액 세포 집단을 신선하게 분류했습니다. IRB(Institutional Review Board)가 승인한 프로토콜(Stanford IRB, 33818)에 따라 Stanford Medical Center의 환자로부터 사전 동의하에 인간 AML 샘플을 채취했습니다.

1. 세포주, 조혈모세포 및 전구세포(HSPC) 또는 백혈병줄기세포(LSC)의 대퇴내 주사

참고: 이미징 장치로 주입된 세포를 쉽게 분석하기 위해 Akaluc/tdTomato 양성 K562 세포주를 생성하고 AkaLumine-HCl/Akauc을 기질10으로 사용했습니다. 이미징 장비를 사용할 수 없는 경우 렌티바이러스 또는 PiggyBac에 의해 형광 염료로 세포를 라벨링하고 유세포 분석으로 분석할 수 있습니다. 세포 준비의 세부 사항에 관계없이 골수에 투여된 세포가 BM에 안정적으로 진입했음을 증명할 수 있는 방법을 갖는 것이 이 기술을 개선하는 데 중요합니다(그림 1).

  1. 20μL의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) + 2% 소 태아 혈청(FBS) + 2mM EDTA) 또는 해동 배지(IMDM + 20% FBS + Pen/Strep)를 PCR 또는 1.5mL 튜브에 넣고 주입 전에 얼음에 보관하여 세포 현탁액(최대 3개 × 10개,6 개의 혈액 세포)을 준비합니다.
    알림: 바늘로 세포를 매달아 놓는 동안 기포를 만들지 마십시오. 기포를 주입하면 마우스의 돌연사를 유발할 수 있으므로 주사 직전에 기포를 최대한 제거해야 합니다.
  2. 세포 주입 48시간 전까지 200 cGy(225 kV, 13.3 mA, 총 2 Gy[용량 조절 모드])를 가진 6-10주 된 성체 마우스를 조건화합니다.
  3. 먼저, 유도실에서 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취하고 콧물을 통해 1-2L/min의 유속으로 100% 산소에 2% 이소플루란을 유지하여 안정적인 마취 상태에 도달합니다. 발가락 꼬집음 반사와 느리고 꾸준한 호흡으로 마취 깊이를 확인하고 이소플루란 시술 내내 이 상태를 유지합니다.
    참고: 수술 내내 3-5분마다 마취 깊이를 모니터링하여 외과적 조작 및/또는 귀, 발가락 및 꼬리 꼬집기로 인한 심장 및 호흡 속도에 변화가 없는지 확인하십시오. 점막과 피부의 색은 생쥐의 상태가 양호하면 분홍빛을 띠기 때문에 산소화의 지표로 사용할 수 있습니다. 마우스 위에 불투명한 커튼을 씌울 때는 마우스에서 무슨 일이 일어나고 있는지 항상 볼 수 있는 것은 아니므로 주의하십시오.
  4. 시술 전에 통증을 최소화하기 위해 10mg/kg의 카프로펜을 마우스에 피하로 투여하고 지지 관리를 위해 0.5-1.0mL의 0.9% 식염수를 따뜻하게 합니다.
  5. 각막 건조를 피하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 바르십시오.
  6. 절차 중 저체온증을 방지하기 위해 열 패드 또는 온도 조절 장치로 제어되는 기타 표면에 마우스를 보관하십시오.
    알림: 시술 후 온도 조절이 가능한 발열 패드가 사용됩니다. 마우스의 체온은 일반적으로 37-39 °C이며 패드는 이상적으로는 이보다 약간 낮아야 합니다. 실제로 온도는 종종 32-36 °C로 설정됩니다.
  7. 대퇴골이 포함된 다리 전체를 교대로 3세트의 스크럽으로 주사합니다(포비돈 요오드 또는 클로르헥시딘 스크럽과 70% 에탄올에 적신 거즈 스펀지로 번갈아 가며).
    참고: 1) 시술자가 왼손잡이인 경우 마우스의 왼쪽 대퇴골이 오른쪽 대퇴골보다 주입이 더 쉬울 수 있습니다. 2) 본 연구에서는 불필요한 피부 손상을 방지하기 위해 주사를 위해 털을 제거하지 않았으며, 털을 자르지 않고도 바늘 입구 위치를 쉽게 찾을 수 있습니다. 그러나 짙은 털을 가진 쥐의 경우 펑크 부위를 찾는 것이 어려울 수 있으며, 이 경우 주사를 빠르고 쉽게 시작할 수 있으므로 털을 자르는 것이 좋습니다.
  8. 엄지와 검지로 대퇴골을 부드럽게 꼬집어 다리를 안정시킵니다. 반지 또는 다섯 번째 손가락으로 경골을 밀어 경골이 대퇴골에서 구부러지지 않도록 합니다. 성공적인 주입을 위해서는 포지셔닝이 중요합니다(보충 그림 S1-S5).
    알림: 손가락 부상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 뼈를 꼬집습니다. 그러나 대퇴골의 축을 느끼기 어려울 수 있으며 절차에 시간이 추가됩니다.
  9. 슬개골 힘줄 바로 아래에 주사기가 부착된 빈 멸균 27G(1/2인치) 바늘을 삽입하여 바늘이 대퇴골의 두 과두 사이에 단단히 고정되도록 합니다. 바늘의 가장자리를 사용하여 대퇴골 위쪽의 슬개건을 가볍게 두어 번 쪼아 바늘을 삽입하기에 가장 좋은 위치를 찾습니다(보충 그림 S1-S5).
    알림: 이 절차를 수행하기 전에 마우스 무릎 부위의 해부학적 구조에 대한 지식이 필요합니다. 초보자는 시간을 내어 해당 부위의 해부학적 구조를 이해하고 살아있는 쥐에게 시도하기 전에 안락사된 쥐에서 절차를 연습해야 합니다.
  10. 바늘을 바깥쪽과 위쪽으로 돌려 대퇴골 축과 평행이 되도록 합니다.
    참고: 이 조작은 골수강으로 가는 신뢰할 수 있는 경로를 제공하고, 대퇴골 샤프트에서 골수 내용물을 쉽게 회수할 수 있으며, 절차로 인한 동물의 불편함을 최소화합니다.
  11. 바늘을 원을 그리며 돌리면서 천천히 대퇴골수 강으로 이동합니다. 저항이 눈에 띄게 감소할 때까지 바늘을 삽입하십시오. 주사기를 옆으로 부드럽게 움직여 바늘의 올바른 위치를 확인합니다. 손가락이 뼈 밖으로 나온 상태에서 바늘 가장자리를 만질 수 있으면 1.9단계로 돌아가서 다른 각도와 바늘을 뚫을 위치를 찾으십시오.
    1. 바늘의 진입각이 뼈 끝면에 수직인지 확인합니다.
      참고: 이론적으로 바늘은 대퇴골과 평행하게 주입해야 하며 뼈 끝단과 90° 각도를 이루어야 합니다. 내부 표면에서 저항이 있으면 바늘이 대퇴골강에 올바르게 삽입된 것입니다. 바늘이 뼈와 평행한지 확인하려면 뼈 측면에 조명을 놓고 바늘 축과 평행한 뼈의 그림자를 관찰합니다. 골수강에 들어갈 때 저항력의 감소는 마우스의 나이에 따라 달라지며, 마우스가 어릴수록 저항의 감소를 더 쉽게 인식할 수 있습니다.
  12. BM 캐비티 내에서 바늘을 앞뒤로 움직이면서 바늘 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 음압을 생성합니다. 바늘이 BM 구멍에 있으면 주사기에서 약간의 혈액/골수가 나옵니다.
    1. 혈액/골수가 보이지 않으면 새 바늘로 변경하고 동일한 경로를 찾으십시오.
      참고: 새 바늘로 변경하는 이유는 뼈가 바늘을 막으면 혈액/골수의 역류를 확인하기 어려워지기 때문입니다. 골수에 주입된 세포는 이전 진입점을 통해 대퇴골 밖으로 누출될 가능성이 있으므로 BM 공동으로의 주입 경로 수를 최소화하는 것이 중요합니다. 여러 번의 주입 경로가 필요한 경우, 빠른 bolus보다 점진적으로 세포를 주입하여 누출 위험을 줄일 수 있습니다.
  13. 바늘을 천천히 제거하고 같은 경로로 세포 함유 주사기를 삽입합니다. 바늘이 멈출 때까지 (BM 캐비티의 가장자리에서) 바늘을 삽입하고 거기에서 약간 (1-2mm) 당겨 세포를 쉽게 주입하십시오. 플런저를 누르고 세포를 방출하기 전에 약간 흡인하고 혈액/골수를 확인하여 바늘이 올바르게 배치되었는지 확인하십시오. 먼저 혈액/골수의 역류를 확인한 다음 주사기를 천천히 밀어 세포를 주입합니다.
    참고 사항 : 새 바늘로 전환할 때 첫 번째 주입의 경로와 각도를 기억하는 것이 매우 중요합니다. 동일한 경로를 찾을 수 없으면 첫 번째 경로를 만드는 데 사용된 원래 바늘로 다시 시도하십시오. 이때 새 바늘을 사용할 수 있지만 원래 바늘을 사용하는 경우 걸린 뼈를 한 번 밀어낸 후 사용해야 합니다. 주입할 새로운 경로를 찾기 위해 세포와 함께 바늘을 사용하지 마십시오. 그렇지 않으면 바늘에 끼인 뼈 조각이 세포 분산을 방해할 수 있습니다. BM 캐비티는 매우 작지만 사출량은 데드 캐비티를 고려하여 30μL 미만이어야 합니다.
    1. 주사기 내의 공기가 골수로 들어가는 것을 방지하고 천자 부위에서 세포가 누출되는 것을 방지하기 위해 주입 속도가 느려야 합니다. 주사기를 밀 때 저항이 느껴지면 바늘을 위아래로 움직여 캐비티에서 저항이 덜한 영역을 찾으십시오.
  14. 세포가 대퇴골에 성공적으로 주입되면 주사기에 대한 압력을 유지하면서 마우스에서 바늘과 주사기를 제거합니다.
    참고: 주입을 완료할 수 없는 경우 다른 대퇴골로 다시 시도하십시오. 이 절차는 마취 상태에서도 마우스에게 매우 스트레스가 됩니다. 항상 마우스의 활력 징후(심박수 및 호흡수)를 모니터링하고 가능한 한 빨리 절차를 완료하도록 하십시오.
  15. 콧방울에서 마우스를 제거하고 깨끗한 종이 타월 위에 올려 침구의 흡인을 방지합니다. 복구하는 동안 마우스를 가열 패드 또는 기타 자동 온도 조절 장치로 제어되는 표면에 보관하십시오. 마우스 랙에 다시 놓기 전에 모든 마우스를 모니터링하여 마취 후 회복 상태를 확인합니다.
    참고: 제대로 수행되면 흡인 후 합병증이나 고통이 없어야 합니다. 이 절차는 마취된 쥐가 회복되어 보행할 수 있고 음식과 물에 도달할 수 있을 때 완료됩니다.
  16. 다음 24시간 동안 시술 후 쥐에게 고통이나 감염의 징후가 있는지 관찰합니다. 고통이나 감염의 징후로는 지속적인 출혈, 빈혈, 무기력 등이 있다. 시술 후 이러한 징후 중 하나라도 보이면 동물 취급 프로토콜에 따라 CO2 흡입 또는 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다.

2. FACS 분석을 위한 대퇴골의 골수 세포 흡인

참고: 마우스로부터 BM 세포를 흡인하는 절차는 섹션 1에 설명된 방법과 매우 유사하며 일부 이전 문헌 9,11,12에서 배울 수 있습니다. 다음은 BM 주입 프로토콜과 흡인 프로토콜의 몇 가지 차이점에 대한 개요입니다.

  1. BM 흡인을 현탁시키기 위해 샘플당 500μL + 10mM EDTA(세포 현탁액: CSM)를 준비합니다.
  2. BM을 흡인하기 전에 0.5mL 27G 주사기에 CSM을 적십니다.주사기에 200-500μL의 CSM을 채우고 즉시 배출합니다. 이 절차를 2-3회 반복합니다.
  3. 주사기의 플런저를 당겨 BM을 부드럽게 흡입하면 20-50μL의 마우스 BM이 생성됩니다. 그런 다음 대퇴골에서 바늘을 완전히 제거하고 다음 염색 단계를 위해 흡입된 샘플을 CSM(1.5mL 튜브의 500μL)에 현탁합니다. 콧방울에서 마우스를 제거하고 깨끗한 종이 타월 위에 올려 놓아 회복 중 침구가 흡인되는 것을 방지합니다. 마우스 랙에 다시 놓기 전에 모든 마우스를 모니터링하여 마취 후 회복 상태를 확인합니다.
    참고: BM 흡인/샘플링은 반복할 수 있지만 같은 다리에 대한 반복적인 외상을 방지하기 위해 같은 날 반복 절차를 반대쪽 대퇴골에 수행해야 합니다. BM 흡인의 빈도에 대한 정보는 거의 없지만, 본 연구의 경험에 비추어 볼 때, 대퇴골 BM 흡인은 일반적으로 4주마다 반복되며, 아무런 문제(예: 감염) 없이 최소 3-4회 이상 시행할 수 있다고 생각한다. 그러나 이식된 골수의 반대쪽 쪽에 있는 골수는 일반적으로 세포 생착이 낮다는 점을 명심해야 합니다.
  4. 골수에서 추출한 펠릿 세포는 300 × g, 4 °C에서 5분 동안 회전하여 흡인합니다.
  5. 상등액을 흡인하고 각 튜브에 0.5-1mL의 ACK 용해 완충액(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)을 첨가하고 와류를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 얼음 위에 5-10분 동안 놓습니다.
  6. 나일론 메쉬를 통해 각 튜브를 새 튜브로 필터링합니다.
  7. 튜브를 1mL의 FACS 버퍼로 헹구고 나일론 메쉬를 통해 새 튜브에 추가합니다.
  8. 300 × g, 4 °C에서 5 분 회전으로 펠렛 셀.
  9. 상등액을 흡인하고 원하는 항체를 함유한 염색 용액을 첨가합니다13. 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
  10. 세포를 세척하고 실험 설정에 따라 분석합니다.
    1. FACS 완충액(PBS, 2% FBS, 2mM EDTA)으로 세포를 세척하고 총 부피 50μL의 얼음에서 30분 동안 항체로 염색합니다. 분석 또는 분류 직전에 최종 농도 1μg/mL에서 프로피듐 요오드화물(PI)로 세포를 세척하고 염색합니다. 분류된 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 분류 후 분석을 수행합니다.
      참고: 유세포 분석에 사용되는 모든 항체는 Table of Materials에 자세히 설명되어 있습니다.
    2. 다음 FACS 게이팅 전략(그림 2-7)을 사용하여 마우스 골수에서 생착된 세포를 분석합니다.
      1. 세포의 집단을 forward (size) 및 side scatter (granularity) 속성으로 구별합니다.
      2. SSC-H 대 SSC-W에 이어 FSC-H 대 FSC-W를 플로팅하여 이중선 판별을 수행합니다.
      3. 죽은 세포를 제외합니다.
      4. 인간 CD45와 마우스 CD45로 세포 집단을 구별합니다. 이러한 항체 염색 조합을 통해 human CD45 분획 내에서도 human CD3, CD19 및 CD33을 검출할 수 있습니다.
        참고: 샘플을 염색하기 전에 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 마우스 및 인간 Fc 블록을 사용하는 것을 잊지 마십시오. 우리는 보통 얼음에서 10분 동안 Fc 블록(마우스 + 인간)으로 염색한 다음 세포를 세척하지 않고 항체를 추가합니다. Fc 블록 항체 사용 방법은 각 회사의 지침을 참조하십시오.

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결과

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이러한 프로토콜 1,14,15,16,17,18,19,20에 따라 각 샘플을 이식하고 이종 이식 마우스 모델을 확립했습니다. 여기서 실험의 목적은 여러 유형의 인간 세포를 사용한 IF 주입과 살아있는 쥐의 골수 흡인/분석을 보여주는 것이었습니다. 본 논문은 일반적으로 사용되는 다음과 같은 인간 유래 샘플의 이식 결과를 보여줍니다. 샘플에는 K562 세포주(그림 1), 제대혈 유래 HSPC(CD34...

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토론

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쥐 이종 이식 모델은 정상 및 병리학적 인간 조혈을 모두 연구하는 데 중요합니다. BM은 조혈3의 근원입니다. 따라서 혈액 질환을 연구하려면 희귀 인간 줄기 세포를 쥐 BM에 성공적으로 생착해야 합니다. 지금까지 꼬리 정맥, 후안와 정맥, IF 주입 등의 이식 방법이 보고되고 있으며, 이러한 방법 중 어느 것이라도 이식된 세포를 생착할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. IF 주사는 매우 제한된 수의 인간 유래 세포를 면역 결핍 마우스에 이식하는 데 사용되는 이식 방법이며, 다른 방법에 비해 생착 속도가 매우 안정적입니다 6,7,8,9,11.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.M.은 Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics 및 858 Therapeutics의 자문 위원회에 소속되어 있으며 Gilead Sciences에 라이선스를 부여한 CD47 암 면역 요법과 관련된 여러 특허의 발명자입니다. R.M.은 Pheast Therapeutics, MyeloGene 및 Orbital Therapeutics의 공동 창립자이자 지분 보유자입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수년 동안 도움, 지원, 격려 및 영감을 주신 Majeti 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. Stanford Stem Cell Institute의 유세포 분석 코어, 제대혈 연구를 위한 Binns 프로그램 및 샘플을 기증한 환자에게 감사드립니다. 인간 샘플의 경우, 정상 기증자, 인간 골수 및 말초 혈액 세포를 AllCells 또는 Stanford Blood Center에서 신선하게 채취했습니다. pBac-AkaLuc-tdTomato 플라스미드를 기증해 주신 스탠포드 대학의 Nakauchi 연구실에 감사드립니다. 무엇보다도 생쥐를 돌봐주시는 스탠포드 수의과대학의 수의사와 동물관리사 여러분께 감사의 말씀을 드립니다. 특히 동물센터의 책임자인 마이크 알바레스(Mike Alvares)는 쥐를 매우 철저하게 관리해 왔기 때문에 그가 없었다면 우리의 연구는 불가능했을 것이라고 해도 과언이 아닙니다.

이 연구는 NIH 보조금 1R01HL142637 및 1R01CA251331, Stanford Ludwig Center for Cancer Stem Cell Research and Medicine, The Leukemia & Lymphoma Society, The Mark Foundation for Cancer Research 및 The Paul G. Allen Frontiers Group을 통한 Blood Cancer Discoveries Grant 프로그램의 지원을 받았습니다. Y.N.은 나카야마 인간 과학 재단(Nakayama Foundation for Human Science)과 스탠포드 대학교 의과대학 학장의 박사후 연구원(Postdoctoral Fellowship)의 지원을 받았습니다. A.E.는 NCI의 수상 F32CA250304, 스탠포드의 고급 레지던트 교육 프로그램, 미국 혈액학 학회 학자상의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1/2 mL 주사기, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK 용해 버퍼Qualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
생물학적 조사기KimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
클로르헥시딘놀바산NDC 54771-8701-1
https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser 에틸 알코올, 증거 190골드 쉴드https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
유세포 분석기, AriaIIBeckton Dickinson (BD)세포 분류
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
이소플루란, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스 Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USAbr/> Strain #:0055576주에서 10주 된 수컷 또는 암컷 
안과 연고, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20
http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b PBS, pH 7.4수제
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
포비돈-요오드베타딘NDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni(미국)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 m EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020생착 항체 패널(in vivo, 마우스 골수)
항원희석
항원: Anti-human CD45
Fluorophore: V450
Clone: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1
Fluorophore: PE-Cy7
Clone: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigen:Anti-mouse TER-119
Fluorophore: PE-Cy5
Clone: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigen:Anti-human CD3
Fluorophore: APC-Cy7
Clone: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antigen:Anti-human CD19
Fluorophore: APC
Clone: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigen:Anti-human CD33
Fluorophore: PE
Clone: WM53		BD Biosciences5554501:25
Dead stainingConc.
PIInvitrogen1 &뮤; g/mL
보상 비드
negative controlBD Biosciences자세한 내용은 지시 사항
참조 Anti-mouse Ig, κBD Biosciences자세한 내용은 지침을 참조하십시오
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886(2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660(2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873(2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576(2019).

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