인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)
이 논문에서
요약
초록
용질 담체(SLC)는 이온, 영양소, 대사 산물, 신경 전달 물질 및 의약품을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 기질을 수입 및 수출하는 막 수송체입니다. 매력적인 치료 표적 및 질병 표지자로 부상했음에도 불구하고 이 단백질 그룹은 여전히 현재 의약품에 비해 상대적으로 약이 부족합니다. 이러한 수송체에 대한 약물 발견 프로젝트는 제한된 구조적, 기능적, 생리학적 지식으로 인해 방해를 받으며, 궁극적으로 이러한 종류의 막에 내장된 단백질의 발현 및 정제의 어려움으로 인해 방해를 받습니다. 여기서는 코돈에 최적화된 유전자 염기서열을 사용하여 고순도 밀리그램 양의 인간 SLC 수송체 단백질을 얻는 방법을 보여줍니다. 구조 설계 및 고처리량 발현에 대한 체계적인 탐색과 함께 이러한 프로토콜은 표적 단백질의 구조적 무결성 및 생화학적 활성의 보존을 보장합니다. 또한 진핵생물 세포 발현, 친화성 정제 및 이러한 단백질의 크기 배제 크로마토그래피에서 중요한 단계를 강조합니다. 궁극적으로 이 워크플로우는 고분해능 구조 측정, 수송 연구, 저분자 관여 분석 및 고처리량 in vitro 스크리닝에 적합한 순수하고 기능적으로 활성화되며 안정적인 단백질 제제를 제공합니다.
서론
막 단백질은 오랫동안 연구자와 제약 산업 모두의 표적이 되어 왔습니다. 이 중 용질 운반체(SLC)는 인간 게놈1 내에 암호화된 400개 이상의 2차 수송체 유전자 계열입니다. 이러한 수송체는 이온2, 신경 전달 물질3, 지질 4,5,6,7, 아미노산8, 영양소 9,10,11 및 의약품 12을 포함한 수많은 분자의 수입 및 수출에 관여합니다. 이러한 광범위한 기질로 인해, 이들 단백질은 독소의 수송(13), 남용 약물(14,15)에 의한 운반 및 억제, 또는 해로운 돌연변이(
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프로토콜
참고: 모든 코돈에 최적화된 RESOLUTE SLC 유전자는 AddGene43에 증착되었으며, 이 링크는 RESOLUTE 공공 시약44 목록에서 확인할 수 있습니다. 이들 유전자는 pDONR221 플라스미드로 클로닝되어 재조합 클로닝(45)을 이용하여 유전자를 목적 벡터로 직접 클로닝할 수 있다. 병렬성을 극대화하기 위해 박테리아, 곤충 및 포유류 세포는 각각 bacmid 생산(섹션 3), baculovirus 증폭(섹션 5) 및 발현 테스트(섹션 6)를 위해 블록 형식으로 성장합니다. 이러한 단계에서는 충분한 혼합 및 폭기를 보장하기 위해 마이크로 발현 쉐이커가 필요합니다.
1. SLC를 pHTBV1.1 bacmid로 (고처리량) 클로닝
참고: 클로닝 단계는 효율적인 클로닝을 위해 재조합 클로닝 프로토콜을 사용하고 열충격 방법(46)을 사용하여 대장균(E. coli)으로 형질전환시킨다. 이 프로토콜은 여러 표적 또는 구조의 높은 처리량 및 병렬 클로닝을 위해 설계되....
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결과
포유류 발현을 위해 SLC 유전자를 RESOLUTE pDONR 플라스미드에서 BacMam 벡터로 클로닝할 수 있습니다.
클로닝, 발현 및 정제를 위해 설명된 프로토콜은 여러 단백질 접힘에 걸쳐 많은 SLC 수송체에 대해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 이 절차에는 진행 상황을 모니터링하기 위한 몇 가지 체크포인트가 포함되어 있어 발현, 단백질 접힘, 지질 및 세제 의존적 안정성, 완충액 조건에 대한 민감도의 차이를 설명하기 위한 최적화가 가능합니다.
SLC 클로닝 및 소규모 발현 중 체크포인트
클로닝 단계에서는, 아가로스 젤 전기영동은 PCR와 분해 산물의 정확한 크기를 지키기 위하여 이용되어야 합니다. 마찬가지로, Gateway 및 transposition 반응은 colony PCR 반응으로 검증할 수 있습니다(그림 2A,B
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토론
SLC 표적 치료제의 개발은 수송체 기능의 체계적인 특성 분석의 부재로 인해 방해를 받고 있습니다. 이로 인해 정상 및 병태생리학적 과정에서의 수많은 역할에도 불구하고 GPCR 및 이온 채널63에 비해 이 단백질 클래스를 표적으로 하는 약물이 불균형적으로 적어졌습니다. RESOLUTE는 현재 SLC 연구를 가속화하고 개선하기 위한 최첨단 연구 기법과 도구를 개발하는 것을 목표로 하는 국제 컨소시엄입니다. RESOLUTE의 일환으로 인간 SLC의 효율적인 클로닝, 구성 스크리닝, 대규모 발현 및 정제를 위해 이러한 프로토콜을 개발했습니다.
여기서는 추정 및 고아 SLC를 포함하여 인간 SLC 수송체를 체계적으로 탐색하는 데 성공적으로 사용된 확장 가능한 SLC 클로닝 및 발현 방법에 대해 설명합니다. 특히, 이러한 방식으로 정제된 SLC는 수송체 구조, 생화학, 기능, 결합제 생성 및 저분자 결합에 대한 후속 연구에서 성공적으로 사용되었습.......
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공개 사항
저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 RESOLUTE 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다. RESOLUTE는 보조금 계약 No 777372에 따라 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking으로부터 자금을 지원받았습니다. 이 공동 사업은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램과 EFPIA의 지원을 받습니다. 이 기사는 저자의 견해만을 반영하며, IMI나 유럽연합 및 EFPIA는 이 글에 포함된 정보의 사용에 대해 책임을 지지 않습니다. pHTBV 플라스미드는 Frederick Boyce 교수(하버드)가 친절하게 제공하였습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3C 프로테아제 | : 자체 | ||
| 50 또는 100 kDa 컷오프 원심 농축기 | , Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | , Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage, Plasmid, Miniprep |
| , 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| 접착 플라스틱 씰 | Qiagen | 19570 | 테이프 패드 |
| 아가로스 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 | Cytiva | 29091596 | Superose 6 증가 10/300 GL |
| 벤조나제 DNAse | 자체 | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| 콜레스테릴 헤미숙시네이트 트리스 염 Anatrace | CH210 | CHS | |
| 코발트 금속 친화력 수지 | Takara Bio | 635653 | TALON 금속 친화성 수지 |
| D(+)-비오틴 | 시그마 알드리치 | 851209 | |
| 덱스트란-아가로스 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 증가 10/300 GL |
| 디지토닌 | 아폴로 사이언티픽 | BID3301 | |
| Dounce 조직 그라인더(40mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 |
| 태아 소 혈청 | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| 글리세롤 | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| 중력 흐름 컬럼 | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 매체 | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 매체 |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| 친수성, 중성 실리카 UHPLC 컬럼 | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| 이미다졸 | 시그마 알드리치 | 56750 | |
| 곤충 트랜스펙션 시약 | 시그마 알드리치 | 71259 | 시약 |
| 라우릴 맥아당 네오펜틸 글리콜 | 아나트레이스 | NG310 | LMNG |
| 염화마그네슘 육수화물 | 시그마 알드리치 | M2670 | |
| 마이크로 발현 셰이커 | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | 시그마 Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β- D-글루코피라노시드 | , 아나트레이스 | O311D | OGNG |
| 옥타에틸렌 글리콜, 모노도데실 에테르 | 아나트레이스 | O330 | C12E8 |
| 옥틸 글루코스, 네오펜틸 글리콜 | , 아나트레이스 | NG311 | OGNG |
| 인산염 완충 식염 | , 시그마 알드리치 | , D8537 | DPBS, |
| 폴리옥시에틸렌(10)도데실 에테르 | 아나트레이스 | , AP1210 | C12E10 |
| 폴리옥시에틸렌(9)도데실 에테르 | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| 다공성 밀봉 | VWR | 60941-084 | 생물학적 배양용 레이온 필름 |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| 재조합 효소 혼합물 | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| 무혈청 곤충 매체 | Gibco | 10902088 | Sf-900 II 무혈청 매체 |
| 부티르산나트륨 | 시그마 Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24헤드 프로브 | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator 전원 장치 | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin 수지 | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow 대용량 수지 |
| 설탕 | 그마 Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| 현탁액 적응 HEK293 세포 | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection 시약 | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection 시약 |
참고문헌
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science
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재인쇄 및 허가
