알츠하이머에서 Thread-Embedding Acupuncture Therapy의 작동 절차 및주의 사항

Summary

이 연구는 알츠하이머병과 같은 쥐에서 실 끼워넣기 침술 요법을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

실 삽입 요법 (TEAT)은 생분해 성 봉합사를 경혈에 삽입하여 오래 지속되는 자극을 제공하여 질병을 예방하고 관리하는 치료법입니다. 젖꼭지는 정기적인 침술의 불편함을 피하고 지속적인 치료 효과를 제공하는 간단한 접근법입니다. 이 기사에서는 알츠하이머병과 유사한 증상을 가진 쥐의 학습 및 기억 능력에 대한 TEAT의 잠재적 영향에 대해 논의합니다. 쥐에서 화학적으로 유도된 신경 세포 퇴화와 인지 장애는 알츠하이머병에서 관찰된 진정한 병리학적 변화를 완전히 반영하지 않기 때문입니다. 이에 따라 우리 연구팀은 이러한 증상을 알츠하이머병과 유사한 증상으로 명명했습니다. 경혈의 선택, 수술 과정, 머리와 허리에 필요한 예방 조치를 설명하기 위한 프로토콜이 수립되었습니다. 실험은 대조군, 모델군, TEAT 그룹의 세 그룹으로 진행되었으며 각 그룹에는 6마리의 쥐가 포함되었습니다. 알츠하이머병과 유사한 증상을 유도하기 위해, 쥐에게 7주(49일) 동안 D-갈락토스를 복강내 주사하였다. 젖꼭지 그룹의 쥐는 경혈 캣거트 삽입 치료를 받았습니다. 개입 기간 후, 쥐의 학습과 기억력을 평가하기 위해 Morris Water Maze(MWM)가 수행되었습니다. 그 후, 쥐들을 제물로 바치고 그들의 뇌 조직을 검사하였다. 알츠하이머병의 증상을 보이는 쥐의 병리학에 대한 TEAT의 효과를 이해하기 위해 조직학적 검사를 수행했습니다. 이 연구는 TEAT가 알츠하이머병과 유사한 증상을 가진 쥐의 학습과 기억력을 향상시킬 수 있음을 시사하며, 이는 이 신경퇴행성 질환에 대한 잠재적으로 유망한 새로운 치료 접근 방식을 나타냅니다.

Introduction

실 삽입 침술(TEA)은 특수 바늘을 사용하여 캣거트 또는 흡수성 봉합사를 경혈에 삽입하는 것을 포함합니다. 이 기술은 봉합사가 흡수되고 분해될 때까지 장기간의 효과가 있습니다. 일주일^{이상 경}혈에 지속적이고 지속적인 자극을 제공하여 1 매일 반복적인 시술을 할 필요 없이 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다². 이로 인해 치료를 받으려는 환자의 수가 줄어들어 의료 자원을 어느 정도 절약할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 TEAT는 내과, 외과, 피부과, 안면 특징, 산부인과, 소아과 등 중국의 다양한 의료 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다³. 연구에 따르면 간질⁴ 및 안면 신경 마비5와 같은 특정 만성 및 복합 질환에 대해 장기적이고 신뢰할 수 있는 효과를 내는 데 효과적^이다. 그것은 최소한의 외상과 간단한 조작의 장점이 있습니다⁶. 또한 TEAT의 치료 비용은 전기 침술(^EA)보다 낮은 것으로 보고되었습니다7. 따라서 TEAT는 임상 및 과학 연구에서 점점 더 가치가 높아지고 있습니다.

알츠하이머병(AD)은 시간이 지남에 따라 진행되는 신경 퇴행성 질환입니다. 병태생리학적 과정은 임상적 증상이 나타나기 약 20년 전부터 축적되기 시작하지만, 그 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다⁸. 알츠하이머병에 효과적인 약물의 가용성이 제한됨에 따라, 연구는 점점 더 알츠하이머병의 전구 및 전임상 단계에 초점을 맞추고 있다⁹. 예방은 AD ^9,10년의 발병과 진행을 다루기 위한 중요한 전략이다. 최근 몇 년 동안 중국 전통 의학(TCM)은 상당한 발전을 이루었으며 AD^11,12를 예방하고 치료하는 새로운 가능성을 제공할 것으로 기대됩니다. 침술의 하위 유형인 TEAT는 치료 범위가 넓고, 외상이 적으며, 조작이 간단하고, 치료 빈도가 낮고, 효능이 오래 지속되기 때문에 다른 치료법보다 선호된다⁶. 최근 문헌에 따르면 TEAT는 비만^13,14, 당뇨병¹⁵, 불면증¹⁶, 폐경 후 골다공증¹⁷, 우울증¹⁸ 등 알츠하이머병의 위험 요인이 있는 환자에게 도움이 될 수 있다고 한다. 또한 미토파지²를 조절하여 노화 쥐의 노화를 개선하고, 공간 학습 및 기억 장애를 개선하며, 해마의 병리학적 손상을 완화하고, 혈관성 치매(VD) 쥐의 염증 반응을 억제한다¹⁹. TEAT가 알츠하이머병 중 병리학적 과정에도 작용할 수 있는지 여부를 파악하는 것이 매력적으로 보였습니다.

현재 연구는 임베딩 방법, 임베딩 도구, 스레드 및 임베딩 간격 기간을 포함하여 TEAT 작동의 몇 가지 중요한 요소에서 균일성과 표준화가 부족합니다. 이러한 표준화의 부족은 치료의 효과에 대한 평가와 관련 메커니즘의 탐색에 영향을 미치고 외부 홍보 및 의사 소통을 제한합니다. 선행 연구^20,21은 D-갈락토스(D-gal)의 복강내 투여가 쥐에서 신경 세포 퇴행 및 인지 장애를 포함한 알츠하이머병과 유사한 병리학적 변화를 유도할 수 있음을 입증했습니다. 또한, Baihui(GV20) 및 Shenshu(BL23)의 전기 침술은 인지 기능 저하를 효과적으로 개선하고 신경 염증을 완화하며 신경 세포 손상을 줄이는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 알츠하이머병과 유사한 모델 쥐를 예로 들어 이 모델에 따른 경혈의 선택과 TEAT의 작동 과정 및 주의사항을 소개한다. 향후 연구를 위한 참고 자료를 제공하기 위해 실험 연구에서 TEAT의 중요한 운영 요소에 대해 논의합니다.

Protocol

모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었으며, 후베이성 질병통제예방센터(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention) 실험동물 관리 및 사용 위원회(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention Laboratory Animal Management and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 체중이 220-250g인 3개월 된 암컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 총 18마리가 시험에 사용되었습니다. 모든 쥐는 23± 1°C 및 40%-50% 습도에서 12시간 밝음/어두운 주기로 유지되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 1주일간의 적응 기간을 거친 후, 쥐들이 실험실 환경에 적응하도록 허용한 후, 실험이 시작되었다.

1. 모델 개발

1. 실험 설계는 그림 1과 같습니다. 체중이 220-250g인 Sprague-Dawley 3개월 된 암컷 쥐 18마리를 무작위로 대조군, 모델링 그룹, 젖꼭지 그룹으로 나눕니다. 각 그룹은 6 마리의 쥐로 구성됩니다.
2. 모델군과 젖꼭지군에 D-갈락토오스(D-gal; 120mg/kg/일)를 매일 주사하고, 대조군은 7주(49일) 동안 하부 복부 부위에 식염수 주사(120mg/kg/일)를 투여한다²². 주사는 매일 오전 8:00에서 9:00 사이에 투여해야 합니다.
3. 매주 7일 오전 9:00에서 10:00 사이에 쥐의 무게를 잰다. 실험은 49일 동안 지속되었습니다. 14^일마다 14일, 28^{일, 42}일에 실을 묻습니다. 각 스레드 임베딩의 시간을 오전 9:00-12:00 사이로 수정합니다.
4. 쥐에서 알츠하이머병 관련 병리학적 징후를 유도하기 위해 7주 동안 D-갈락토오스의 복강 내 투여를 계속합니다²².

2. 젖꼭지 준비

1. 안과 가위, 쟁반, 핀셋과 같은 수술 기구를 소독하고 소독합니다. 수술실 환경의 표면을 철저히 청소하고 소독하십시오.
2. 작은 동물 가열 패드를 표면에 평평하게 놓고 멸균 수건으로 드레이핑하여 수술 플랫폼을 준비합니다. 그런 다음 청소 및 소독한 작동 보드를 거친 면이 위를 향하도록 하여 위에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 가열 패드를 켜고 온도를 32°C로 설정합니다.
3. 시술은 직경 0.6mm의 일회용 실 매매 바늘 6 호와 길이 2cm의 5-0 흡수성 수술 봉합사 (콜라겐 봉합사)를 선택합니다. 2cm 5-0 흡수성 수술용 봉합사를 안과 가위를 사용하여 0.5cm와 0.2cm 조각으로 자릅니다. 자른 실을 0.9% 식염수에 담그고 따로 보관합니다.
4. 비누와 물로 20초 동안 손을 씻은 다음 말리십시오. 그 후에는 멸균 장갑을 착용하십시오.
5. 쥐를 하부 복부 부위에 클로랄 수화물(300mg/kg)의 IP 주사로 마취하고, 발가락 꼬집기 검사에서 반응이 없어 수술 평면에서 동물이 반응이 없을 때 마취를 확인하고 안정적인 생리 상태를 유지하도록 합니다. 또한 쥐가 마취 중인 동안 각막 건조와 잠재적인 손상을 방지하려면 눈에 수의학 연고를 넉넉히 바르고 시술 내내 윤활 상태가 유지되도록 합니다.
   알림: 쥐가 피어싱을 경험하는 것이 고통스러우므로 쥐를 마취하는 것이 좋습니다.

3. Baihui (GV 20)를 위한 실 끼워넣기 가동

1. 쥐의 경혈 Baihui(GV 20)를 두정골의 오른쪽 중간 지점에서 찾습니다(그림 2A). 쥐가 머리를 완전히 노출되도록 배치하고 귀를 앞으로 당겨 인간이 귀 정점 선을 연결하는 데 사용하는 방법을 비슷하게 만듭니다. 두개골의 중앙 세로 융기를 촉진하고 대략 중간 지점의 위치를 정확히 찾아내어 Baihui(GV 20) 점을 식별합니다. 시상 봉합사와 두정골의 교차점과 정렬되도록 평평하게 놓았을 때 귀가 머리와 접촉하는 수준에서 이 경혈을 더 확인하십시오. 마커를 사용하여 Baihui (GV 20)를 표시하십시오.
2. 트리머(보통 전기 남성용 수염 트리머)를 사용하여 쥐의 경혈 주변의 머리 부분을 면도합니다.
3. 수술 전에 0.5% 요오드 용액을 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 도포하여 경혈과 주변 피부를 소독합니다. 그 후, 삼중 소독 과정을 수행하십시오 : 요오드를 3x 사용한 다음 알코올을 도포하여 적절한 오염 제거를 보장하고 무균 기술을 위해 현장을 준비합니다.
4. 겸자를 사용하여 식염수에 적신 0.2cm의 흡수성 수술용 봉합사를 집어내고 바늘관의 앞쪽 끝에 놓습니다. 그런 다음 바늘 코어에 연결하십시오.
5. 한 손에는 엄지와 검지로 Baihui(GV 20) 주변을 집고 다른 손으로는 바늘을 잡습니다.
6. 피부를 꼬집으면서 Baihui(GV 20) 지점에서 15cm 아래 피부 표면에 대해 0.1° 각도로 바늘을 수평으로 빠르게 삽입합니다(그림 3A).
7. 바늘 끝이 Baihui(GV 20) 지점에서 0.1cm 위에 도달한 후 바늘 튜브를 집어넣으면서 바늘 코어를 밀어 0.2cm 흡수성 수술용 봉합사를 경혈의 피하 조직에 완전히 이식합니다(그림 3B).
8. 봉합사가 노출되지 않도록 바늘을 천천히 제거합니다. 출혈을 방지하기 위해 멸균 마른 면포로 바늘 구멍을 10초 동안 누릅니다. 경혈에 라인을 삽입 한 후 실이 몸 밖으로 나오면 빼내고 다시 수술하십시오.

4. Shenshu (BL 23)에 대한 스레드 임베딩 작업

1. 쥐의 경혈 Shenshu (BL 23)는 제^{2 요추} 에서 5mm 측면에 위치합니다 (그림 2B). 먼저 쥐의 고관절 결절을 기준으로 6^번째 요추를 찾습니다. 그런 다음 4개의 척추체를 위쪽으로 세어 2^번째 요추를 찾습니다. Shenshu (BL 23)는²³ 개의 측면에서 5mm입니다.
   참고: Baihui(GV 20)와 Shenshu(BL 23) 경혈의 조합은 뇌 질환의 예방 및 치료를 위해 중국 전통 의학(TCM) 이론에서 자주 사용되는 세트입니다. 이전 연구^20,21에 의해 확인된 바와 같이, 이 경혈 쌍은 그 효능을 위해 확립되었습니다.
2. 마커를 사용하여 Shenshu(BL 23)를 표시합니다. 트리머(일반적으로 전기 수염 트리머)를 사용하여 쥐의 경혈 주변의 등과 허리 부분을 면도합니다.
3. 수술 전에 0.5% 요오드 용액을 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 도포하여 경혈과 주변 피부를 소독합니다. 그 후, 삼중 소독 과정을 수행하십시오 : 요오드를 세 번 사용한 다음 알코올을 도포하여 적절한 오염 제거 및 무균 기술을위한 현장 준비를 보장합니다.
4. 겸자를 사용하여 식염수에 적신 0.5cm의 흡수성 수술용 봉합사를 집어내고 바늘관의 앞쪽 끝에 놓습니다. 그런 다음 바늘 코어에 연결하십시오.
5. 누르는 손의 검지와 중지 또는 엄지와 검지로 피부를 스트레칭합니다. 구멍을 뚫은 손으로 바늘을 잡습니다.
6. 바늘을 Shenshu (BL 23) 아래 0.25cm 지점에 수직으로 빠르게 삽입합니다. 그림 4A를 참조하십시오.
7. 바늘 끝이 피부 아래 0.5cm에 도달한 후 바늘 끝을 조정하여 삽입 방향을 구심성으로 만들고 피부 표면과 45° 각도를 형성하고 0.5cm를 비스듬히 삽입합니다(그림 4B).
   알림: 신장 근처에 위치한 Shenshu(BL 23)를 바늘로 꿰맬 때 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 바늘을 깊게 삽입하거나 반복적으로 들어 올리고 찌르면 손상될 수 있습니다. 따라서 약 0.3-0.6cm의 삽입 깊이를 권장합니다.
8. 튜브를 집어넣으면서 바늘 코어를 밀어 넣고 0.5cm 흡수성 수술용 봉합사를 경혈의 경혈 근육 조직에 완전히 이식합니다(그림 4C).
9. 봉합사가 노출되지 않도록 바늘을 천천히 빼냅니다. 그런 다음 멸균 건조면으로 바늘 구멍을 10초 동안 눌러 출혈을 방지합니다. 경혈에 라인을 삽입 한 후 실이 몸 밖으로 나오면 빼내고 다시 수술하십시오.

5. 수술 후 관리

1. 수술 후에는 마취 회복을 용이하게 하기 위해 32°C의 온도로 설정된 작은 동물 가열 패드에 쥐를 놓습니다. 동물을 주거 우리로 돌려보내기 전에 동물이 완전히 의식이 있고 상태가 만족스러운지 확인하십시오.
2. 수술 후 일주일 이내에 환부에서 멸균 염증 반응의 징후를 관찰하십시오. 이러한 징후에는 발적, 부기 또는 고름 같은 분비물이 포함될 수 있습니다. 일반적으로 이러한 증상은 치료가 필요하지 않습니다. 그러나 삼출액의 양이 과도하면 환부를 배출하고 소독하십시오. 이런 경우에는 상처가 완전히 회복될 때까지 에리스로마이신 연고를 바르십시오.

6. 행동 검사 및 조직학적 검사

1. 개입 후 8주차에 MWM(Morris Water Maze) 실험 ^2,24를 수행하여 학습 및 기억 능력을 평가합니다. 하루에 4번의 시도로 5일에 걸쳐 학습 시도를 수행합니다. 그런 다음 마지막 취득일로부터 24시간 후에 프로브 시험을 시행합니다.
2. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 비교를 수행합니다. 일원 분산 분석(ANOVA) 및 사후 Tukey의 테스트를 통해 학습 능력의 행동 데이터를 분석합니다. 양방향 ANOVA(Repeated Measure Analysis of Variance)를 통해 이스케이프 대기 시간 데이터의 유의성을 평가한 후 사후 Bonferroni 테스트를 수행합니다. p <0.05 값은 모든 테스트에서 유의한 것으로 간주됩니다.
3. 행동 평가 후 위와 같이 쥐를 마취하고 펜토바르비탈 나트륨 150mg/kg 체중의 복강 내 주사로 안락사시킵니다.
4. 혈관계²⁵를 통해 관류되는 4% 파라포름알데히드를 사용하여 관류를 통해 쥐의 뇌를 고정합니다.
   1. gavage 바늘의 삽입 및 고정
      1. 12G 바늘을 준비하고 바늘이 곧고 쥐의 심실을 통과하기에 적합한지 확인하십시오. 일반적으로 좌심실인 쥐의 심실을 찾아 바늘을 통해 상행 대동맥에 삽입합니다. 이 단계는 쥐의 해부학적 구조에 대한 정밀함과 충분한 이해가 필요합니다.
      2. 바늘이 제자리에 놓이면 지혈제를 사용하여 대동맥에 들어가는 지점 근처에 주사 바늘을 고정합니다. 이렇게 하면 바늘을 고정하고 바늘이 움직이는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
      3. 클램프가 바늘을 단단히 고정할 수 있을 만큼 충분히 조여졌지만 대동맥을 손상시키거나 혈류를 방해할 정도로 조여서는 안 됩니다. 위침은 적절한 관류를 유지하기 위해 시술 내내 상행 대동맥에 남아 있어야 합니다.
   2. 생리식염수를 사용한 관류
      1. 관류를 위해 바늘이 없는 50cc 주사기를 준비합니다. 쥐의 몸 밖에 있는 개비젓 바늘의 다른 쪽 끝을 생리식염수로 채워진 주사기에 부착합니다.
      2. 심장에서 혈액이 흐를 수 있도록 오른쪽 심방 부속기를 약간 절개합니다. 이 단계는 관류 중에 혈액이 식염수로 대체되도록 합니다.
      3. 상행 대동맥에 생리 식염수를 일정하고 일정한 속도로 주입하기 시작합니다. 이렇게 하면 혈액이 씻겨 나가고 조직이 고정될 준비가 됩니다.
      4. 우측 심방 부속기에서 나오는 액체를 모니터링하고 신선한 식염수로 지속적인 관류를 유지하기 위해 필요에 따라 주사기를 교체할 준비를 합니다.
         배치하고 정착액으로 관류할 준비를 합니다.
      5. 식염수가 함유된 주사기를 조직학에서 일반적으로 사용되는 정착제인 4% 파라포름알데히드가 함유된 주사기로 교체합니다. 파라포름알데히드를 사용하여 관류를 진행하여 후속 처리 및 분석을 위해 조직을 제자리에 고정합니다.
         참고: 이 절차 전반에 걸쳐 감염을 예방하기 위해 무균 기술을 유지하고 부상을 최소화하기 위해 쥐를 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 또한 일관성과 효율성을 보장하기 위해 관련된 모든 직원에게 이 기술에 대한 교육을 받아야 합니다.
5. 쥐의 뇌를 제거하고 4 ° C에서 24-48 시간 동안 4 ° C^25,26 동안 4 % 파라 포름 알데히드가 들어있는 표본 병에 넣으십시오. 에탄올 탈수 및 크실렌 처리를 단계별로 수행한 다음 측정을 위해 기존의 연속 코로나 절편(4-5μm)을 수행합니다. Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 염색(200x)을 사용하여 각 그룹에서 해마 뉴런의 형태 및 손실을 평가합니다.
   참고: 위장관(GI) 병변을 평가하기 위한 부검 검사는 실험 기간 동안 위장 장애를 나타내는 임상 징후가 없다는 이유로 설치류에 대해 수행되지 않았습니다. 동물은 그러한 병리의 존재를 암시하는 명백한 부작용을 나타내지 않았다.

Results

이 기사에서는 알츠하이머병 유사 쥐에서 TEAT의 특정 작동 방법을 소개합니다. 향후 연구를 위한 참고 자료를 제공하기 위해 실험 연구에서 TEAT의 중요한 운영 요소에 대해 논의합니다.

TEAT는 알츠하이머병 유사 쥐의 학습을 향상시킵니다.
순서도(그림 5)에서 볼 수 있듯이 적응 훈련 기간 동안 각 그룹의 쥐가 수영하는 동안 주변 환경을 관찰하는 것이 관찰되었습니다. 수영 속도에 대한 분석(그림 6)에서는 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 이동 속도와 시지각의 일관된 기준 수준을 나타냅니다. 실험 결과에서 관찰된 차이는 운동 능력이나 시지각의 변화 때문이 아니었다.

쥐들은 5일간의 플랫폼 탐색 훈련을 받았다. 그림 7A에서 각 쥐 그룹의 이동 궤적이 훈련의 초기 단계와 후기 단계에서 다르다는 것을 관찰할 수 있습니다. 2일째 되던 날, 탈출에 쫓긴 쥐 무리 대부분이 무작위로 헤엄쳤다. 그러나 5일째 되는 날, 대조군의 쥐들은 방향을 따라 헤엄쳤고, 모델 그룹의 쥐들은 수영장 벽을 따라 무작위로 헤엄쳤다. TEAT 그룹 쥐의 움직임은 목표 사분면에서 더 조밀해졌습니다. 이 실험은 탈출 지연 시간을 측정했으며, 대기 시간이 짧을수록 더 강력한 능력을 나타냅니다. 그림 7B 는 모델 그룹이 대조군에 비해 학습 및 기억 능력이 감소했음을 보여줍니다. 그러나 TEAT 그룹은 AD 유사 병리학을 가진 쥐에서 공간 참조 기억 손상이 유의하게 개선되었음을 보여주었습니다.

TEAT는 알츠하이머병 유사 쥐의 공간 기억을 향상시킵니다.
프로브 실험에서, 동물이 시간을 보내는 위치는 공간 편향(spatial bias)을 나타낸다²⁷. 쥐는 플랫폼을 찾기 위해 4가지 주요 방법을 사용한다: 가장자리 기반, 무작위 기반, 추세 기반, 선형 기반²⁸. 그 결과, 각 쥐 그룹이 서로 다른 탐색 전략을 사용했음을 나타낸다(그림 8A). 대조군은 주로 선형 및 방향 탐색 전략을 사용했는데, 이는 강력한 기억력과 플랫폼의 위치를 기억하는 능력을 시사합니다. 대조적으로, 모델 그룹의 쥐는 가장자리와 같은 주요 탐색 전략을 보였는데, 이는 기억 능력이 현저히 감소했음을 나타냅니다. 그들은 연단을 찾는 법이나 승강장의 위치를 기억하는 법을 배우지 못하였다. 젖꼭지 그룹의 쥐는 추세 기반 검색 전략을 보여주었습니다. 궤적 밀도는 원래 플랫폼이 위치한 사분면과 인접한 사분면에서 가장 높았습니다. 이는 모델 그룹에 비해 메모리가 향상되었음을 나타냅니다.

그림 8B 및 그림 8C 는 원래 플랫폼의 사분면에 머문 기간과 쥐가 플랫폼을 건넌 횟수의 결과를 보여줍니다. 모델 그룹 쥐는 대조군에 비해 원래 플랫폼 사분면에서의 체류 시간과 플랫폼을 가로지르는 횟수가 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(p <0.01). 모델 그룹과 비교했을 때, TEAT 그룹 쥐는 원래 플랫폼 사분면에서의 체류 시간과 플랫폼을 가로지르는 횟수에서 유의한 증가를 보였다(p <0.01). 이러한 결과는 TEAT가 AD와 유사한 병리학을 가진 쥐의 공간 학습 및 기억 장애를 개선할 수 있음을 시사합니다.

젖꼭지는 쥐의 해마 노화를 개선합니다(그림 9). 대조군과 비교했을 때, 모델 그룹의 쥐는 피라미드 세포의 수가 현저히 감소하고 불규칙한 배열을 포함하는 심각한 병리학적 변화를 보였습니다. 또한 핵 응축, 신경 세포 퇴화 및 기타 이상이 관찰되었습니다. 그러나 TEAT 처리 후 쥐의 해마 피라미드 세포의 수가 증가하고 더 조직화되었습니다. 일부 핵에서 응결이 나타났지만, 전체적인 세포 형태는 더 정상으로 보였다. 세포는 더 조밀하게 분포되고 정렬되었으며, 세포질 염색은 더 일관되었으며, 세포를 둘러싼 부종이 현저히 감소했습니다. 특히 정상적인 피라미드 세포가 관찰되었습니다.

그림 1: 실험의 흐름도. 적응 1주일(0주차) 후 연구는 18마리의 쥐를 대조군, 모델 및 TEAT의 세 그룹으로 할당했습니다. 1주에서 7주 동안 대조군은 식염수 주사를 받았고, 모델 그룹과 TEAT 그룹은 D-갈락토스를 투여했습니다. TEAT 그룹은 추가로 2주, 4주, 6주차에 실 삽입 침 요법을 받았습니다. 모든 쥐는 8주차에 Morris water maze 테스트를 받은 후 안락사를 받았습니다. 약어: Adapt = 적응, Con = 대조군, Mod = 모델 그룹, TEAT = Thread-embedding 침술 요법 그룹, D-gal = D-galactose, MWM = Morris water maze test. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 경혈의 위치. (A) 쥐의 경혈 Baihui (GV 20). 두정골의 오른쪽 중간 지점에 위치합니다. (B) 쥐의 경혈 Shenshu (BL 23). 두 번째 요추에서 측면으로 5mm 떨어져 있습니다. 약어: GV = Governor Vessel, 중국 전통 의학(TCM)의 개념으로 신체의 후방 측면의 정중선을 따라 이어지는 주요 경락을 지칭하는 BL = Bladder는 Bladder Meridian의 약자로, TCM에서 몸과 다리의 뒤쪽을 따라 이어지는 6개의 양 경락 중 하나인 Foot-Taiyang 경락에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Baihui(GV 20)의 자세한 스레드 임베딩 작업. (A) 바늘은 Baihui(GV 20) 경혈에서 0.1cm 아래 피부 표면에 15° 각도로 수평으로 삽입하고 시술을 용이하게 하기 위해 피부를 꼬집습니다. (B) 바늘 끝이 Baihui(GV 20) 경혈에서 0.1cm 위에 도달하면 바늘 튜브를 집어넣으면서 바늘 코어를 밀어 0.2cm의 흡수성 수술용 봉합사를 경혈의 피하 조직에 완전히 이식합니다. 약어: GV = Governor Vessel, 중국 전통 의학(TCM)의 개념으로, 신체의 후방 측면의 정중선을 따라 이어지는 주 경락을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: Shenshu(BL 23)의 자세한 스레드 임베딩 작업. (A) 바늘은 Shenshu (BL 23) 아래 0.25cm 깊이까지 경혈에 수직으로 빠르게 삽입됩니다. (B) 바늘 끝이 피부 표면 아래 0.5cm 깊이에 도달하면 바늘을 경혈 중앙으로 방향을 바꾸어 피부와 45° 각도를 만든 다음 0.5cm 깊이까지 비스듬히 삽입합니다. (C) 바늘 축이 전진하는 동안 튜브를 수축시켜 0.5cm 부분의 흡수성 수술용 봉합사가 Shenshu(BL 23) 경혈. 약어: BL = Bladder, Bladder Meridian의 약자로, TCM에서는 몸과 다리의 뒤쪽을 따라 흐르는 6개의 양 경락 중 하나인 Foot-Taiyang 경락에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: WMW 테스트의 순서도. 실험 전의 적응 훈련은 Day 0으로 표시되며, 이 기간 동안 쥐의 운동 능력을 관찰하고 수영 속도를 통계적으로 분석합니다. 그 다음에는 5일간의 장소 탐색 단계(1일에서 5일까지)가 이어지며, 여기서 탈출까지의 지연 시간(이스케이프 지연 시간)을 서로 다른 그룹 간에 비교하고 분석합니다. 6일차에는 목표 사분면(목표 사분면 체류 시간)에서 소요된 시간과 플랫폼 교차 횟수를 평가하기 위해 공간 프로브 시험이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 그룹 간 수영 속도(m/s) 비교. 이 그림은 각각 6마리의 동물(n=6)로 구성된 다양한 실험 그룹에 걸쳐 쥐의 평균 수영 속도(초당 미터)를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 보여줍니다. ns(p > 0.05)로 표시된 바와 같이 그룹 간 차이는 얻어지지 않았습니다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 실행되었으며 모든 데이터는 정규 분포를 따랐습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: WMW의 장소 탐색 결과 (A) 이 패널은 장소 탐색 시험 동안 각 실험 그룹 내 쥐의 이동 경로를 보여주는 대표적인 운동 궤적 다이어그램을 제시합니다. (B) 초 (s) 단위로 측정 된 탈출 대기 시간은 각 그룹이 6 마리의 쥐 (n = 6)로 구성된 그룹 전체에서 비교됩니다. 통계 분석은 항행 시험 과정에서 피험자 내 효과와 그룹 간 피험자 간 차이를 평가하기 위해 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 정규 분포 가정을 따르며 그룹 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 대조군과 비교했을 때 별표(*p < 0.05, **p < 0.01)와 모델군에 비해 해시태그(#p < 0.05, ##p < 0.01)로 유의한 차이를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: WMW의 프로브 트레일 결과. (A) 패널은 각 실험 그룹 내의 프로브 시험에서 쥐의 공간 탐색 행동을 캡처하는 대표적인 운동 궤적 다이어그램을 표시합니다. (B) 이 그래프는 그룹 간의 대상 사분면 내의 체류 시간(초, s)을 비교하여 플랫폼 위치에 대한 쥐의 메모리 보유를 반영합니다. (C) 이 그래프는 쥐가 플랫폼 영역을 가로지르는 빈도(freq)를 보여주며, 이는 쥐의 공간 기억 성능을 나타냅니다. 각 그룹은 6마리의 쥐(n=6)로 구성되었으며, 데이터는 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 일원 분산 분석을 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. 데이터는 정규 분포를 따르며 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 대조군과 비교했을 때 별표(**p < 0.01)와 모델군에 비해 해시태그(#p < 0.05, ##p < 0.01)로 유의한 차이를 알 수 있습니다. **P < 대조군 대비 0.01, 모델 그룹 대비 #P < 0.05, 모델 그룹 대비 ##P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 200배 확대하여 쥐 그룹의 해마 CA1 영역에 대한 Hematoxylin 및 Eosin 염색 평가. (A) 대조군은 잘 보존된 피라미드 세포를 가진 전형적인 신경 구조를 나타냅니다. (B) 모델 그룹은 피라미드 세포의 밀도의 현저한 감소, 어둡게 염색된 퇴행성 뉴런 및 무질서한 배열을 특징으로 하는 뚜렷한 병리학적 변화를 표시합니다. (C) 젖꼭지 그룹은 더 질서 정연하고 더 규범적인 형태를 가진 피라미드 세포의 수가 증가함에 따라 향상된 해마 구조를 보여줍니다. 간헐적인 핵 응축에도 불구하고 세포는 더 조밀하게 채워져 있고 균일한 세포질 염색을 나타내며 세포 주위 부종이 크게 감소합니다. 규범적 피라미드 세포의 존재가 눈에 띄게 관찰됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

개입 시간
알츠하이머병의 병인은 복잡하며, 발병 기전은 여전히 불확실합니다. 현재로서는 이 병에 대한 효과적인 치료법이 없으며, 병의 경과는 돌이킬 수 없습니다. 따라서 학계에서는 알츠하이머병의 예방과 치료에 초점을 맞추는 것이 중요하다는 데 의견이 일치하게 되었습니다. 알츠하이머병의 예방 및 치료 전략은 조기 개입을 강조하며, 상태가 발생하기 전에 치료한다는 한의학 개념에 따라 발병, 전염 및 재발 전에 치료를 강조합니다. 인간^(29,30)과 설치류^(31,32)에 대한 축적된 연구는 조기 침술 및 뜸 중재가 명백한 부작용 없이 유의미한 결과를 얻을 수 있음을 보여주었으며, 이는 알츠하이머병을 예방하고 치료하는 유망한 잠재적 방법이다. 따라서 본 연구는 모델링 과정에서 치료를 시행하였다. TEAT는 D-gal 복강 내 주사 초기에 구현되었습니다.

경혈 선택
알츠하이머병은 주로 기억력, 언어, 추론 및 사회적 행동을 담당하는 뇌 영역에 영향을 미치는 심각한 신경퇴행성 질환입니다. 한의학에서는 뇌(Nao)를 골수(Sui)의 바다로 여긴다. 골수(Sui)는 한의학에서 독특한 물질인 정수(Jing)로 이루어져 있으며, 이는 신체의 필수적인 체질적 힘, 활력 및 저항력으로 여겨집니다. 본질 (Jing)는 신장 (Shen)에서 주로 저장됩니다. 신장 정수(Shen Jing)가 약하면 뇌(Nao)에 영양이 부족하고 인지 장애가 발생할 수 있습니다. 따라서 한의학은 신장을 튼튼하게 하고 에센스(Jing)에 유익을 주는 것이 뇌 기능을 향상시키는 데 도움이 될 수 있다고 제안합니다. 뇌는 GV(Governor vessel)와 BL(Bladder Meridian of foot Taiyang)과 같은 특정 경락이 뇌로 들어갈 때 직접적인 영향을 받을 수 있습니다. 알츠하이머병 예방 및 치료에 사용되는 주지사 혈관(GV)과 발 태양의 방광 경락(BL)의 조합은^33,34에 많이 활용됩니다. Baihui (GV 20)는 머리의 꼭지점에 위치한 경혈이며 Governor 용기의 일부입니다. 문헌에 따르면 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위해 침술과 뜸을 사용한 연구에서 Baihui(GV 20)는 발생 빈도가 가장 높으며 공식³⁵에서 임계점으로 간주됩니다. Shenshu (BL 23)는 발 Taiyang의 방광 경락에있는 경혈입니다. 그것은 두 번째 요추의 가시 돌기의 아래쪽 경계에서 1.5 cun 측면에 위치합니다. 신장 다시 수송 Shu 점으로 신장 음, 양, 본질 (Jing) 및 기를 포함한 신장의 모든 측면을 강화할 수 있습니다. Baihui(GV 20)와 Shenshu(BL 23)에서의 침 치료와 뜸은 다양한 방법으로 인지 기능을 개선하고 AD 증상을 완화할 수 있다^36,37.

인터벌 시간
TEAT³⁸ 의 운영 표준은 치료 간격과 치료 과정이 질병의 상태와 선택한 수술 부위에 따라 결정되어야 하며 1주일에서 1개월 간격으로 결정되어야 한다고 규정하고 있습니다. 치료 과정은 1회에서 5회까지 다양합니다. 이 제안은 실험 동물 연구에서도 따를 수 있습니다. 문헌³⁹에 따르면, 치료는 일반적으로 일주일에 한 번 또는 2주에 한 번씩 시행되며, 대부분의 증례는 4-8회 연속 치료를 포함한다. 실험은 49일 동안 지속되었으며, 그 동안 실은 14^일, 28^일, 42^{일에 묻} 혔습니다.

도구 및 방법
현재 실험 동물 연구에는 다양한 스레드 임베딩 도구가 사용됩니다. 여기에는 No. 7⁴⁰ 또는 No. 9⁴¹ 일회용 실 매립 바늘, 자체 재발명 바늘 및 No. 12 요추 천자 바늘⁴²가 포함됩니다. 자체 발명 된 바늘은 5-7 번 주사기를 튜브로 사용하고 바늘 코어에 적합한 선모 바늘을 사용합니다. 바늘 끝은 미리 매끄럽게 다듬어져 있습니다. 예를 들어, 체중이 250 ± 20g인 SD 쥐를 사용한 연구에서 (텍스트에 명시되지 않은 월 나이) No.7 주사기와 0.30 x 0.40 mm filiform needle^43,44를 선택합니다. 그러나 스스로 재발명한 바늘은 엄격하게 소독해야 하기 때문에 널리 사용할 수 없습니다. 바늘 끝이 너무 크거나 날카로우면 혈관과 신경을 손상시켜 타박상을 입을 가능성이 높아질 수 있습니다⁴⁵. 요추 천자는 직경이 크고 끝이 뾰족한 것으로 혈관과 신경을 손상시킬 가능성이 높습니다. 일회용 매몰 바늘은 임상 실습에서 가장 많이 사용됩니다³⁹. 자체 발명 된 바늘 및 요추 천자 바늘에 비해 사용이 편리하고 작동이 안전하여 TEAT에 이상적입니다. 또한 실험의 목표는 인간의 건강을 개선하는 것입니다. 따라서 동물실험은 임상적 상황을 반영해야 합니다. 따라서 일회용 실 매매 바늘을 실 매립 도구로 사용하는 것이 좋습니다.

Catgut은 TEAT에 사용되는 주요 실 재료였지만 조직 거부 반응 및 동물 유래 성분으로 인해 생합성 흡수성 수술용 봉합사로 대체되었습니다. 봉합사는 다양한 크기로 제공되며 4-0 또는 3-0 봉합사의 경우 7번과 같이 바늘과 일치해야 합니다. 동물 연구에서는 주로 3-0⁴¹, 4-0⁴⁶ 및 5-0⁴⁷ 이 사용됩니다. 대부분의 봉합사는 1-2cm 길이입니다. 그러나 설치류는 인간보다 몸이 훨씬 작기 때문에 몸 크기에 맞는 적절한 크기가 부족합니다. 따라서 연구자들은 봉합사를 설치류에 적합하도록 0.2-0.5cm 조각으로 잘라야 합니다. 따라서 봉합사를 절단한 후 나중에 사용하거나 즉시 적용하기 위해 담그기 전에 깨끗하고 멸균된 증류수 또는 식염수로 헹구는 것이 좋습니다⁴⁶.

일부 연구에서는 경혈 아래 약 0.5cm에서 경혈⁴⁸을 향해 경혈에 바늘을 빠르게 삽입하는 것과 같은 임베딩 방법에 대한 자세한 요구 사항을 제안했습니다. 이것은 설치류가 작기 때문에 중요합니다. 하지에는 근육 조직이 풍부할 뿐만 아니라 머리, 등, 복부의 피하 조직과 근육층이 상대적으로 약합니다. 따라서 동물 연구에서 TEAT의 삽입 지점과 삽입 각도에 대한 문제가 강조될 필요가 있습니다. 설치류의 하지에 젖꼭지를 수행 할 때 경혈에 직접 바늘을 꽂을 수 있습니다. 신체는 내장의 손상을 피하기 위해 사선 니들 링 (<45 °) 또는 플랫 니들 링 (<15 °)을 사용하여 경혈 아래에 바늘을 삽입하는 것이 좋습니다 (실 몸체의 길이에 따라 거리를 유연하게 조정할 수 있습니다).

알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 TEAT의 잠재력
최근 TEAT에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 그 효과와 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 위에서 언급한 바와 같이, 젖꼭지는 비만^13,14, 당뇨병¹⁵, 불면증¹⁶, 폐경 후 골다공증¹⁷, 우울증¹⁸과 같은 알츠하이머병 관련 위험인자를 개선할 수 있다. 그것은 성병 쥐¹⁹의 학습 및 기억 장애에 유익한 효과가 있습니다. TEAT는 PPAR 경로를 통해 지질 대사를 조절하여 운동에 의해 유발된 피로된 쥐(⁴⁹)에서 조직 손상을 개선하고, TRPV1 경로(⁵⁰)를 통해 간헐적인 추위 스트레스 유발 마우스에서 항염증 및 진통 효과를 발휘한다. 본 연구에서 우리는 AD와 같은 쥐에 대한 실 삽입 치료가 공간 기억 상실을 개선하고 해마 CA1 영역의 퇴화 세포를 감소시켜 학습 및 기억 장애를 완화할 수 있음을 입증했습니다. 그러나 현재 연구는 임베딩 방법, 임베딩 도구, 스레드 및 임베딩 간격 기간을 포함하여 TEAT 작동의 여러 중요한 요소에서 통일성과 표준화가 부족하기 때문에 이 기사에서는 주로 실험 연구에서 TEAT의 중요한 운영 요소에 대해 논의합니다. 이 연구는 TEAT가 AD에 미치는 영향에 대한 예비 탐색일 뿐이며, 정확한 분자와 이들 간의 상호 작용을 명확히 하는 데 훨씬 더 많은 보완과 개선이 필요했습니다. 그럼에도 불구하고, 이 판결은 불가피한 알츠하이머병 과정에 대한 새로운 시도를 제공했으며, 이는 공공 의료 시스템의 무거운 부담을 어떻게든 덜어줄 수 있을 것이다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 식염수, 4% 파라포름알데히드, 헤마톡실린, 에오신 Y(수용성), 절대 에탄올, 0.01M PBS 분말, 자일렌, 염산, 내장 파라핀, 중성 검	시노팜(www.sinopharm.com)
5-0 흡수성 외과용 봉합	보다메디컬(www.bodamedical.com)
70% 알코올, 요오드포, 면봉			소독에 사용됩니다.
클로랄 수화물	시그마	C8383
커버 슬립, 유리 슬라이드	Guangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
탈수기	Wuhan Junjie JT-12J 컴퓨터 생물학적 조직 탈수기
디럭스 온도 조절기 열 매트	Zhenhua 기기		쥐의 체온 유지용.
D-galactose	sigma	G0750
전기 남성용 수염 트리머			쥐 면도에 사용됩니다.
작은 동물을 위한 전자 저울 (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
에리스로마이신 연고	앞 유리
접시			절단 흡수성 봉합사를 배치하는 데 사용됩니다.
고압 증기 살균 냄비 (YM100Z)	상하이 Sanshen 의료 장비 공장		수술 기구의 살균용.
제빙기 (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
현미경 (BX-53)	OLYMPUS
분유			MWM 테스트에 사용됩니다.
Morris Water Maze 비디오 추적 시스템 및 데이터 분석 소프트웨어 (버전: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 실 임베딩 바늘	보다의료 (www.bodamedical.com)
안과 가위, 트레이, 핀셋
병리학 마이크로톰  (RM 2016)	LEICA, 독일
펜토바르비탈	독일	P11011
영구 마커			경혈을 표시하는 데 사용됩니다.
슬라이싱 나이프 (R35)	깃털, 일본
비누			손을 씻을 때 사용합니다.
멸균 장갑