박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델
이 논문에서
요약
초록
박테리오파지(파지)는 종 및 균주 수준의 특이성을 가진 박테리아를 감염시키는 바이러스이며 알려진 모든 생태계에서 가장 풍부한 생물학적 개체입니다. 장내 미생물군에서 발견되는 것과 같은 박테리아 군집 내에서 파지는 미생물군 개체군 역학을 조절하고 박테리아 진화를 주도하는 데 관여합니다. 지난 10년 동안 파지 연구에 대한 관심이 다시 높아졌는데, 이는 부분적으로 항생제 내성 박테리아의 증가하는 위협에 대응할 수 있는 유망한 도구를 제공하는 용해 파지의 숙주 특이적 살상 능력 때문입니다. 또한, 파지가 장 점액에 달라붙는다는 것을 입증한 최근 연구는 파지가 박테리아가 하부 상피로 침입하는 것을 방지하는 보호 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 박테리아 마이크로바이옴과 마찬가지로 파괴된 파지오메는 염증성 장 질환과 같은 질병의 악화된 결과와 관련이 있다는 것입니다. 이전 연구에서는 파지가 분변 여과액 이식을 통해 동물과 인간의 마이크로바이옴을 조절하여 숙주의 건강에 도움이 될 수 있음을 입증했습니다. 이러한 최근의 연구의 물결로 인해 장내 마이크로바이옴의 맥락에서 파지를 연구하기 위한 프로토콜을 수립하고 표준화해야 할 필요성이 대두되고 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 위장관의 맥락에서 분리된 T4 파지와 박테리아 숙주인 대장균을 연구하기 위한 일련의 절차를 제공합니다. 여기에 설명된 방법은 파지 용해물에서 시작하여 마우스에 투여하고 박테리아 숙주 및 파지 수준에 대한 영향을 평가하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 변형되어 다른 파지-박테리아 쌍에 적용될 수 있으며 생체 내에서 숙주-파지 역학을 연구하기 위한 출발점을 제공합니다.
서론
박테리오파지(Bacteriophage) 또는 파지(phage)는 종 및 균주 수준 특이성을 가진 박테리아를 감염시키고 죽이는 바이러스입니다1. 파지는 장내 미생물군(gut microbiota)과 같은 복잡한 박테리아 군집 내에서 중요한 역할을 하며, 개체군 역학을 조절하고 박테리아 적합성을 촉진하는 데 관여한다2. 지난 10년 동안 항생제 내성 병원체3의 증가와 대체 치료 전략으로서의 파지 요법의 잠재력으로 인해 파지 연구에 대한 관심이 다시 높아졌습니다. 최근 몇 년 동안 용해 파지 칵테일은 인간의 심각한 항생제 내성 세균 패혈증 감염에 어느 정도 성공을 거두면서 정맥 주사로 사용되었습니다 3,4. 경구 파지 요법은 또한 장 감염 및 염증을 치료하기 위한 항생제의 잠재적인 대안으로 제안되었습니다. 또한, 파지는 박테리아를 제거하기 위해 여과된 분변 미생물군 제제인 분변 여과물 이식(FFT)의 성공과 관련이 있으며, 재발성 클로스트리디오이데스 디피실 감염(rCDI)5,6
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험은 UBC 동물 관리 위원회 및 생물 안전 위원회가 승인한 프로토콜(A23-0113, B19-0038)에 의해 설정된 지침에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 브리티시 컬럼비아 대학의 질병 모델링 센터(Center for Disease Modelling)에서 병원체가 없는 조건에서 수용되었습니다. C57BL/6 마우스는 멸균 마우스 식단, 물, 침구 및 둥지 재료가 제공된 멸균 플렉시블 필름 아이솔레이터에서 시설 내에서 사육되었습니다. 마우스는 12시간 주야간 주기로 유지하였다. 실험용 마우스(수컷과 암컷 모두)는 각 실험 내에서 연령이 일치되었으며, 생후 6주에서 12주 사이이고 모든 실험에서 체중은 15-30g이었습니다.
1. 마우스로의 구강 개변을 위한 파지 및 차량 용해물의 제조
- 파지 정제 및 스톡 생성
참고: 이 연구에서 T4 파지는 아래에 설명된 단일 한천 층 방법을 사용하여 박테리아 잔디밭에 도금하여 성장하고 적정됩니다. 이중 한천층 방법은 이전에 설명했습니다25,27또한 유사한 효능으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 단일 한천층 분....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
쥐 장에서 T4 파지/대장균 다이아드 사이의 상호작용을 조사하기 위해 T4 파지와 차량 용해물을 준비, 세척 및 정제했습니다(그림 1A). T4 파지 용해물을 플라크 분석으로 적정하고 SM 완충액에서 2 x 107 pfu/mL(2 x 106 pfu/mouse)로 희석했습니다. 또한 비히클 용해물을 역정하여 생존 가능한 파지 존재가 없음을 확인하고 T4 파지 용해물과 동일한 부피의 SM 완충액에 희석했습니다. 내독소 수준은 발색 내독소 정량 키트를 사용하여 희석된 용해물에서 정량화되었습니다. T4 파지, 열 불활성화 파지 및 차량 용해물은 내독소 수치가 음용수에 허용되는 수준(<20EU/mL)보다 낮았습니다.25(그림 1B). 차량 용해물은 T4 파지 용해물과 유사한 양의 내독소를 가지고 있었기 때문에 적절한 대조군으로 간.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
마이크로바이옴의 파지 연구는 박테리아 파지에 비해 상당한 도전 과제를 제시합니다. 특히, 파지는 원핵생물 및 진핵생물 종의 시퀀싱 및 식별을 용이하게 하는 16S 및 18S 리보솜 소단위체와 유사한 모든 파지에 공통적인 보존된 계통발생학적 마커를 각각 포함하지 않는다(42). 그러나 판독 길이, 처리량 증가 및 비용 절감을 포함한 차세대 염기서열 분석 접근법의 발전으로 박테리오파지 게놈 데이터베이스의 급속한 확장이 이루어졌습니다 42,43,44. 파지 발견에 대한 많은 기초 작업이 잘 진행됨에 따라 파지 연구에 그 어느 때보다 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 장내 마이크로바이옴의 핵심 구성원이자 지구상에서 유전적으로 가장 다양한 유기체인 파지는 마이크로바이옴의 복잡성을 조사하는 새로운 연구를 위한 흥미로운 관점을 제시합.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 이 연구를 수행한 땅이 xwməθkwəy̓əm(Musqueam) 국가의 전통적이고 조상적이며 미개척된 영토임을 인정합니다. 그것이 위치한 땅은 수천 년 동안 이 사이트에서 한 세대에서 다음 세대로 문화, 역사 및 전통을 전해 온 Musqueam 사람들에게 항상 배움의 장소였습니다. 우리는 다른 사람들이 https://native-land.ca 에서 살고 일하는 고향에 대해 더 많이 배우도록 권장합니다. 저자는 캐나다 자연 과학 및 공학 위원회(NSERC) 캐나다 대학원 장학금 - 석사(NP), Michael Smith Health Research BC 연수생 상(RT-2023-3174, MH), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 디스커버리 보조금 프로그램(RGPIN-2019-04591 to C.T., RGPIN-2016-04282 to LCO), Canadian Institute for Advanced Research/Humans and the Microbiome(FL-001253 Appt 3362, C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award(18239, C.T.), Canadian Institutes for Health Research(PJT-159458 to LCO) 및 Canadian....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-옥탄올 (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip 멸균 일회용 진공 청소기 필터 유닛 | Millipore Sigma | ||
| 아가로스 (저-EEO/다목적/분자 생물학 등급) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 원심 필터 장치, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® 튜브, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion 밀폐 케이지(ISO 케이지) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 터치&트레이드; 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (백색 결정에서 분말로) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| 캡 잠금 장치 1.5ML 튜브 100/pk | Andwin Scientific | ||
| 클로로포름 (방부제 / 인증 된 ACS로서의 에탄올) | Fisher | C298-500 | |
| 구리 코팅 강철 구슬 (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & 티슈 키트 (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR 마스터 믹스 (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 디소듐 염 용액, 분자 생물학용, H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents&trade에서 0.5M; 한천, 분말 / 플레이크, 피셔 BioReagents™ | Fisher BioReagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ 미생물학 매체: LB 육수(분말) - Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR 믹스, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA 필터는 isocage 뚜껑, ISO 라인-조사된 | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 인큐베이티드 쉐이커 | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| 미생물학 매체: LB 국물 (분말) - Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 잠금 스냅 캡, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| 파라필름 밀봉 필름 | Bemis | PM-996 | |
| Phage 주식 | Carolina Biological Supply | 해당 없음 | |
| PicoLab® 마우스 다이어트 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| 피어스&트레이드; 발색 내독소 퀀트 키트 | Thermo Scientific | ||
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 소듐 바이카보네이트 (파인 화이트 파우더) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| 소듐 클로라이드 (결정질/인증 ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (프로브 모델 CL-18; 전원 소스 모델 FB50) | Fisher scentific | N/A | |
| 멸균 유연한 필름 아이솔레이터 | 클래스 생물학적으로 깨끗한 | 해당 없음 | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 열 순환기 | BioRad | 1861096 | |
| T4 파지 프라이머, 포워드 (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 파지 프라이머, 포워드 (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | 키아겐 | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M 용액, pH 8.0, 분자 생물학 등급, 초순수 | Thermo Scientific | ||
| 물, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
참고문헌
- Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
- Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
- Gor....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
