방법 논문

Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드

DOI:

10.3791/65912

⸱

2024년 6월 21일

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수정체 상피세포(LEC)는 수정체의 항상성과 정상적인 기능을 유지하는 데 여러 가지 중요한 역할을 합니다. LEC는 렌즈의 성장, 발달, 크기 및 투명도를 결정합니다. 반대로, LEC의 기능 장애는 백내장 형성 및 후낭 혼탁(PCO)으로 이어질 수 있습니다. 따라서 강력한 1차 LEC 배양 시스템을 구축하는 것은 수정체 개발, 생화학, 백내장 치료제 및 PCO 예방에 종사하는 연구자에게 중요합니다. 그러나 1차 LEC를 배양하는 것은 제한된 가용성, 느린 증식 속도 및 섬세한 특성으로 인해 오랫동안 어려움을 겪어 왔습니다.

이 연구는 1차 LEC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시함으로써 이러한 장애물을 해결합니다. 이 프로토콜은 최적화된 배양 배지의 제형화, 렌즈 캡슐의 정확한 분리, 트립신화 기술, 하위 배양 절차, 수확 프로토콜, 보관 및 배송 지침과 같은 필수 단계를 포함합니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 모니터링했습니다.

배양된 LEC의 진위를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 중요한 수정체 단백질, 즉 αA- 및 γ-결정체의 존재 및 세포 내 분포를 검출했습니다. 이 상세한 프로토콜은 연구자들에게 일차 LEC를 배양하고 특성화하는 데 유용한 자원을 제공하여 수정체 생물학에 대한 이해와 수정체 관련 질환에 대한 치료 전략 개발을 가능하게 합니다.

서론

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눈의 수정체는 들어오는 빛을 망막에 집중시킴으로써 시력에 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 특수 세포로 구성된 투명한 무혈 구조로 구성되어 있으며, 그 중 수정체 상피 세포(LEC)가 핵심 역할을 합니다. LEC는 수정체의 전면에 위치하며 수정체의 투명성을 유지하고, 수분 균형을 조절하며, 수정체의 성장과 발달에 관여하는 역할을 합니다 1,2. LEC는 수정체의 앞쪽에 위치한 독특한 유형의 세포로, 평생 동안 수정체 섬유를 지속적으로 생산하여 수정체의 선명도와 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

백내장은 수정체가 점진적으로 흐려져 빛의 왜곡과 산란을 일으켜 시력을 손상시키는 것이 특징입니다 3,4. 백내장 형성의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 복잡하고 다인자적이며, 자외선, 산화 손상 및 당화와 같은 다양한 세포 및 분자 과정을 포함합니다 5,6. LEC는 백내장의 발병에 크게 기여하는 것으로 밝혀져 연구의 중요한 초점이 되고 있습니다 1,2,7,8,9.

또한 오늘날 안과에서 가장 시급한 문제 중 하나는 이차성 백내장이라고도 하는 후낭 혼탁(PCO)의 발생률이 상대적으로 높다는 것입니다. 다낭성 난소 증후군은 백내장 수술 후 가장 흔한 합병증으로, 수술 후 5년 이내에 성인 환자의 최대 20-40%, 소아 환자의 100%에 영향을 미친다10. PCO는 주로 백내장 적출 후 수정체 주머니에 남아 있는 잔류 LEC에 의해 발생합니다. 이 세포들은 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)뿐만 아니라 LEC에서 수정체 섬유로의 분화를 포함하는 다면적인 병태생리학적 변형을 겪으며, 그 결과 LEC, 섬유 및 근섬유아세포가 혼합된 세포 집단이 생성됩니다 11,12,13. 형질전환된 세포는 수정체 후낭을 가로질러 증식하고 이동하여 시각 장애를 일으킵니다. 배양 모델에서 LEC의 행동 및 제어 메커니즘을 이해하면 PCO의 예방 및 관리에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 따라서 LEC를 배양하는 이 프로토콜은 이 만연한 수술 후 합병증을 연구, 이해 및 궁극적으로 퇴치하는 것을 목표로 하는 안과 연구자에게 중요한 도구를 제공합니다.

LEC 생물학의 복잡성과 백내장 형성 및 PCO에서의 LEC 생물학의 역할을 밝히기 위해서는 견고하고 재현 가능한 in vitro 1차 세포 배양 시스템을 구축하는 것이 필수적입니다. 1차 LEC 배양은 연구자에게 LEC의 기능, 신호 전달 및 분자 특성을 연구할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 또한 세포 과정과 다양한 실험 조건의 영향을 조사할 수 있어 수정체 생리학 및 병리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

선행 연구는 LEC 배양 기법에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했다 14,15,16,17,18,19,20. 이러한 연구는 다양한 방법론을 사용하고 LEC 행동 및 특성에 대한 중요한 결과를 도출했지만 LEC 배양을 위한 포괄적이고 접근 가능한 비디오 녹화 프로토콜은 현재 문헌에 없습니다. 이러한 제한은 초보 연구자가 기술을 정확하게 재현하는 데 방해가 될 수 있으며 실험 결과의 불일치 및 변동으로 이어질 수 있습니다. 이 연구 논문은 비디오 녹화 프로토콜을 제공함으로써 이러한 격차를 해소하고 LEC 문화 분야에서 재현성을 높이고 지식 전달을 촉진할 수 있는 표준화된 리소스를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 지침에 따라 수행되었습니다. 절차적 승인은 University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: IACUC-2022-0008)에서 부여했습니다. 일반적으로 생후 2주 미만의 어린 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.

1. 배양액 준비 및 수정체 해부

  1. 50mL의 소 태아 혈청(FBS)과 0.1mL의 겐타마이신 50mg/mL를 DMEM 450mL에 첨가하여 배양 배지를 준비합니다.
  2. 2주 미만의 C57BL/6J 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.
    참고:CO2 흡입 방법을 사용하여 안락사시켰습니다. CO2 안락사 시스템의 최적 유속은 챔버 또는 케이지 부피/분의 30%에서 70%를 변위시켜야 합니다.
  3. 수술용 가위로 눈꺼풀을 부드럽게 제거하고 눈구멍의 반대쪽에 구부러진 핀셋으로 섬세한 압력을 가하여 눈이 바깥쪽으로 튀어나오도록 합니다. 백내장 칼을 사용하여 각막을 조심스럽게 절개하고 구부러진 핀셋을 사용하여 수정체를 조심스럽게 빼내어 수정체나 캡슐이 손상되지 않도록 합니다.
    알림: 렌즈 캡슐의 무결성을 유지하기 위해 이 단계를 수행하는 동안 주의하십시오. 렌즈의 섬세한 특성으로 인해 렌즈 손상 위험을 최소화하기 위해 끝이 구부러지고 뭉툭한 해부 도구를 사용하는 것이 중요합니다.
  4. 끝이 뭉툭한 곡선형 핀셋을 사용하여 10μg/mL 겐타마이신이 함유된 5mL의 예열 및 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 용액으로 채워진 60mm 플라스틱 조직 배양 접시에 렌즈를 옮깁니다.
  5. 10μg/mL 겐타마이신이 함유된 DPBS 용액으로 렌즈를 부드럽게 헹구어 잠재적인 이물질이나 오염 물질을 제거하고, 추가 처리를 위해 렌즈를 준비하고, 멸균 배양 환경을 유지합니다.
  6. 적절한 수의 LEC를 얻으려면 24-well 배양 플레이트에 4개의 렌즈를 풀링하고 6-well 배양 플레이트에 6개의 렌즈를 풀링합니다.

2. LEC 격리

  1. 헹굼 과정이 끝나면 렌즈를 여과지 위에 올려 건조시킵니다.
  2. 렌즈가 충분히 건조되면 렌즈 캡슐 제거를 준비하기 위해 페트리 접시의 덮개에 조심스럽게 옮깁니다.
  3. 렌즈를 위쪽으로 돌려 앞쪽 부분이 위쪽을 향하도록 합니다. 핀셋을 사용하여 전방 캡슐을 잡는 동안 주로 사용하는 손에 캡슐 헥시스 겸자를 사용하여 캡슐에 작은 찢어짐을 만듭니다. 두 도구를 반대 방향으로 부드럽게 당겨 캡슐을 제거하고 모든 수정체 박리가 완료될 때까지 DPBS에 넣습니다.
    참고: 불일치를 피하기 위해 연구자들은 각 수정체 상피 캡슐을 즉시 절개하고 DPBS에 임시로 보관해야 합니다. 모든 해부를 완료한 후에만 캡슐을 37°C로 유지되는 트립신으로 집합적으로 옮겨 동기화되고 균일한 노출을 보장합니다.
  4. 렌즈 캡슐을 6웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 각 웰에 0.05% 트립신 용액 1mL를 추가하여 효소 분해 과정을 시작합니다.
  5. 트립신 용액을 부드럽게 저어 균일한 투과를 보장합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 캡슐을 37°C에서 8-10분 동안 분해합니다.
    참고: 이 단계는 수정체 캡슐 조직의 분해와 개별 상피 세포의 후속 방출을 용이하게 합니다.
  6. 배양 후 소화된 수정체 캡슐을 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 다져 남아 있는 조직 덩어리를 분해하고 세포 분리를 촉진합니다.
    참고: 소화된 렌즈 캡슐에서 효율적인 세포 방출을 보장하기 위해 조직 다질의 철저함이 강조됩니다.
  7. 트립신을 담금질하기 위해 10% FBS가 함유된 배양 배지 0.5mL를 추가합니다. 조직 샘플을 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 의 속도로 5분 동안 원심분리합니다.
  8. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 1mL의 배양 배지를 사용하여 세포를 재현탁시키고 24웰 플레이트에 세포를 시드합니다.
  9. 배양 배지는 2-3일마다 교체합니다.

3. LEC 서브컬쳐

  1. 세포가 합류하면 배양 접시에서 배지를 제거합니다. 1mL의 DPBS로 세포를 2번 세척합니다.
  2. 200μL의 트립신-EDTA 용액을 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
  3. 배양 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 현미경으로 검사하여 배양 접시에서 분리되어 부유하기 시작했는지 확인합니다.
  4. 배양 배지 1mL를 추가하고 세포를 3-5배 부드럽게 피펫팅하여 모든 세포를 분리합니다.
  5. 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 완전한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
  7. 필요한 경우 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
  8. subculturing 목적을 위해 세포 현탁액을 1:2 또는 1:3 비율로 세분화합니다.
  9. 문화권이 다시 합류하면 앞서 언급한 절차를 반복합니다.
    참고: LEC는 고밀도 배양 조건에서 번성합니다. 세포를 과도하게 희석하면 세포의 성장을 방해할 수 있으므로 피하십시오.

4. 저장 및 선적

알림: 저장을 위한 이상적인 셀 번호는 ~1 × 106입니다.

  1. 1mL의 DPBS로 세포를 3배 철저히 세척합니다. 세척 후 트립신-EDTA 용액 1mL를 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
  2. 2mL의 완전 배양 배지를 추가하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 상층액을 버리고 90% FBS 및 10% DMSO로 구성된 냉동 배지에 세포를 재현탁시켜 세포 밀도를 1 × 106 cells/mL로 목표로 합니다. 세포 현탁액을 cryovial로 옮깁니다.
  4. 즉시 세포를 -20°C 환경으로 1시간 동안 이동한 다음 밤새 -80°C로 이동한 후 액체 질소에 영구적으로 보관합니다.
    알림: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 셀은 -80°C에서 처음 한 시간 후에 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
  5. 배송이 필요한 경우, 익일 배송을 위해 드라이아이스와 함께 크라이오비얼의 세포를 패키지에 담아 배송하십시오.
  6. 세포를 수령하면 신속한 회복을 보장하고 세포를 하위 배양에 넣습니다. 즉각적인 배양이 불가능한 경우 세포를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다.
    알림: 셀을 배송해야 하는 경우 samples는 온도 변화로 인한 잠재적인 손상을 방지하기 위해 드라이아이스에 깊숙이 묻혀 있습니다.

5. LEC 검증

  1. 커버 유리를 사용하여 LEC를 35mm 배양 접시에 담고 약 48시간 동안 배양합니다.
  2. PBS로 세포를 2배 세척하고 -20°C에서 10분 동안 차가운 메탄올로 세포를 고정합니다.
  3. 고정 세포를 PBS로 3 x 5분 동안 세척하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 차단 완충액으로 고정 세포를 1시간 동안 배양합니다.
  4. 차단 후 희석제 완충액에 1:50 비율로 개별적으로 희석한 1차 항체(αA-crystallin, γ-crystallin 및 PROX1 항체)를 사용하여 4°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
  5. PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 2차 항체를 희석제 완충액에 1:100으로 희석하여 1시간 동안 배양합니다.
  6. PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 PBS에서 5μg/mL Hoechst 33342로 실온에서 10분 동안 세포를 염색하여 핵을 시각화합니다.
  7. PBS로 세포를 2 x 5분 동안 세척하여 과도한 염색 용액을 제거하고 핵용 DAPI 채널과 αA-, γ-결정질 및 PROX1용 FITC 채널을 사용하는 형광 현미경을 사용하여 세포의 형광 이미지를 캡처합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 2에서 볼 수 있듯이 이 프로토콜을 따르면 C57BL/6J 마우스의 1차 LEC가 4시간 이내에 접시에 부착되었습니다. 특히, 후낭(posterior capsule)과 수정체 섬유 세포(lens fiber cell)의 일부와 같은 다른 조직의 흔적이 눈에 띄게 남아 있었습니다. 그러나 이러한 의도하지 않은 요소는 접시에 부착되지 않았으므로 배양 배지를 변경하여 제거할 수 있습니다. 그 후, 3일째에서 5일 사이에 LEC는 확산 단계를 시작했습니다. 로그 증식 단계의 특징인 급속한 성장은 7일째와 10일 사이에 관찰될 수 있었다. 세포가 빠른 성장 단계로 진행되지 않는 경우, EpiCGS-a와 같은 성장 보충제를 배양 배지에 통합하는 것이 바람직할 수 있습니다. 또한, 우리는 세포가 10 % FBS에 비해 20 % FBS를 함유 한 배지에서 더 빠른 성장 속도를 나타내는 것을 관찰했습니다. FBS 농도가 낮으면 일반적으로 수정체의 중심 상피의 특성을 반영하여 느린 성장을 촉진하는 반면, 20% FBS 농도는 수정체의 증식대 특성을 복제합니다.

불멸의 인간 수정체 상피 세포주 B3를 개발한 Reddy et al.과 Andley et al.에 따르면, LEC는 αA- 및 γ-crystallins 2,21과 같은 다양한 수정체 특이적 단백질을 발현해야 할 것으로 예상됩니다. 따라서 이 연구에서는 αA- 및 γ-crystallins를 세포 마커로 사용하여 LEC로서의 세포의 정체성을 검증했습니다. 처음 3개의 통로 내의 LEC는 유리 커버슬립에서 배양되었습니다. αA- 및 γ-결정체에 특이적인 1차 항체를 사용하여 밤새 세포를 배양했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 이 세포는 αA- 및 γ-결정질 모두의 강력한 발현을 나타내어 렌즈 유래 상피 세포라는 결정적인 증거를 제공했습니다. 또한 PROX1을 1차 LEC를 표지하기 위한 섬유 셀에 대한 잘 정립된 마커로 사용했습니다. 데이터에 따르면 이러한 LEC는 PROX1에 대해 음성 염색을 보였으며, 이는 이 세포가 상피 세포이며 아직 섬유 세포로 분화되지 않았음을 확인했습니다.

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그림 1: LEC 문화권의 단계별 워크플로. 이 그림은 1차 수정체 상피 세포의 배양과 관련된 순차적 단계를 보여줍니다. 1단계는 전방낭에 작은 찢어짐을 만드는 것입니다. 2단계에서는 렌즈 캡슐을 부드럽게 제거합니다. 3단계에서는 렌즈 캡슐을 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮기고 37°C에서 10분 동안 0.05% 트립신 용액으로 배양합니다. 배양 후 분해된 수정체 캡슐을 해부 가위를 사용하여 다져 세포 분리를 촉진합니다. 4단계는 20% FBS를 함유한 배양 배지 0.5mL를 원심분리 튜브에 추가하고 조직 샘플을 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리하여 트립신을 담금질하는 단계를 포함합니다. 5단계에서는 1mL의 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 24웰 플레이트에 파종해야 합니다. 마지막으로, 6단계에서는 실험 전반에 걸쳐 세포 성장과 유지를 지원하기 위해 2-3일마다 배양 배지를 교체합니다. 약어: LECs = 수정체 상피 세포; FBS = 소 태아 혈청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 시간 경과에 따른 LEC의 성장 패턴. 1차 수정체 상피세포의 성장 중 다양한 시점에서의 형태학적 변화는 위상차 현미경으로 기록되었습니다. 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일에 촬영한 이미지는 진화하는 세포 형태를 묘사하여 시간 경과에 따른 수정체 상피 세포의 발달 및 거동에 대한 통찰력을 제공합니다. 활발하게 증식하는 수정체 상피 세포의 위치를 나타내는 빨간색 화살표. 스케일 바 = 100 μm. 약어: LECs = 수정체 상피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: LEC의 검증. (A) 마우스 LEC에서 αA-crystallin의 면역염색. 1차 mLEC는 Hoechst 33342(파란색) 및 αA-결정질 항체(녹색)로 염색되었습니다. (B) 마우스 LEC에서 γ-crystallin의 면역염색. (C) 마우스 LEC에서 PROX1의 면역염색. 1차 mLEC는 Hoechst 33342(파란색) 및 PROX1 항체(녹색)로 염색되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: LECs = 수정체 상피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 백서에 제시된 프로토콜은 기본 LEC의 성공적인 격리, 배양 및 하위 배양에 대한 포괄적인 단계별 가이드를 제공하며 함께 제공되는 비디오 문서도 함께 제공됩니다. 서면 지침과 함께 상세한 시각적 가이드는 프로토콜의 명확성과 접근성을 향상시켜 해당 분야의 연구자들 사이에서 프로토콜의 사용과 재현성을 촉진합니다. 궁극적인 목표는 백내장 형성 및 백내장 수술 후 만연한 합병증인 PCO에서 LEC의 역할을 둘러싼 지식 체계를 확장하는 데 기여하는 것입니다.

일차 LEC를 HLE-B3 및 SRA01/04와 같은 수정체 상피 세포주와 비교할 때 각각은 연구 맥락에서 고유한 장점과 과제를 제시합니다. HLE-B3 세포주는 SRA01/04와 함께 취급이 쉽고 내구성이 뛰어나지만 지속적인 복제 및 장기간의 배양 조건으로 인해 유전적 및 표현형 변화를 나타내는 세포주 범주를 나타냅니다. 이로 인해 원래 LEC의 기능과 상당한 차이가 발생하여 응답의 신뢰성이 떨어질 수 있습니다. 반대로, 환자나 연구 동물의 생체 조직에서 직접 분리한 일차 LEC는 생체 내에서 수정체의 자연 세포 환경과 고유한 반응을 더 정확하게 반영합니다. 추출 및 배양의 복잡성이 추가되었음에도 불구하고 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하기 때문에 높은 생리학적 관련성을 요구하는 연구에서 선호되는 경우가 많습니다.

이 프로토콜을 따르는 동안 몇 가지 핵심 사항을 고려해야 합니다. 일반적으로 생후 2주 미만의 어린 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다. 우리는 이 어린 마우스에서 수확한 LEC가 2개월 이상 된 마우스의 LEC에 비해 더 활발한 성장을 보였다는 것을 관찰했습니다. 이것은 마우스의 나이와 세포 성장 사이에 음의 상관 관계가 있음을 나타냅니다.

쥐의 눈에서 수정체를 해부하는 것은 섬세한 작업으로, 수정체와 수정체의 무결성을 보존하기 위해 해부 도구를 신중하게 사용해야 합니다. 프로토콜 섹션 1에 설명된 절차는 렌즈가 최소한의 손상으로 성공적으로 추출되도록 합니다. 렌즈 캡슐의 상태와 무결성을 유지하는 것은 어려운 일이지만, 손상이 분리된 LEC의 품질과 양에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으므로 그 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 대부분의 세포 분열은 일반적으로 수정체의 적도 영역 근처의 발아 영역에서 발생하며, 이 영역은 배양을 위해 쉽게 접근할 수 없는 영역입니다. Zetterberg et al.에 따르면, 수정체 상피의 중앙 부분이 정상적인 상황에서 최소한의 유사분열 활성을 나타내지만, 삼중 티미딘(3H-Tdr) 라벨링을 활용하는 실험은 이러한 중앙에 위치한 수정체 상피 세포를 잠재적인 줄기 세포로 표시했습니다17,22. 줄기세포는 표준 조건에서 낮은 증식률에도 불구하고 무한한 증식 능력과 같은 뚜렷한 특성을 나타냅니다. 따라서 수정체 상피의 중앙 부분은 발아 영역보다 LEC의 증식 능력을 더 잘 나타낼 수 있습니다.

프로토콜 섹션 2에 자세히 설명된 LEC의 분리는 이 실험 절차에서 중추적인 단계를 구성합니다. 수정체 캡슐 제거, 효소 분해 및 조직 단편화를 포함한 통합 작업을 신중하게 수행하여 캡슐에서 개별 상피 세포를 분리합니다. 이 과정에서 중요한 요소 중 하나는 트립신 분해 기간입니다. 소화 기간은 8분에서 10분 사이로 설정하는 것이 좋습니다. 이 기간을 5분 미만으로 줄이면 불완전한 세포 분리가 발생할 수 있습니다. 반대로, 이 기간을 과도하게 연장하면 세포 생존율이 크게 저하될 수 있습니다. 트립신-EDTA를 세포 해리 시약으로 사용하는 전략적 선택은 20% FBS 및 10μg/mL 겐타마이신이 보충된 DMEM 배양 배지와 함께 잠재적인 오염 위험을 완화하면서 세포 방출 및 후속 증식을 최적화합니다.

항생제는 1차 LEC 배양 중 박테리아 오염을 방지하기 위해 자주 사용됩니다. 그러나 항생제의 선택은 신중해야 합니다. 페니실린, 스트렙토마이신과 같이 일반적으로 사용되는 항생제와 항진균제는 LEC의 생존력에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 대안으로 최적의 LEC 성장을 위해 10μg/mL 농도의 겐타마이신 용액을 사용하는 것이 좋습니다.

또한 높은 세포 밀도를 유지하는 것은 성공적인 1차 LEC 배양을 위한 또 다른 중요한 요소입니다. 확립된 세포주와 달리 1차 LEC는 최적의 성장을 위해 더 높은 세포 밀도가 필요합니다. 이는 주로 분화 상태와 기능을 유지하는 데 도움이 되는 직접 접촉 또는 측분비 신호 전달에 의해 촉진되는 효과적인 세포 간 통신에 의존하기 때문입니다. 높은 세포 밀도는 또한 "배양 충격"의 부작용을 완화시키는데, 이는 일차 세포가 분리되어 생체 내 기원과 현저히 다른 시험관 내 환경에 배치될 때 경험하는 상태이다23. 생체 내 환경을 모방함으로써 세포 밀도가 높을수록 생존율이 높아집니다. 또한 이 밀도는 세포 성장과 기능을 지원하는 성장 인자와 사이토카인의 농도 구배를 설정하는 데 도움이 됩니다. 많은 일차 세포가 증식을 위해 표면 부착이 필요한 고정에 의존한다는 점을 감안할 때, 높은 세포 밀도는 접착을 위한 적절한 수의 인접 세포를 제공하여 건강한 성장을 촉진합니다. 결과적으로, 세포 밀도의 조절은 세포 통신, 생존 및 증식에 상당한 영향을 미치기 때문에 일차 세포의 배양에서 중요한 고려 사항입니다. LEC를 위한 이상적인 환경을 조성하기 위해 24웰 또는 6웰 플레이트와 같은 소형 배양 접시를 선택하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜을 따르면 일반적으로 LEC가 재배 후 ~ 10-14 일 후에 합류 상태에 도달합니다. 실험에서 가장 자연스러운 거동을 보장하기 위해 적은 수의 통로(이상적으로는 P0와 P6 사이)에서 LEC를 사용하는 것이 좋습니다. 7-10개의 통로를 넘어서면, LEC는 성장 감소를 보일 수 있으며, 더 낮은 통로의 세포와 같은 방식으로 실험 조건에 반응하지 않을 수 있습니다.

혈청 농도는 세포 성장 속도와 직접적인 관련이 있습니다. FBS 수치가 낮을수록 중앙 상피의 특성과 유사하게 느린 성장을 유도할 가능성이 높습니다. 대조적으로, FBS 수치가 높을수록 증식대의 조건을 모방합니다. LEC를 오래된 동물이나 유전자 변형 동물에서 분리해야 할 때 발생할 수 있는 것처럼 세포 성장이 느린 경우 FBS를 20%로 늘리거나 EpiCGS-a(5mL, 재료 표 참조)와 같은 성장 보충제를 배양 배지에 추가하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이 혈청 및 보충제 농축은 세포 증식을 촉진하고 상피 세포의 최적 성장을 촉진할 수 있습니다.

보관 및 선적 프로토콜(프로토콜 섹션 5)은 살아있는 세포의 보존 및 운송과 관련된 문제를 고려합니다. 냉동 매체의 선택은 보관 및 운송 중 LEC의 생존에 매우 중요합니다. 우리는 70% 완전 배양 배지 + 20% FBS + 10% DMSO를 포함한 다양한 냉동 배지를 실험했습니다. 90% FBS + 10% DMSO; 및 DMSO 및 무혈청 냉동 배지. 실험의 증거에 따르면 10% DMSO와 90% FBS로 구성된 용액은 세포 생존율을 보존하는 데 우수한 성능을 보입니다. 이 특정 제형을 활용하여 10년 이상의 기간 동안 -80°C에서 보관 중인 1차 LEC를 성공적으로 유지하여 이 접근법의 견고성과 보관 후 세포 부활을 촉진하는 능력을 입증했습니다.

αA-crystallin 및 γ-crystallin은 LEC의 마커로 사용되었습니다. PROX1은 렌즈 섬유 셀의 마커로 활용되었습니다. PAX6, FOXE3 및 E-cadherin과 같은 추가 마커를 사용하여 LEC 표현형을 특성화할 수도 있습니다. 연구자가 EMT를 탐구하는 데 관심이 있는 경우 αSMA를 마커로 사용해야 합니다. 배양 시간과 희석액은 실험의 특정 요구 사항과 사용된 각 항체에 대해 제공된 권장 사항에 따라 조정하는 것이 중요합니다.

이 연구는 1차 LEC를 배양하기 위한 강력한 방법론을 제시하지만 그 한계를 인정하는 것이 중요합니다. 분리된 세포는 초기에 1차 LEC이지만, 모든 하위 배양, 트립신화 및 재활성화 절차는 세포의 상태를 변화시킵니다. 우리가 설계한 프로토콜은 주로 LEC의 소스로 마우스 렌즈를 사용합니다. 그러나 LEC는 백내장 환자 샘플, 안구 은행 눈 또는 녹내장 및 당뇨병성 망막병증을 포함한 다양한 안과 질환 환자를 포함한 다른 자원에서도 배양할 수 있습니다17,24. 나이가 많은 사람이나 특정 안구 질환이 있는 사람에게서 채취한 LEC는 젊고 건강한 세포의 세포만큼 프로토콜을 효과적으로 준수하지 않을 수 있습니다. 나이가 많거나 유전자 변형된 개체 또는 동물에서 LEC를 배양하려면 잠재적으로 FBS를 20%로 증가시키거나 추가 성장 인자를 통합하여 배양 배지를 최적화해야 할 수 있습니다. 또한, 1차 배아 병아리 수정체 상피 세포 배양에 대해 수행된 Menko et al.의 이전 연구에서는 배양 2일째 이후에 발생하는 자발적 분화를 보여주었습니다25. 따라서 연구자는 특히 차별화를 연구하는 것이 주요 연구 목표인 경우 주의를 기울이고 방법론의 차이점을 고려해야 합니다.

다양한 방법을 활용하여 1차 LEC를 배양할 수 있습니다. 예를 들어, Ibaraki et al., Sundelin et al. 및 Andjelic et al.에 의해 개발된 방법은, 백내장 수술 중에 수집된 수정체 캡슐의 앞쪽 부분을 사용하여 페트리 접시 상에서 직접 1차 LEC를 배양하는 것을 포함한다 16,17,19,20. 이 접근법은 자연스러운 세포 간 접촉과 세포외 기질을 유지하여 PCO와 같은 질환에 중요한 높은 생리학적 관련성을 제공합니다. 대안적으로, Zelenka et al.이 개략적으로 설명한 것과 같은 수정체 이식 방법은 본래 조직 구조를 보존하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 하고, 특히 LEC의 말단 분화, 세포 상호 작용 및 수정체 발달 과정을 탐색하는 데 유용하며, 분화 중 순차적인 세포 및 분자 사건에 대한 자세한 이해를 제공합니다26.

대조적으로, 이 프로토콜에 기술된 트립신화 방법은 균일한 단세포 현탁액을 생성하여, 균일한 파종 및 정밀한 세포 계수를 단순화하며, 이는 세포 생존도 및 증식 분석, 약물 스크리닝 및 세포 신호 경로 분석과 같은 특정 실험에 유리합니다. 그러나 이 방법은 균일한 세포 집단으로 인해 통제되고 정밀한 연구를 용이하게 하지만 세포 거동을 변화시키고 효소 처리로 인해 이식 및 직접 배양 방법에서 볼 수 있는 생리학적 관련성을 손상시킬 수 있음을 인정하는 것이 중요합니다. 상피 세포 연구에만 집중하는 연구자에게 이 방법은 적용 가능하고 편리하며 이러한 세포의 특성과 행동에 대한 신뢰할 수 있는 통찰력을 제공합니다. 그러나 과학적 탐구가 세포 분화로 확장되는 사람들에게는 이식 기술과 같은 대체 방법을 고려하거나 이러한 측면을 포괄하기 위해 현재 방법을 조정하고 최적화하는 것이 필수적입니다.

전반적으로 이 프로토콜은 LEC의 특정 요구 사항과 요구 사항을 신중하게 고려하여 설계되었습니다. 해부에서 검증에 이르기까지 모든 단계는 세포의 생존력과 기능을 유지하기 위해 세심하게 제작됩니다. 결과적으로 LEC와 안구 생리학 및 병리학에서 LEC의 역할을 연구하는 연구자들에게 귀중한 가이드가 될 수 있습니다. 향후 연구는 LEC 생물학의 다양한 측면을 탐구하기 위해 이 프로토콜을 조정하고 수정할 수 있으며, 렌즈 관련 질환에 대한 이해를 더욱 발전시키고 백내장 및 PCO 예방을 위한 새로운 치료 전략을 개발할 수 있는 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 NEI R21EY033941(to Hongli Wu)의 지원을 받았습니다. 국방부 W81XWH2010896 (Hongli Wu에게); R15GM123463-02 (케일라 그린과 홍리 우에게)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054LECs 해리용
Alexa Fluor 488 2차 항체 Jackson ImmunoResearch#715-545-150세포 검증용
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003세포 검증용
항체 희석 완충액Licor#927-60001세포 검증용
Beaver 안전 나이프Beaver-Visitec International#3782235렌즈 해부용
차단 버퍼Licor#927-60001세포 검증용
Capsulorhexis 펜치Titan Medical InstrumentsTMF-124렌즈 캡슐 격리용
DMEMSigma AldrichD6429LECs 배양 매체용
DMSOSigma Aldrich#D2650냉동 매체 제조용 
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 Thermo Fisher#J67802렌즈 박리용
Dumont 핀셋Roboz 수술 기구RS-4976렌즈 캡슐 분리용
EpiCGS-a (선택 사항)ScienCell4182LEC 배양 매체용
FBSSigma AldrichF2442LEC 배양 배지용
겐타마이신 (50  Sigma-AldrichG1397LEC 배양 매체용
Hoechst 33342 용액Thermo Fisher#62249세포 검증용
미세 해부 가위Roboz 수술 기구 RS-5983렌즈 해부
절제 핀셋Roboz 수술 기구 RS5137 렌즈 박리용
PROX1 항체Thermo Fisher11067-2-AP세포 검증용
Vannas 미세 해부 스프링 가위Roboz 수술 기구RS-5608렌즈 캡슐 격리
및 알파용; A-crystallin 항체Santa Cruzsc-28306세포 검증용 
γ-crystallin 항체Santa Cruzsc-365256세포 검증용
마이크로 용

참고문헌

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