경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

BBB는 혈관 내피 세포, 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기타 세포 구조로 구성된 혈액 순환과 신경 조직 사이의 독특한 생물학적 인터페이스입니다¹. 혈액과 뇌 사이의 이온, 화학 물질 및 세포의 흐름은 이 장벽에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 항상성은 독소와 병원균으로부터 신경 조직을 보호하는 동시에 뇌 신경의 적절한 작동을 가능하게 합니다 ^2,3. BBB의 무결성을 유지하면 신경 기능 장애, 부종 및 신경 염증과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 장애의 발생 및 진행을 효과적으로 예방할 수 있습니다⁴. 그러나 BBB의 독특한 생리학적 특성으로 인해 저분자 약물의 98% 이상과 고분자 약물의 100% 이상이 중추신경계에 들어가는 것을 방지할 수 있다⁵. 따라서 중추 신경계에 대한 약물 개발 중에 BBB를 통한 약물 침투를 증가시키는 것은 치료 효능을 달성하는 데 필수적입니다 ^6,7. 기질의 컴퓨터 시뮬레이션 스크리닝으로 인해 약물 후보 물질이 BBB를 통과할 확률이 크게 높아졌지만, 과학 연구의 요구를 충족하기 위해서는 여전히 신뢰할 수 있고 저렴한 in vitro/in vivo BBB 모델이 필요하다⁸.

고처리량 약물 스크리닝을 위한 빠르고 저렴한 기술은 in vitro 모델⁹입니다. BBB 기능에 대한 의약품의 효과와 질병의 발병 및 진행에 대한 의약품의 역할의 근본적인 과정을 밝히기 위해 일련의 단순화된 체외 BBB 모델이 만들어졌습니다. 현재, 일반적인 in vitro BBB 모델은 혈관 내피 세포와 성상세포, 주위 세포 또는 미세아교세포(microglia)에 의해 구성된 단층, 공동 배양, 동적 및 미세유체 모델(10,11,12)이다(^13,14). 3D 세포 배양은 BBB¹⁵의 생리학적 구조와 더 일치하지만, BBB에 대한 약물 스크리닝 수단으로서의 적용은 복잡한 설계와 수준 이하의 재현성으로 인해 여전히 제약을 받고 있습니다. 대조적으로, 단층 in vitro 모델은 BBB를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 모델이며 특정 세포에서 막 수송체 및 밀착 접합 단백질의 발현을 결정하는 데 적용할 수 있습니다.

막관통 전기 저항(TEER) 측정은 저항을 가로지르는 셀 층을 평가 및 모니터링하고 장벽의 셀 무결성 및 투과성을 평가하는 기술입니다. 단층(monolayer)의 어느 한쪽에 있는 성장 매체 또는 완충 용액에 2개의 전극을 동시에 삽입함으로써, 전지의 조밀한 층(^16,17)을 통해 교류 또는 전기 임피던스를 측정할 수 있다. 시험관 내 BBB 모델이 적절하게 생성되었는지의 여부를 결정하기 위해, TEER의 측정은 통상적으로 골드 스탠다드(gold standard)¹⁸로 채택될 것이다. 한편, BBB 투과성에 대한 약물 작용의 경향은 약물 침범 후 세포층의 전기 저항 변화를 측정함으로써 정확하게 예측할 수 있다¹⁹. 예를 들어, Feng et al.은 catalpol (rehmanniae의 주요 활성 단량체)이 BBB에서 단단한 접합 단백질의 지질 다당류 유도 하향 조절을 효과적으로 역전시키고 마우스 뇌 내피 세포층²⁰의 TEER 값을 높일 수 있음을 발견했습니다.

신경염증 반응은 일반적으로 BBB 항상성 불균형의 주요 원인이다²¹. 신경염증성 손상을 유발하는 저산소 치료는 혈액뇌장벽을 파괴하는 주요 방법이며, 주로 물리적 방법과 화학적 시약방법을 포함합니다. 전자는 저산소 조건(²²)을 시뮬레이션하기 위해 세포 성장 환경에서의 산소 함량을 변화시키기 위해 주로 3-기체 인큐베이터를 이용하는 반면, 후자는 CoCl₂와 같은 데옥시 시약을 세포 배양 배지(²³)에 인위적으로 도입함으로써 달성된다. 헴에서 Fe^{2 +}가 Co^{2 +}로 치환되면 세포는 탈산소 상태로 유지됩니다. 촉매 그룹에서 Fe^{2 +}가 Co^{2 +}로 치환되면 프롤린 하이드 록실 라제 및 아스파르테이트 하이드 록실 라제 활성이 억제되어 저산소증 유도 인자 -1α (HIF-1α) ²⁴가 축적됩니다. 지속적인 저산소증 상태에서 세포질에서 HIF-1α의 탈인산화는 세포 사멸을 유발하고 혈관 내피 성장 인자를 활성화하여 궁극적으로 혈관 투과성을 높입니다. 이전 연구^25,26에서, 저산소증이 내피 밀착 접합 단백질의 발현을 현저히 감소시켜 BBB의 투과성을 증가시킬 수 있다는 것이 잘 입증되었습니다. 이 연구에서는 간단한 BBB 모델을 만들기 위해 24웰 플레이트에 파종된 bEnd.3 세포의 시간 저항 곡선을 측정했습니다. 이 모델을 사용하여 BBB 보호를 위한 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 세포 모델을 구성하기 위해 CoCl₂ 개입 후 세포 TEER의 변화를 특성화했습니다.

참고: 마우스 뇌 유래 내피 세포.3(bEnd.3)을 24웰 플레이트의 챔버에 접종하여 특정 배지 조건에서 BBB의 간단한 시험관 내 모델을 구성했습니다. 정상 세포와 저산소 세포의 TEER은 TEER 미터로 측정하였다(도 1 및 도 2).

1. 용액 준비

1. FBS(10%, v/v), 100U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 세포 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 100μL DMSO 용액에 1.30mg_CoCl2를 첨가하여 100mM_CoCl2 원액을 준비합니다.
   참고: 위의 모든 용액을 4°C 조건에서 보관하고, 원액을 원하는 농도에 따라 희석한 후 사용하였다.
3. 5mL의 이중 증류수에 차아염소산나트륨 용액 2mL를 첨가하여 38% 차아염소산나트륨 용액(v/v)을 준비합니다.

2. 세포 배양 및 세포 생존력

1. 1 x 10⁶ cells/mL 밀도의 DMEM 배지를 포함하는 배양 접시(100mm)에 bEnd.3 세포 1mL를 파종하고 5%_CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 배양합니다. 2-3일마다 배지를 교체하고 일주일에 2번 세포를 하위 배양합니다.
2. bEnd.3 세포가 80% 합류로 성장한 후 30초 동안 0.25% 트립신으로 세포를 분해합니다.
3. 세포 카운터를 통해 DMEM 배지를 사용하여 7 x 10⁴ cells/mL의 밀도로 bEnd.3 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 100μL의 bEnd.3 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 파종합니다.
4. 세포 접착 후 PBS로 세포를 세척하고 동일한 조건에서 100μL의 배양 배지 또는 약물 함유 배지(100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM_CoCl2)로 세포를 배양합니다. 웰 플레이트 내부의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 100μL의 CCK-8 용액을 추가합니다.
   알림: 광학 밀도(OD) 값에 영향을 미치는 우물에 기포를 생성하지 마십시오.
5. 96웰 플레이트를 37°C 환경에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 96웰 플레이트의 흡광도를 측정합니다.
   알림: 그룹 내 차이를 피하기 위해 웰 플레이트는 검출 전에 실온으로 냉각되었습니다.
6. [OD_Drug - OD_Blank] / [OD_{Control-OD Blank}] x 100% 공식_{에 따라 다양한} 농도의 CoCl2에 의해 유도된 세포 생존율을 계산합니다. 다음 실험에서 대조군과 비교하여 세포 생존율 감소에 유의한 차이가 있는_CoCl2 농도를 선택합니다.

3. 모형 집합

1. 24웰 플레이트의 상부 챔버를 PBS로 헹굽니다.
   참고: 세포는 24웰 플레이트의 상부 챔버 바닥에서 성장하고 융합되었으며, 세포 사이의 긴밀한 접합부가 점차적으로 형성되어 장벽 역할을 했습니다. 일부 연구에서 사용된 내피 세포가 PET 멤브레인에 독립적으로 완전한 장벽을 형성할 수 없는 경우 세포 접종 전에 콜라겐 IV 용액으로 멤브레인을 코팅해야 합니다.
2. bEnd.3 셀을 DMEM 배지와 혼합하여 와류 믹서를 사용하여 5 x 10⁵ cells/mL의 밀도로 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 24웰 플레이트(0.33cm2, 0.4μm 멤브레인 공극 크기)의 상부 챔버에 있는 PET 멤브레인에 200μL의 bEnd.3 셀 현탁액을 파종합니다.
   참고: 이 프로토콜의 파일럿 연구는 실험을 위해 5-10개의 bEnd.3 세포 통로를 사용할 때 결과에 차이가 없음을 발견했습니다. 성공적인 모델링의 가능성을 보장하려면 이 프로토콜의 셀 번호 간격을 참조하십시오.
3. 플레이트의 하부 챔버에 1200μL의 완전한 배지를 추가하여 상부 및 하부 챔버의 삼투압이 안정화되는 경향이 있는지 확인합니다. 유형에 따라 추가되는 매체의 양에 차이가 있습니다. 상부 및 하부 챔버의 액체 레벨이 같은 높이인지 확인하십시오.
4. 상부 챔버와 하부 챔버의 매체를 매일 정해진 시간에 교체하고 동시에 저항 값을 모니터링합니다.
   1. 매체를 변경할 때 인위적인 접촉이나 과도한 움직임으로 인해 세포층의 무결성이 손상됩니다. 위의 상황을 방지하려면 음압 피펫으로 한쪽에서 기존 매체를 천천히 제거하고 유체 교환 중에 벽을 따라 새 매체를 천천히 추가하십시오.

4. TEER 측정

1. 작업을 시작하기 전에 저항기, 5% 차아염소산나트륨 용액, 75% 에탄올 및 이중 증류수 용액을 매우 깨끗한 테이블에 놓습니다. 잔류 박테리아와 병원균을 제거하기 위해 30분 동안 UV 조사를 켭니다.
2. 전극을 5% 차아염소산나트륨 용액에 넣고 3초에서 5초 동안 천천히 흔든 다음 75% 에탄올에 15분 동안 담그십시오. 마지막으로 사용할 때까지 PBS 또는 이중 증류수 용액으로 옮깁니다.
3. 셀 저항기 미터 뒷면의 스위치를 켜고 표 1의 매개변수에 따라 Select Plate를 클릭한 다음 24-Well Plate를 선택합니다.
4. 작업 요구 사항에 따라 적절한 감지 순서를 선택하십시오. 본 연구에서는 A1 절차를 선택하였다.
5. kΩ 저항을 오른쪽 플러그에 삽입하여 계측기를 교정합니다. 교정 결과가 1000 ± 5 Ω이면 기기의 정확도가 정상이라고 생각하십시오.
   1. 교정 결과가 1000 Ω이 아닌 경우 메인 인터페이스에서 모드 단위 를 클릭하여 OHMS를 선택한 다음 메인 화면에서 교정 을 클릭하여 기기를 다시 교정합니다.
6. 오른쪽에 있는 kΩ 저항을 빼내고 측정 전극을 연결 와이어로 교체합니다.
7. 셀을 수직으로 시드하지 않고 전극을 24웰 플레이트에 놓고 기기의 메인 화면에서 Blank Handling 을 클릭합니다. 시드된 셀이 없는 플레이트 저항의 배경 값은 약 134.4 Ω입니다.
8. 두 개의 전극을 셀이 있는 시드 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 삽입하여 셀층이 그 사이에 오도록 한 다음 페달을 부드럽게 밟아 저항 값을 기록합니다.
   1. 전극이 상부 챔버의 셀과 하부 챔버의 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 용액에 전극을 담그는 시간은 저항 값에 영향을 미치지 않으며 전극이 올바른 위치에 있는지 확인하기만 하면 됩니다.
9. 다음 방정식과 같이 전기 저항 값(ohms)에 상부 챔버의 바닥 면적(cm²)을 곱하여 TEER 값(Ωcm²)을 얻습니다.
   TEER(^Ωcm2) = 저항(Ω) x S_인서트 (^cm2)
10. TEER-Time(일)의 선 플롯을 그립니다. 저항 값이 시간이 지남에 따라 더 이상 증가하지 않으면(며칠에 걸쳐 측정) 셀이 장벽을 형성했다고 간주합니다.
    알림: bEnd.3 세포의 단층 BBB 모델은 약 6일 동안 이 연구의 매개변수로 bEND.3 세포를 배양하여 성공적으로 구축될 것입니다. bEnd.3 셀 단층 모델의 TEER은 6일 이내에 16.49 ± 2.12 Ωcm² 에서 27.59 ± 1.50 Ωcm² 범위였습니다(n=8, 평균 ± SD).

5. 장벽 파괴 및 통계 분석

1. TEER-시간 곡선에 따라 장벽 기능이있는 웰을 선택하고 대조군과 CoCl₂ 그룹 (n = 4)으로 나눕니다.
2. 300μM_CoCl2 (200μL)를 함유하는 배양액 및 배양액을 각각 대조군 및_CoCl2 기 상부 챔버에 첨가합니다.
3. 4단계에서 설명한 절차를 사용하여 37°C에서 배양 12시간 및 24시간에서 대조군과 CoCl₂ 그룹의 저항값을 검출합니다.
4. 상용 소프트웨어를 사용하여 300μM CoCl₂ 유무에 관계없이 배양된 세포 장벽의 TEER 값 추세를 매핑합니다.
5. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 CoCl2 처리 세포와 정상 세포 간의 저항 값 차이를 분석합니다(n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

이 프로토콜은 경내피 저항기 측정기에 설정된 매개변수에 따라 세포의 저항 값의 변화를 기록할 수 있었습니다. 다양한 농도의 CoCl2로 처리된 bEnd.3 세포(살아있는 세포의 수)의 생존력은 CCK-8 분석으로 스크리닝되었습니다. CoCl2에 의해 생성된 더 큰 세포 손상은 더 낮은 세포 생존율로 나타났습니다. 300μM의 CoCl2가 시험관 내에서 유의미한 세포독성을 나타낸다는 것을 발견했으며, 이 농도는 다음 실험에 사용되었습니다(그림 3A). bEnd.3의 성장 저항 변화를 모니터링한 결과, 세포 TEER 값이5일째 되는 날에 안정화되기 시작하는 것을 발견했습니다. 6일째 되는 날에 플레이트의 상부챔버에 300μM CoCl2를 추가하여 유도된 저산소성 손상은 12시간 및 24시간 시점 모두에서 대조군에 비해 TEER 값이 크게 감소했습니다(그림 3B). 세포 장벽의 기능은 TEER 값에 의해 간접적으로 평가될 수 있으며, TEER 값의 감소는 세포 장벽의 붕괴를 나타냅니다. 300μM CoCl2 그룹의 TEER 값은 24시간 동안 배양 한 후 대조군에 비해 떨어졌습니다(그림 3C). 앞서 언급한 연구는 BBB in vitro 모델의 손상이 CoCl2에 의한 저산소 환경에 의해 발생할 수 있음을 보여주었습니다.

그림 1: TEER 측정을 위한 기기 및 액세서리. (AB를 참조하십시오) TEER 미터의 작동 메인 인터페이스. (씨디) 24웰 플레이트. (E) 전극 세척 및 소독에 필요한 용액. (F) TEER 미터의 교정에는 표준 저항이 필요합니다. (G-H) 전극 및 국부 배율. (I) 풋 페달을 사용하여 데이터를 수집했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 경내피 저항기 측정기를 사용하여 기록한 bEnd.3 세포의 막관통 저항 흐름도. (A) 세포 배양. (B) bEnd.3 세포를 플레이트의 상부 챔버에 파종하고, 웰 플레이트를 배지로 채워 성장과 분화를 지원함으로써 조밀한 세포 장벽을 형성했습니다. (C) 세포의 장벽 기능 무결성은 TEER을 모니터링하여 평가했습니다. (D) CoCl2 는 손상된 세포 장벽 기능을 유도하기 위해 저산소 환경을 모방하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Salidroside는 CoCl2 유도 저산소 손상을 완화하여 bEnd.3 세포의 장벽 기능의 무결성을 유지합니다. (A) CoCl2 (100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM)가 bEnd.3 세포의 생존력에 미치는 영향(n=6, CoCl2 그룹 대 대조군 ***p<0.001, 평균 ± SD). (B) 정상 배지 또는 300μM CoCl2(n=4, 1일 대 2-6일차: ##p<0.01, ###p<0.001, 6일 대 6.5 - 7일: **p<0.01, 평균 ± SD)로 처리한 bEnd.3 세포의 변화 플롯. (C) 24시간 저산소성 손상 후 세포의 TEER 변화(n=4, CoCl2 그룹 대 대조군 ***p<0.001, 평균 ± SD). 일원 분산 분석과 Tukey의 검정을 수행했으며 p<0.05가 유의한 것으로 간주되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: TEER 미터의 매개변수를 설정합니다. 기기의 파라미터 설정 및 프로그램 선택은 셀 저항을 감지하는 데 필요합니다.

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