Method Article

SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술을 사용한 생체 분자 간의 동적 친화도 실시간 검출

DOI:

10.3791/65946

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 여러 영역에서 다양한 응용 분야를 찾는 SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술의 원리와 방법론을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기사에서는 SPR 기술, 작동 단순성 및 놀라운 효율성에 대해 설명하며, 독자들 사이에서 이 기술에 대한 광범위한 인식과 채택을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

Abstract

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SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술은 바이러스, 병원성 분자 단백질 및 수용체를 검출하고, 혈액형을 결정하고, 식품 변조를 검출하는 등 생체 분자 검출을 위한 민감하고 정밀한 방법입니다. 이 기술을 통해 생체 분자 간의 잠재적 결합을 신속하게 식별할 수 있으며, 라벨링할 필요 없이 다양한 지표에 대한 빠르고 사용자 친화적인 비침습적 스크리닝을 용이하게 합니다. 또한 SPR 기술은 고처리량 약물 스크리닝을 위한 실시간 검출을 용이하게 합니다. 이 프로그램에서는 SPR 기술의 응용 분야와 기본 원리를 간략하게 소개합니다. 작업 프로세스는 기기 보정 및 기본 시스템 작동부터 시작하여 리간드 캡처 및 분석물의 다중 주기 분석으로 자세히 설명되어 있습니다. 퀘르세틴과 칼리코신을 KCNJ2 단백질에 결합하는 실시간 곡선과 실험 결과가 정교화되었습니다. 전반적으로 SPR 기술은 약물 스크리닝, 관련 약동학의 실시간 검출, 바이러스 검출, 환경 및 식품 안전 식별을 위한 매우 특이적이고 간단하며 민감하고 신속한 방법을 제공합니다.

Introduction

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표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술은 분석물을 라벨링할 필요가 없는 광학 검출 기술입니다. 이를 통해 정량적 결합 친화도, 동역학 및 열역학에 대한 실시간 및 동적 모니터링이 가능합니다. 이 높은 처리량 용량은 매우 민감하고 재현성이 뛰어나 다양한 개방률, 오프율 및 친화도를 측정할 수 있습니다. 또한, 필요한 소량의 샘플은 이 방법 1,2의 유용성을 더욱 향상시킵니다. 생체분자 간의 친화력 결합을 모니터링하는 속반응형 생체분자검출방법(Fast Response Biomolecular DetectionMethod3)이 저명한 연구 분야로 떠오르고 있습니다.

SPR 기술은 약물 연구 및 개발 분야에서 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다4. 그 용도 중 하나는 특정 약물 표적의 구조적 기반을 발견하는 것입니다. 또한 중요한 약리학적 활성을 가진 한약의 활성 성분을 확인하고 약물 스크리닝 및 검증을 위한 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. Gassner 등....

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Protocol

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참고: 전체 실험 감지 곡선은 실험 과정을 8개의 개별 단계로 분류할 수 있음을 나타냅니다.

1. 샘플 및 완충액 준비

  1. 실험 전에 센서 칩을 준비합니다.
    1. 칩을 피라냐 용액(30% H2O2: H2SO4=1:3; v/v)으로 2분 동안 처리합니다. 그런 다음 다량의 탈이온수로 칩을 철저히 세척한 다음 무수 에탄올에 담그어 자연 건조시킵니다.
    2. 다음으로, 칩을 50M 농도의 11-메르캅토-l-운데칸올(MUOH) 용액에 밤새 담가둡니다.그 후, 칩을 에피클로로히드린 용액에 넣고 25°C에서 4시간 동안 반응시킵니다.
    3. 용액에서 칩을 제거하고 증류수와 무수 에탄올로 철저히 씻으십시오. 마지막으로 dextran basic 용액을 칩의 금 필름 표면에 떨어뜨리고 25°C에서 20시간 동안 반응하도록 합니다. 탈이온수로 칩을 세척한 다음 브로모아세트산 용액에 담궈 덱스트란 하이드록실 카르복시메틸화 변형을 달성합니다. 순도가 각각 ≥98.5% 및 ≥99%인 케르세틴과 칼리코신을 사용하십시오.
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Results

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단백질이 칩 표면에 고정되어 있는지 여부를 확인하기 위해 SPR 센서 맵(그림 1)의 세로좌표(응답 신호)가 사용되며 SPR 곡선의 각도 변위가 얻어집니다. 그림 2 및 그림 3 은 3.9μM에서 250μM 범위의 농도에서 대조군 감소 후 KCNJ2 재조합 단백질의 고정된 표면에서 케르세틴과 칼리코신과 KCNJ2 재조합 단백질 간의 상호 작용의 SPR 곡선을 보여줍니다. 질량 수송 효과로 인한 부정확성을 최소화하기 위해 KCNJ2 재조합 단백질 분자는 저농도로 고정되었을 뿐만 아니라 역학 테스트에서 20μL/min의 더 높은 유속을 적용했습니다. 결과적으로, 케르세틴(quercetin)과 칼리코신(calycosin)의 용량-반응 감각 지도(dose-response sensory map)를 얻었다. 표 1 및 표 2

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Discussion

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SPR 분석 주기는 4단계로 나뉩니다. 첫 번째 단계인 기준선에는 버퍼 주입이 포함됩니다. 그 다음은 두 번째 단계인 리간드 포획입니다. 센서 칩 COOH는 20μL/min의 유속으로 EDC/NHS(1:1)로 활성화됩니다. 그런 다음 칩은 20μL/min의 유속으로 1M 에탄올아민 염산염-NaOH를 사용하여 비활성화됩니다. 세 번째 단계인 다중 주기 분석물 분석법으로 이동합니다. 분석물은 240초의 결합상 동안 20μL/분의 유속으로 채널에 주입된 후 360초의 해리 기간이 이어집니다. 연결 및 분리 프로세스는 모두 실행 중인 버퍼에서 수행됩니다. 분석물의 주기는 분석물 농도에 따라 오름차순으로 반복됩니다. 상호 작용 분석의 각 주기 후에 센서 칩 표면은 150μL/min의 유속으로 10mM 글리신-HCl을 주입 버퍼로 사용하여 분석물을 완전히 재생해야 합니다. 그런 다음, 분석물의 다음 농도 주기는 분석물 주입 및 재생 단계를 수행하여 반복됩니다. 마지막으로, 네 번.......

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Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 쓰촨성 주요 R&D 프로젝트(2022YFS043), 닝샤 핵심 연구 개발 프로그램(2023BEG02012) 및 청두대학교 TCM의 Xinglin 학자 연구 촉진 프로젝트(XKTD2022013)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Nan Jing Reagent, Nanjing, ChinaC08296594
무수 에탄올Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China459836
BIAnormalizing solutionMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China49781
차단 솔루션Bosheng Biotechnology Co., Ltd., 중국 상하이110050
브로모아세트산Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China17000
CalycosinPush Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, ChinaPU0124-0025
DextranCanspec Scientific Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaPM10036
EpichlorohydrinMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China
에탄올 아민 염산염Yuanye Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국S44235
글리신-HClMerck Chemical Technologies Ltd., 상하이, 중국G2879
H2O2Merck Chemical Technologies Ltd., 상하이, 중국3587191
H2SO4난퉁 하이테크 산업 개발구, 중국2020001150C
HEPESXiya 시약 유한 회사, 산동, 중국S3872
KCNJ2 (인간) 재조합 단백질Abnova, West Meijie Technology Co., Ltd., 베이징, 중국H00003759-Q01
MUOHJizhi Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국M40590
NaOHMerck Chemical Technologies Ltd., 상하이, 중국SX0603
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Yuanye Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국S13005
OpenSPRTMNicoya
QuercetinPush Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, ChinaPU0041-0025
Sensor Chip COOHNicoya
Sodium AcetateMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China229873
492515

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jebelli, A., Oroojalian, F., Fathi, F., Mokhtarzadeh, A., Guardia, M. Recent advances in surface plasmon resonance biosensors for microRNAs detection. Biosens Bioelectron. 169, 112599(2020).
  2. Sun, B., Xu, J., Liu, S., Li, Q. X. Characterization of small mo....

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