Tissue Chopper를 이용한 Ex vivo 환자 유래 신경교종 오가노이드 배양

저등급 신경교종(LGG)은 교모세포종과 같은 고등급 신경교종에 비해 일반적으로 느리게 성장하고 덜 공격적인 비교적 희귀한 뇌종양 그룹입니다. 성인과 소아 모두에서 발생할 수 있으며 성인에서 약간 더 유병률이 높습니다. 정확한 유병률은 지역과 인구에 따라 다르지만, LGG는 모든 원발성 뇌종양의 약 15%-20%를 차지한다¹. LGG의 치료 전략에는 신경학적 기능을 보존하면서 종양 절제를 극대화하는 것을 목표로 하는 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 조합이 포함되는 경우가 많습니다. LGG의 관리는 복잡할 수 있으며, 치료법 선택은 종양 위치 및 분자 특성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다². LGG의 유전적 및 분자적 토대에 대한 이해의 발전은 더 많은 표적 치료법으로 이어졌으며 지속적인 연구는 치료 접근 방식을 계속 개선하고 있습니다.

한편, 교모세포종(Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4, GBM)은 성인에서 발견되는 가장 흔한 원발성 뇌종양으로, 100,000인년당 3.19-4.17건의 발병률을 보인다³. 교모세포종은 두통, 발작, 국소 신경학적 결손, 성격 변화, 두개내압 상승 등의 증상을 유발합니다. 교모세포종의 표준 치료법은 가능한 경우 종양의 부피를 줄인 후 테모졸로마이드와 방사선 요법을 병용하는 것이다⁴. 또한, 테모졸로마이드와 로무스틴의 병용은 O⁶-메틸구아닌-메틸전이효소(MGMT)-프로모터 메틸화 환자의 전체 생존율 중앙값을 향상시킬 수^{있다 5}. 그러나 이러한 최근의 치료적 접근에도 불구하고 교모세포종은 예후가 좋지 않은 난치성 질환으로 남아 있으며, 환자의 전체 생존율 중앙값은 16개월에서 전기장 종양 치료(TTFields)를 추가할 경우 최대 20.9개월입니다 ^3,6. 교모세포종에서 여러 면역 요법이 연구되었으나 생체 내 효능이 제한적인 것으로 나타났습니다. 더욱이, 임상적 및 전임상적 한계는 치료적 돌파구를 방해한다⁷. 교모세포종의 ^inter-8 및 intratumoral⁹ 이질성으로 인해 적절하고 현실적인 ex vivo 모델을 확립하는 것이 어려웠습니다.

기존의 2차원(2D) 환자 세포주는 균질한 세포 집단을 나타내며 고처리량 약물 스크리닝에 적합합니다. 그러나, 환자 유래 및 불멸화된 세포주는 여러 번의 통과 후 성장 조건의 차이와 유전형 및 표현형 특징의 편차로 인해 교모세포종을 적절하게 모방하지 못한다^10,11,12.

한편, 3D 오가노이드 모델은 최근 장기 및 다양한 암 유형 13,14,15,16,17,18의 표현형 및 분자 이질성을 복제하는 유망한 시스템으로 부상하고 있습니다. 교모세포종의 맥락에서, 대뇌 오가노이드는 종양과 유사한 특성을 모방하기 위해 유전자 변형되었^거나16,17 종양 세포 침윤을 유도하기 위해 GSC 또는 스페로이드와 함께 배양되었다^18,19. Matrigel 및 EGF/bFGF로 배양한 환자 유래 교모세포종 오가노이드는 줄기세포 이질성 및 저산소증²⁰과 같은 교모세포종의 특징을 나타내지만, 이 모델이 환자 신생물의 주요 분자 특성을 어느 정도까지 나타낼 수 있는지는 여전히 불확실합니다.

환자 유래 교모세포종 오가노이드(PDO)는 조직학적 특성, 세포 다양성, 유전자 발현 및 돌연변이 프로파일을 포함하여 유사한 부모 종양의 우세한 특징을 유지할 수 있는 유망한 모델입니다. 또한, 이들은 성인 설치류의 뇌에 이식될 때 빠르게 침투하여 약물 검사 및 맞춤형 치료를 위한 현실적인 모델을 제공한다²¹. 그러나 PDO를 생성하기 위해 종양 조직을 수동으로 절개하는 것은 시간과 비용이 많이 듭니다. 따라서 많은 수의 PDO를 생산할 수 있는 신속한 방법이 시급히 필요하며, 이를 통해 개별화된 약물 검사를 약속하는 다양한 치료 접근법을 종합적으로 평가할 수 있습니다. 이 연구는 자동 조직 초퍼를 사용하여 갓 절개한 종양 조직에서 직접 PDO를 제조하는 새로운 방법을 설명합니다. 또한, 이 방법으로 생성된 PDO는 PDO 수, 형태학적 특징, 세포사멸 및 종양 세포의 증식 측면에서 동일한 환자로부터 수동으로 절개된 PDO와 비교되었습니다.

모든 환자는 헬싱키 선언에 따라 뷔르츠부르크 대학의 기관 검토 위원회(#22/20-me)의 승인을 받은 서면 동의서를 제공한 후 독일 뷔르츠부르크 대학병원 신경외과에서 치료를 받았습니다. 교모세포종(GBM) 환자 4명과 성상세포종(astrocytoma) 1명, IDH-돌연변이, 중추신경계 WHO 2등급 환자(저등급 신경교종, LGG)의 종양 조직 물질(표 1)을 수술 후 얻어 다음 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 조직 쵸퍼를 사용하여 PDO 생성을 자동화하는 과정을 쵸퍼(C)라고 하며, 현미경 제어 하에 두 개의 메스로 조직을 수동으로 절단하는 공정을 수동(M)이라고 합니다. 종양 샘플로부터 동일한 크기의 6개의 절편(1-2^cm3)을 절개한 후, 각각을 반으로 자르고 두 가지 방법을 사용하여 균질하게 처리하였다. 앞서 언급한 종양 내 이질성으로 인해, 각 접근법에 대해 하나의 6-웰 플레이트가 각 환자로부터 생성되었으며, 각 웰은 원래 종양 내의 다른 부위에서 온 PDO를 나타냅니다. 두 절차 모두 층류 공기 흐름 캐비닛 아래에서 수행되었으며 사용된 모든 기구는 사용 전에 멸균되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 아가로스 블록 준비(C-접근법 전용, 선택 사항)

1. 50mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 비커에 채우고 아가로스 1정( 재료 표 참조)을 넣고 현탁될 때까지 잘 섞습니다.
2. 끓지 않도록 혼합물을 전자레인지에 30-40초 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물이 47°C에 도달할 때까지 식힙니다.
3. 아가로스 혼합물을 밀봉된 실린더 모양의 주조 주형에 붓고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 냉동(-20°C) cl을 사용하여 캐스트를 즉시 식히십시오.amp 또는 30분 동안 드라이아이스 위에 올려 놓습니다.

2. 종양 물질의 처리

1. 수술실에서 실험실로 가는 길에 종양 물질을 식히기 위해 얼음 상자를 준비합니다.
2. 종양 조직(4-5cm³)을 종양을 덮고 있는 25mL의 Hibernate A( 재료 표 참조)가 들어 있는 멸균 50mL 튜브에 옮기고 튜브를 아이스 박스에 넣습니다.
3. 층류 공기 흐름 캐비닛 아래에서 Hibernate A와 함께 종양 물질을 멸균된 유리 페트리 접시로 옮깁니다.
4. 괴사 조직을 제거하고 현미경으로 제어하여 메스와 조직 겸자를 사용하여 조심스럽게 혈관을 해부합니다. 출혈로 인한 갈색 색조를 나타내는 출혈성 부위 또는 인접한 생존 가능한 조직에 비해 더 창백하거나 더 하얗게 보이는 조직으로 괴사 조직을 식별합니다. 조직을 쥐어짜거나 방해하지 않도록 주의하십시오.
5. 종양 물질을 대략 1-2cm³ 크기의 6 조각으로 자릅니다. 조각을 각각 6mL의 H-GPSA 배지(표 2)(표 2)로 미리 채워진 플라스틱 페트리 접시(n =²²)에 분배합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.

3. 티슈 초퍼 설정

1. 제조업체 설명서²³에 설명된 대로 칼날을 배치합니다.
2. 슬라이스 두께를 0.45-0.50mm로 조정합니다. 블레이드 힘을 중간으로 설정합니다. 테이블 해제 노브를 "시작" 모드로 고정합니다.

4. 종양 조직 조각 처리

1. 초퍼를 이용한 종양 조직 처리(C 방법)
   1. 아가로스 블록을 2cm 길이의 실린더로 자르고 히스토아크릴 접착제를 사용하여 이 실린더 중 하나를 다지기 원형 플라스틱 접시에 붙입니다( 재료 표 참조).
   2. 메스를 사용하여 아가로스 실린더에 심화를 만든 다음 첫 번째 웰(2.5단계)의 종양 조직을 이 구덩이 안에 맞춥니다.
      참고: 종양 물질은 조심스럽게 다루어야 하며 틈새로 압착되거나 밀어 넣지 않아야 합니다. 간격은 종양이 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 절단 과정에서 종양 물질을 안정적으로 유지할 수 있을 만큼 작아야 합니다. 4.1.1 단계. 및 4.1.2. 선택 사항입니다.
   3. 플라스틱 디스크를 절단 테이블의 장착 디스크에 놓습니다( 재료 표 참조).
   4. 초퍼를 켜 고 리셋 버튼을 누릅니다. 이제 초퍼가 절단을 시작합니다(첫 번째 라운드). 테이블이 끝에 도달하고 아가로스 조직과 종양 조직이 모두 원하는 직경으로 절단되면 기계가 자동으로 멈춥니다.
   5. 장착 디스크를 90° 회전한 다음 해제 테이블 손잡이를 시작 모드로 조정합니다.
   6. 리셋 버튼을 누르고 기계가 조직을 다시 절단하여 직사각형 모양의 조직(두 번째 라운드)을 만들도록 합니다.
   7. 가공된 재료가 있는 플라스틱 디스크를 제거하고 조직 주걱을 사용하여 종양 조직만 조심스럽게 90° 회전시킵니다.
   8. 플라스틱 디스크를 절단 테이블에 놓고 해제 테이블 손잡이를 시작 모드로 조정하고 재설정 버튼을 눌러 최종 절단 라운드(세 번째 라운드)를 합니다.
   9. 초퍼를 끄 고 플라스틱 디스크를 제거합니다. 다지기와 칼날을 청소하십시오.
   10. 5mL 싱글 채널 피펫을 사용하여 처리된 물질을 배지와 함께 피펫으로 흡입하고 현탁액을 다시 접시로 플러시합니다.
   11. 이전 단계를 2-3회 반복하여 조직을 적절하게 분리합니다.
   12. 페트리 접시를 얼음 위에 다시 놓고 각 종양의 다른 5개 접시에 대해 단계(4.1.1-4.1.12)를 반복합니다.
2. 종양 조직을 수동으로 처리(M 방법)
   1. 첫 번째 플라스틱 페트리 접시(단계 2.5)의 종양 조직을 3mL의 H-GPSA 배지(표 2)와 함께 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 현미경으로 수동으로 두 개의 메스를 사용하여 세그먼트를 0.5mm 섹션으로 해부합니다.
   2. 2mL 피펫을 사용하여 절개된 조직을 플라스틱 페트리 접시에 다시 옮깁니다.
   3. 다른 5개의 페트리 접시(2.5단계)의 종양 절편에 대해 단계(4.2.1.-4.2.3.)를 반복합니다.

5. 종양 조직 세척

1. 각 페트리 접시를 위쪽으로 45°로 기울이고 종양 덩어리가 접시 바닥으로 가라앉을 때까지 30초 동안 기다립니다.
2. 1mL 피펫을 사용하여 H-GPSA 배지(표 2) 2.5mL를 조심스럽게 흡입하고 종양 조직을 차지하지 않도록 주의하십시오.
3. 각 샘플에 2mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가합니다. 처리된 종양 조각은 용해 완충액으로 완전히 덮어야 합니다.
4. 6개의 접시를 실험실 궤도 진탕기에 10분 동안 저속으로 놓습니다.
5. 용해 완충액 2mL를 종양 조직을 차지하지 않도록 조심스럽게 흡입합니다.
6. 매번 용해 완충액 대신 2mL의 H-GPSA 배지(표 2)를 사용하여 이전 세척 단계(단계 5.1-5.5)를 두 번 반복합니다.

6. 종양 조직 배양

1. 각 접시에서 H-GPSA 배지(표 2)를 흡입하고 4mL의 PDO 배지(표 2)로 교체합니다.
2. 각 접시의 조직 덩어리를 초저 부착 6웰 플레이트의 각각의 웰로 옮깁니다( 재료 표 참조).
3. 플레이트를 인큐베이터 내부의 오비탈 셰이커에 놓고 37°C, 5%_CO2 및 150rpm에서 2-4주 동안 배양합니다.
4. 각 웰에서 2mL의 배지를 흡입하고 37°C로 사전 예열된 2mL의 신선한 PDO 배지(표 2)로 교체하여 이틀에 한 번씩 절반 배지 교체를 수행합니다.
5. 현미경으로 조직(형태, 성장, 중간 색상)을 관찰하고 성장하는 PDO(>0.7mm) 또는 접착 조직을 절단하여 조직 저산소증을 방지합니다.
   1. 이렇게하려면 PDO를 초저 부착물에서 멸균 된 유리 페트리 접시로 옮기고 메스를 사용하여 절단하십시오. 또는 접착 PDO를 1mL 피펫으로 흡입하여 분리할 수 있습니다. PDO를 쥐어짜지 않도록 주의하고 부드럽게 다루십시오.
6. 이틀에 한 번씩 PDO를 계산하여 PDO 형성을 평가하고 원하는 원형 형태를 철저히 확인합니다(그림 2).

7. PDO 고정 및 임베딩

1. 배양 6주 후 24시간 동안 4% 포르말린으로 각 환자의 각 웰에서 두 개의 PDO를 고정합니다.
2. 고정된 PDO를 중성 완충액(인산나트륨) 포르말린에 담그고 임베딩할 때까지 담그십시오.
3. 추가 처리를 위해 각 PDO를 카세트( 재료 표 참조)에 넣습니다.
4. 아래 참고에 언급된 대로 다음 용액에 카세트를 담그고 탈수 과정을 시작합니다.
   참고: 50% 에탄올 20분, 70% 에탄올 20분, 80% 에탄올 20분, 96% 에탄올 20분, 100% 에탄올 20분, 100% 에탄올 30분, 100% 에탄올 + 클로로포름(1:1 비율) 30분, 100% 에탄올 + 클로로포름(1:1 비율) 30분, 앱솔루트 클로로포름 30분, 파라핀은 30분, 파라핀은 STP 120을 사용하여 30분.
5. 탈수된 PDO를 58-60°C의 파라핀 왁스에 내장합니다.
6. 내장된 PDO를 2.5μm 두께로 슬라이스하고 염색을 위해 슬라이드에 장착합니다.

8. 면역형광 염색

1. 6주 배양 후 PDO를 장착합니다.
2. 이어서, 이전에 보고된 바와 같이 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP, 희석: 1:100) 및 증식 마커 Ki67(희석: 1:1000)( 재료 표 참조)에 대해 이중 염색을 수행합니다(²²).
3. 유사하게, GFAP 및 항-카스파제-3(CC3, 희석: 1:400)에 대해 PDO를 이중 염색하여 세포사멸을 평가합니다( 재료 표 참조).
4. 형광 현미경을 사용하여 40x 배율로 PDO의 이미지를 캡처합니다.
5. GFAP-, Ki67 및 CC3 양성 세포와 GFAP/Ki67 및 GFAP/CC3 이중 양성 세포에 대한 이미지를 분석합니다.
6. 이미지 분석을 위해 오픈 소스 프로그램 Fiji(ImageJ-win 32)를 활용합니다.

9. 평가 및 데이터 분석

1. 배양 첫 주에 표준 설정 및 5배 배율로 매일 현미경으로 밝은 시야 사진을 캡처할 수 있습니다.
2. 형태학적 변화를 관찰하고 수동 및 자동 처리 접근 방식 모두에서 성숙 과정을 추적합니다.
3. 표준 명시야 모드 설정에서 현미경을 사용하여 형태학적 분석을 수행합니다.
4. 5명의 환자 모두의 PDO에서 배양 첫 4주 동안 PDO 수와 형태를 평가합니다.
5. 각 환자로부터 각 PDO 카운트에 대한 세 개의 판독값을 얻어 평균의 평균과 표준 오차(SEM)를 계산합니다.
6. 3명의 환자로부터 PDO의 증식과 세포사멸을 조사합니다.
7. 시중에서 판매되는 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 분석합니다( 자료표 참조).
8. Students-T 및 Mann-Whitney U 테스트를 적용하여 PDO 수, 증식 및 세포 사멸 측면에서 수동 PDO 생성과 자동 PDO 생성 간의 차이점을 확인합니다.

교모세포종(GBM) 환자 4명과 LGG 환자 1명은 숙련된 신경병리학자(CMM)의 병리학적 확인 후 포함되었습니다. 대부분의 환자는 메틸화되지 않은 MGMT 프로모터를 가지고 있었고, 모든 교모세포종 환자는 IDH1 및 IDH2 야생형이었다(표 1). 평균적으로 제조 공정은 C 접근 방식에서 88.8분(+/- 6.3분), M 접근 방식에서 322분(+/- 17.2분) 동안 지속되었습니다. 전체 성공률은 4주 배양 후 수작업에서 87%, 초퍼 접근법에서 93%였습니다(n=5). 더욱이, C군에서 유래한 PDO는 1주일 이내에 원하는 둥근 모양에 도달하고 시험관 내 실험에 사용할 수 있을 만큼 충분히 성숙한 반면, M군의 PDO는 대부분 날카롭게 가장자리가 있고 정의되지 않은 상태로 남아 있었습니다(그림 2). C 접근법으로 처리된 종양 조직은 배양 첫 주 후 전체 281개의 PDO(환자당 평균 = 56 +/- 43)를 생성한 반면, M 접근법으로 250개의 PDO(환자당 평균 = 50 +/- 41)가 생성되었습니다. 배양 2주 동안, 5명의 환자 모두의 조직은 C 접근법으로 생성되었을 때 더 높은 PDO 수치를 산출했습니다(801; 환자당 평균= 130 +/- 38)과 M 접근법(601; 환자당 평균 = 76 +/- 44; P = 0.018)입니다. 배양 3주차 동안 C 접근법은 모든 환자로부터 전체 1105개의 PDO(환자당 평균 = 221 +/- 32)를 누적한 반면, M 접근법(P =0.032)에서는 771개의 PDO(환자당 평균= 155 +/- 34)를 누적했습니다. 또한, C 접근법을 사용하여 생성했을 때 4주간의 배양 후 총 1195개의 PDO(환자당 평균= 239 +/- 50)가 형성된 반면, M 접근법(P < 0.01)을 사용한 경우 784개(환자당 평균= 157 +/- 36)가 생성되었습니다. 따라서 C 방법은 두 번째 주부터 훨씬 더 높은 PDO 수를 보여주었습니다(그림 3). 또한 PDO 수의 상대적 변동을 평가하여 연속 주 간의 동적 추세를 탐색했습니다. 분석 결과, C 접근법의 첫 번째 주에서 두 번째 주(265%)로 전환하는 동안 PDO 수가 크게 급증했으며, 이는 빠른 진전을 나타냅니다. 그 후, 셋째 주(75%)에는 증가율이 낮아져 일시적인 조정이 반영되었습니다. 대조적으로, M 접근법은 PDO 카운트의 일관되고 꾸준한 증가를 보여주었으며(둘째 주에 92%, 셋째 주에 각각 67%), 이는 넷째 주에 카운트의 놀라운 안정성에 기여했습니다. PDO 수의 이러한 일관된 상승 추세는 관찰 기간 동안 C 접근법의 신뢰성과 복원력을 강조합니다.

2명의 교모세포종 환자와 1명의 LGG 환자가 PDO 내 성상세포 수(GFAP), PDO 세포 증식(Ki67) 및 세포사멸(CC3) 분석을 위해 포함되었습니다. 결정된 성상세포 수는 C 접근법에서 평균 43%, M 접근법에서 45%로 두 처리 방법 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다(그림 4 및 그림 5, 보충 그림 1 및 보충 그림 2). 마찬가지로, PDO 내 증식률은 C(3%)와 M(1%) 접근법 간에 비슷했습니다. 환자 5의 C 접근법으로 생성된 PDO만이 26%의 증식률을 보인 반면, M 접근법은 1%를 보였다(P =0.001; 그림 4C). 전반적으로 낮은 세포사멸 비율은 C 접근법으로 처리된 PDO에서 검출되었으며(3%), 모든 환자에 대한 M 접근법의 2%에 비해 유의한 차이가 없었습니다(그림 5C). 또한, 세포사멸을 겪는 성상세포의 수와 관련하여 두 방법 간에 유의한 차이가 없었습니다(그림 5D).

그림 1: 자동 다지기를 사용한 환자 유래 오가노이드(PDO) 제조 공정과 수동 접근 방식을 비교한 그래픽 개요. 그림은 (A) 샘플 수집, (B) 종양 물질 해부, (C) 세척 및 (D) 배양을 포함하여 관련된 다양한 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 배양 첫 주 동안의 PDO 형태. 자동 초퍼와 수동 방법을 모두 사용한 PDO 해부 후 형성 비교. 스케일 바 = 1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 배양 첫 4주 동안의 PDO 수. x축은 시간(주)(W)을 표시하고, y축은 C(파란색) 및 M(빨간색) 접근 방식(n = 5)의 PDO 수를 표시합니다. 각 데이터 점은 평균 카운트를 나타내며 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: PDO 내 세포 증식률. (A) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 GFAP 양성 세포(녹색), Ki67 양성 세포(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(n = 3)(표 1). 모든 PDO는 초퍼(C) 및 수동(M) 방법을 사용하여 처리되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) GFAP 양성 세포, (C) Ki67 양성 세포 및 (D) Ki67/GFAP 이중 양성 세포의 상대적 수에 관한 두 가지 방법의 비교. 유의하지 않은 결과는 "ns"로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: PDO 내 세포사멸 비율. (A) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 GFAP 양성 세포(녹색), CC3 양성 세포(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(n = 3)(표 1). 모든 PDO는 초퍼(C) 및 수동(M) 방법을 사용하여 처리되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) GFAP 양성 세포, (C) CC3 양성 세포 및 (D) CC3/GFAP 이중 양성 세포의 상대적 수에 관한 두 가지 방법의 비교. 유의하지 않은 결과는 "ns"로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 환자의 특성 및 임상 매개변수. GBM = 교모세포종, IDH-야생형, CNS WHO 등급 4; LGG = 저등급 신경교종; KPS = Karnofsky 성과 점수; MGMT = O6-메틸구아닌-DNA 메틸전이효소; IDH1 = 이소시트레이트 탈수소효소 1, IDH2 = 이소시트레이트 탈수소효소 2, ATRX = α-지중해빈혈/정신지체, X-결합 유전자; M = 형태; CC = 셀 수; p = 증식; A = 세포사멸. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 중간 조성물. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax Pencillin 스트렙토마이신 암포테리신 B. PDO = 환자 유래 오가노이드 DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium. NEAA: 비필수 아미노산. 펜 연쇄상 구균 : 페니실린 / 스트렙토 마이신 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 세포 배양 모델을 생성하는 데 사용되는 기법의 개요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: PDO의 증식 염색의 개별 채널. (A) DAPI(파란색), (B) GFAP 양성 세포(녹색), (C) Ki67 양성 세포(빨간색) 및 (D) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 오버레이 채널. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: PDO의 세포사멸 염색의 개별 채널. (A) DAPI(파란색), (B) GFAP 양성 세포(녹색), (C) CC3 양성 세포(빨간색) 및 (D) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 오버레이 채널. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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