Erasmus Ladder를 사용한 생쥐의 미세 및 연상 운동 학습 모니터링

요약

이 기사에서는 Erasmus Ladder라는 장치를 사용하여 소근육 운동 성능에 대한 비침습적이고 자동화된 평가와 도전에 대한 적응 및 연상 운동 학습을 허용하는 프로토콜을 제시합니다. 작업 난이도를 적정하여 주요 정도에서 미묘한 정도에 이르는 운동 장애를 감지할 수 있습니다.

초록

행동은 행동에 의해 형성되며, 행동에는 힘, 조정력 및 학습과 같은 운동 기술이 필요합니다. 생명을 유지하는 데 필수적인 행동 중 어느 것도 한 자세에서 다른 자세로 전환할 수 있는 능력 없이는 불가능할 것입니다. 불행히도 운동 능력은 다양한 질병에서 손상될 수 있습니다. 따라서 세포, 분자 및 회로 수준에서 운동 기능의 메커니즘을 조사하고 운동 장애의 증상, 원인 및 진행을 이해하는 것은 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. 이를 위해 마우스 모델이 자주 사용됩니다.

이 기사에서는 Erasmus Ladder라는 자동화된 도구를 사용하여 생쥐의 운동 성능 및 학습의 다양한 측면을 모니터링할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 분석은 두 단계로 나뉘는데, 하나는 생쥐가 불규칙한 가로대로 만들어진 수평 사다리를 탐색하도록 훈련되는 초기 단계("소근육 운동 학습")이고, 다른 하나는 움직이는 동물의 경로에 장애물이 있는 두 번째 단계입니다. 섭동은 예상치 못한 것("도전적인 운동 학습")이거나 청각적 신호음("연관 운동 학습")이 선행될 수 있습니다. 이 작업은 수행하기 쉽고 자동화된 소프트웨어에 의해 완벽하게 지원됩니다.

이 보고서는 민감한 통계적 방법으로 분석했을 때 테스트의 다양한 판독값을 소규모 마우스 코호트를 사용하여 마우스 운동 능력을 미세 모니터링할 수 있는 방법을 보여줍니다. 우리는 이 방법이 환경 변형에 의한 운동 적응뿐만 아니라 운동 기능이 손상된 돌연변이 마우스의 초기 단계의 미묘한 운동 결함을 평가하는 데 매우 민감할 것이라고 제안합니다.

서론

생쥐의 운동 표현형을 평가하기 위해 다양한 테스트가 개발되었습니다. 각 검사는 운동 동작의 특정 측면에 대한 정보를 제공한다¹. 예를 들어, 오픈 필드 테스트는 일반적인 운동 및 불안 상태에 대해 알려줍니다. 로타로드와 워킹 빔은 조정과 균형에 대한 테스트를 수행합니다. 발자국 분석은 보행에 관한 것입니다. 강제적 또는 자발적 신체 운동에 대한 러닝 머신 또는 러닝 휠; 그리고 복잡한 바퀴는 운동 기술 학습에 관한 것입니다. 마우스 운동 표현형을 분석하기 위해 조사관은 이러한 테스트를 순차적으로 수행해야 하며, 여기에는 많은 시간과 노력이 필요하며 종종 여러 동물 코호트가 필요합니다. 세포 또는 회로 수준의 정보가 있는 경우 조사자는 일반적으로 관련 측면을 모니터링하고 거기에서 후속 조치를 취하는 테스트를 선택합니다. 그러나 자동화된 방식으로 운동 행동의 다양한 측면을 구별하는 패러다임은 부족합니다.

이 기사에서는 생쥐의 다양한 운동 학습 기능을 종합적으로 평가할 수 있는 시스템인 Erasmus Ladder ^2,3을 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 주요 장점은 운동 난이도를 적정하고 운동 성능의 결함을 손상된 연상 운동 학습과 분리할 수 있는 능력과 함께 방법의 재현성 및 민감도입니다. 주요 구성 요소는 사다리에서 마우스의 위치를 감지하는 터치 감지 센서가 장착된 교차 높은(H) 및 낮은 가로대가 있는 수평 사다리로 구성됩니다. 사다리는 2 x 37 가로대(L, 6mm; H, 12mm)는 서로 15mm 간격으로 30mm 간격으로 좌우 교대 패턴으로 배치됩니다(그림 1A). 가로대를 개별적으로 움직여 다양한 난이도, 즉 장애물을 만들 수 있습니다(높은 가로대를 18mm 올림). 에라스무스 사다리는 자동 기록 시스템과 함께 가로대 패턴의 수정을 감각 자극과 연관시켜 환경적 문제(장애물을 시뮬레이션하기 위한 더 높은 가로대의 출현, 무조건 자극[US]) 또는 감각 자극(음색, 조건 자극[CS])과의 연관성에 대한 반응으로 소근육 운동 학습 및 운동 성능 적응을 테스트합니다. 테스트에는 두 가지 단계가 포함되며, 각 단계는 4일 동안 운동 성능 향상을 평가하며, 이 기간 동안 쥐는 하루에 42회 연속 시험을 거칩니다. 초기 단계에서 쥐는 "미세한" 또는 "숙련된" 운동 학습을 평가하기 위해 사다리를 탐색하도록 훈련됩니다. 두 번째 단계는 움직이는 동물의 경로에 더 높은 가로대 형태의 장애물이 제시되는 인터리브 시험으로 구성됩니다. 섭동은 "도전적인" 운동 학습을 평가하기 위해 예상치 못한 것일 수도 있고(미국만 해당) "연상" 운동 학습을 평가하기 위해 청각적 톤으로 발표될 수도 있습니다(쌍체 시험).

에라스무스 사다리는 비교적 최근에^{개발되었다 2,3}. 프로토콜을 설정하고 최적화하는 데 집중적인 노력이 필요하고 다른 운동 결함을 드러낼 수 있는 가능성을 자세히 탐색하지 않고 소뇌 의존 연상 학습을 평가하도록 특별히 설계되었기 때문에 광범위하게 사용되지 않았습니다. 현재까지 생쥐 ^3,4,5,6,7,8의 소뇌 기능 장애와 관련된 미묘한 운동 장애를 밝히는 능력이 검증되었습니다. 예를 들어, 감람소 뉴런에서 간극 연접이 손상된 connexin36 (Cx36) 녹아웃 마우스는 전기긴장 결합의 부족으로 인해 발화 결함을 보이지만 운동 표현형을 정확히 찾아내기가 어려웠습니다. 에라스무스 사다리(Erasmus ladder)를 이용한 실험은 소뇌 운동 학습 과제에서 하부 감람소 뉴런의 역할은 자극의 정확한 시간적 코딩을 암호화하고 예상치 못한 사건에 대한 학습 의존적 반응을 촉진하는 것임을 시사했다 ^3,4. Fragile X-Syndrome(FXS)의 모델인 Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1(Fmr1) 녹아웃 마우스는 절차적 기억 형성의 경미한 결함과 함께 잘 알려진 인지 장애를 나타냅니다. Fmr1 녹아웃은 에라스무스 래더(Erasmus Ladder)의 세션에 비해 걸음 수, 시도당 실수 또는 운동 성능 향상에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 야생형(WT) 새끼에 비해 갑자기 나타나는 장애물에 대한 보행 패턴을 조정하지 못하여 특정 절차적 및 연관 기억 결함을 확인했습니다 ^3,5. 또한, Purkinje 세포 출력, 강화, 분자층 인터뉴런 또는 과립 세포 출력 장애를 포함하여 소뇌 기능에 결함이 있는 세포 특이적 마우스 돌연변이 계통은 효율적인 걸음 패턴의 획득 변화와 사다리를 건너기 위해 취한 걸음 수에 따른 운동 협응에 문제가 있는 것으로 나타났다⁶. 신생아 뇌 손상은 소뇌 학습 결핍과 Purkinje 세포 기능 장애를 유발하며 Erasmus^{Ladder 7,8}에서도 감지할 수 있습니다.

이 비디오에서는 행동실 설정, 행동 테스트 프로토콜 및 후속 데이터 분석을 자세히 설명하는 포괄적인 단계별 가이드를 제공합니다. 이 보고서는 접근하기 쉽고 사용자 친화적으로 작성되었으며 신규 이민자를 지원하기 위해 특별히 설계되었습니다. 이 프로토콜은 운동 훈련의 다양한 단계와 생쥐가 채택하는 예상 운동 패턴에 대한 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, 이 기사는 강력한 비선형 회귀 접근 방식을 사용하여 데이터 분석을 위한 체계적인 워크플로우를 제안하며, 다른 연구 맥락에서 프로토콜을 적용하고 적용하기 위한 귀중한 권장 사항 및 제안으로 완성됩니다.

프로토콜

본 연구에서는 남녀 모두의 성체(2-3개월령) C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 동물들은 관찰 중인 동물 단위에서 먹이와 물에 대한 자유로운 접근을 통해 케이지당 2-5마리를 수용하고 12시간 어두움/밝음 주기로 온도 제어 환경에서 유지되었습니다. 모든 절차는 유럽 및 스페인 규정(2010/63/UE; RD 53/2013)에 의해 승인되었으며 발렌시아나 총사령부 윤리위원회와 미겔 에르난데스 대학교 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 행동실 설정

1. 매일 같은 시간에 행동 검사실을 예약하고 사용할 마우스의 목록과 순서, 호스팅 준비를 설정합니다.
2. 실험용 마우스를 시험실 밖에 두어 시험을 치르지 않을 때 공기 압축기 소리와 Erasmus Ladder 신호음을 듣지 못하게 하십시오.
3. Erasmus Ladder 시스템의 모든 구성 요소(네트워크 라우터, 소프트웨어가 있는 컴퓨터( 재료 표 참조), 공기 압축기, 두 개의 골 박스 및 가로대가 올바른 위치에 있는 사다리와 같은 모든 구성 요소가 순서대로 있고 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오.
4. 골 박스, 사다리 및 가로대를 각 동물이 끝난 후에는 물로 광범위하게 청소하고 훈련이 끝날 때 물과 70% 에탄올로 청소하십시오.

2. 행동 테스트 프로토콜

1. 실험을 생성하고 소프트웨어에 프로토콜을 입력합니다(보충 그림 S1).
   1. 소프트웨어를 켭니다.
   2. 실험을 만들려면 File(파일) | 새로운 실험 | 새로 만들기 또는 설정 | 실험 프로토콜.
      참고: 이 연구에 사용된 기본 프로토콜의 이름은 EMC이며 로테르담의 에라스무스 대학 의료 센터에서 설계되었습니다.
   3. 실험에 이름을 지정하고 확인을 클릭합니다.
   4. 선택한 기본 EMC 프로토콜이 4일간의 방해받지 않는 세션(하루에 방해받지 않는 42번의 시도)과 4일의 챌린지 세션(42일의 일일 혼합 시도: 방해받지 않음, CS 전용(신호음), 미국 전용(장애물), 페어링됨(신호음으로 알려짐)으로 구성되어 있는지 확인합니다(그림 1B 참조). 오른쪽 패널에서 마우스가 사다리를 건너도록 유도하는 데 사용되는 조명 신호(최대 지속 시간 3초), 공기 신호(최대 지속 시간 45초) 및 순풍(모든 시도 유형에서 예)과 신호음(250ms, CS 전용 및 페어링 시도에서만 예)도 확인합니다.
   5. 다른 프로토콜을 생성하려면 설정 | 실험 프로토콜 | 새로 만들기 | 처음부터 또는 EMC 프로토콜에서 복사 하여 세션 수(실험 일수) 및 일일 시행 횟수 및 유형과 관련된 테이블 라인을 편집하여 간단히 수정하십시오.
      알림: 휴식 시간, 신호 유형 및 활성화, 지속 시간, 강도 및 간격도 실험 질문에 따라 조정할 수 있습니다.
   6. 세션 목록을 열고 주제의 이름을 지정하려면 [Setup] | 세션 목록.
   7. Add Subjects and Variables(주제 및 변수 추가)를 클릭합니다.
   8. 정렬된 마우스 목록에 따라 각 특정 마우스 식별자, 생년월일, 성별, 유전자형 및 관련 범주를 입력합니다.
2. 세션을 시작합니다(보충 그림 S2).
   1. 시작하기 전에 소프트웨어가 열려 있는지 확인한 다음 래더를 켜십시오.
   2. 공기 압축기가 연결되어 있고 켜져 있는지 확인하십시오.
   3. 획득 창을 열려면 생성된 실험을 엽니다.
   4. 획득 | 취득을 엽니다.
   5. 소프트웨어가 표시한 식별자가 있는 마우스를 시작 목표 상자(래더의 오른쪽)에 놓습니다.
   6. 첫 번째 세션에서 획득할 마우스 식별자 를 선택합니다.
   7. Start Acquisition(획득 시작)을 클릭합니다.
   8. 빨간색 사다리 메뉴 노브를 3번 누릅니다. 세션이 시작되고 세션의 마지막 시도가 끝날 때까지 마우스 움직임을 자동으로 제어하고 기록하는지 확인합니다.
3. 세션을 종료합니다.
   1. 42^번째 시도가 끝나면 디스플레이에 데이터 전송 및 획득 메시지가 표시되는지 확인합니다.
   2. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
   3. 사다리와 골 박스를 청소하십시오.
   4. 다음 마우스를 놓고 2.2.6단계부터 반복합니다.
4. 프로토콜이 끝날 때까지 매일 선택한 유형의 세션을 수행합니다. 선택한 프로토콜에 따라 매일 2.2단계와 2.3단계를 반복합니다.
5. 데이터를 내보냅니다(보충 그림 S2).
   1. 기록된 데이터를 시각화하려면 분석(Analysis ) 메뉴에서 시행 통계(Trial Statistics), 세션 통계(Session statistics) 및 그룹 통계 및 차트(Group Statistic & Charts)를 선택합니다.
      참고: 데이터는 개별 시험에 대한 데이터와 세션 내 동일한 시험 유형의 평균이 포함된 스프레드시트로 다운로드할 수 있습니다. 세션은 특정 분석을 위해 선택한 변수로 필터링할 수도 있습니다.
   2. 오른쪽 상단 모서리에 있는 내보내기 버튼을 클릭하여 파일 형식(스프레드시트)과 폴더 위치를 선택합니다.
   3. 자동으로 생성된 차트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 파일에 *.jpg로 저장을 선택합니다.

3. 데이터 분석

알림: 매개변수 목록은 터치 감지 센서의 활동에 대한 즉각적인 기록을 기반으로 Erasmus Ladder에 의해 자동으로 측정됩니다. 분석을 위해 사용자가 선택한 출력 매개변수가 스프레드시트에서 구성 및 처리됩니다. 소프트웨어로 생성된 그래프와 함께 사용자는 선택한 그래프 소프트웨어를 사용하여 그래프를 생성하여 세션 동안 다양한 매개변수의 특정 변경 사항을 시각화할 수 있습니다.

1. 처음 4일 동안 기초 동기 또는 불안 상태, 감각 반응, 운동 성능 및 소근육 운동 학습을 분석하기 위해 특정 매개변수를 선택합니다.
   1. 목표 상자의 휴식 시간, 빛과 공기 신호에 대한 반응으로 휴식 시간 후 목표 상자를 종료하는 시간을 포함한 제어 파라미터를 선택하고 플로팅합니다(그림 2A).
      알림: 휴식 시간이나 신호에 대한 반응은 WT 마우스에서 비교적 일정합니다. 출구 빈도와 같은 다른 매개 변수는 WT 마우스에서 기본적으로 무시할 수 있습니다 - 동물은 단서없이 휴식 상자를 떠나거나 사다리에서 한 번 돌아 오는 경우가 거의 없으므로 출구 빈도는 시도 당 1과 같습니다. 큐가 적용되기 전에 동물이 나가면 공기 흐름이 활성화되어 마우스가 골 상자로 돌아가도록 합니다. 이것은 소프트웨어에 의해 평가판으로 계산되지 않습니다.
   2. 마우스가 골 박스를 떠난 후 사다리를 건너는 데 소요된 시간으로 측정된 큐 후 래더의 시간을 선택하고 표시합니다(그림 2B).
      참고: 거듭제곱 비선형 회귀는 학습을 평가하기 위한 강력한 방법입니다. Pearson 또는 Spearman 계수(R)는 데이터 피팅이 양호한지 여부에 대한 측도를 제공합니다(동물이 세션을 통해 학습/개선할 때 R 값이 1에 가깝습니다. R 값이 0에 가까우면 데이터가 일정하고 마우스가 학습하지 않음을 의미합니다.
   3. 실수가 있는 시행의 비율과 같은 스테핑 패턴 파라미터를 선택하고 플로팅합니다(그림 2C).
      1. 올바른 계단을 계단의 길이에 관계없이 높은 횡선에서 다른 높은 횡선(H-H)으로의 단계로 정의합니다. 낮은 가로대를 포함하는 단계 유형을 실수라고 생각하십시오.
      2. 올바른 단계와 실수를 누른 가로대 사이의 단계의 길이와 방향에 따라 짧은 단계와 긴 단계, 백스텝 및 점프로 나눕니다( 그림 1A 참조).
2. 지난 4일 동안 도전 운동 학습(미국 전용 시험) 및 연상 학습(쌍체 시험)을 평가하기 위해 특정 매개변수를 선택하고 플롯합니다.
   1. 큐 후 래더의 시간을 선택하고 플로팅합니다(그림 3).
   2. 실수가 있는 시행의 백분율을 선택하고 플로팅합니다(그림 4A).
   3. 사다리의 같은 쪽에 있는 장애물 직전(제어 단계)과 장애물 후(적응 단계) 사이의 횡선 활성화 사이의 ms 정밀도 차이로 정의되는 섭동 전후 단계 시간을 선택하고 플로팅합니다(그림 4B).
      참고: 섭동 전과 후 단계 시간 분석을 수행하여 각 세션 유형 내의 데이터를 비교해야 합니다. 매개변수는 연상 학습 중에 장애물을 예측하고 극복하는 마우스의 능력을 측정합니다.
3. 전용 통계 소프트웨어(예: SigmaPlot)로 데이터를 분석합니다. 세션 전반에 걸쳐 동일한 시행 유형에서 수집된 데이터에 대해 검정력 비선형 회귀 분석을 수행하여 학습 프로세스를 보다 효율적으로 설명하고 이원 반복 측정(RM) 분산 분석을 사용하여 시행 유형 간에 비교할 수 있습니다.

결과

적용된 Erasmus Ladder 장치, 설정 및 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜은 4개의 방해받지 않는 세션과 4개의 챌린지 세션(각각 42개의 시도)으로 구성됩니다. 각 시도는 시작 골 박스와 끝 골 박스 사이의 사다리에서 한 번씩 진행됩니다. 세션이 시작될 때 마우스가 시작 상자 중 하나에 배치됩니다. 15초± 5초("휴식" 상태)의 설정 시간이 지나면 조명이 켜집니다(큐 1, 최대 3초). 그런 다음 가벼운 공기 신호(큐 2, 최대 45초)를 적용하여 쥐가 상자를 떠나 반대쪽 끝으로 걸어가도록 유도합니다. 공기 신호에 반응하는 시간은 마우스와 세션에 따라 다를 수 있으며 그룹 간의 동기 부여 또는 불안 상태를 비교하기 위한 매개변수로 사용할 수 있습니다. 마우스가 최종 목표 상자에 도달한 후 즉시 새 시도가 시작됩니다.

1-4일차에 걸쳐 WT 마우스에서 휴식 시간과 광 신호에 반응하는 시간의 차이는 관찰되...

토론

에라스무스 사다리(Erasmus Ladder)는 현재의 접근법을 넘어 운동 표현형 평가에 큰 이점을 제공합니다. 검사는 수행하기 쉽고, 자동화되고, 재현 가능하며, 연구자들이 단일 마우스 코호트를 사용하여 운동 행동의 다양한 측면을 개별적으로 평가할 수 있도록 합니다. 현재 연구에서 재현성을 통해 소수의 WT 마우스로 장치, 실험 설계 및 분석 방법의 기능을 활용하여 강력한 데이터를 생성할 수 있었습니다. 예를 들어, 기존의 빔 워크 분석과 비교할 때 사다리 경로로 들어가기 위한 동기 부여 단서(공기 및 빛)와 시험을 완료하기 위한 순풍을 추가하면 일관성이 향상되고 변동성의 주요 원인인 실험자 개입의 필요성을 건너뛸 수 있습니다.

마우스의 방향과 위치에 맞게 조정할 수 있는 공기 흐름을 생성하려면 공기 압축기 시스템이 필요합니다. 기류는 예정된 시험 시작 전에 쥐가 골 박스를 떠나려고 할 때 반대 방향에서 30km/h의 역풍을 생성하여 마우스가 골 박스로 돌아오게 합니다. 또한 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J 마우스 (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot 소프트웨어	Systat Software, Inc.