본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.
서론
대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
포르말린 고정 인체 조직 샘플은 매사추세츠 종합병원(MGH) 부검 서비스(미국 보스턴)의 신경병리학과에서 제공하였다. 서면 동의는 Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC, 프로토콜 2003P001937)의 IRB 승인 조직 수집 프로토콜에 따라 사망 전에 건강한 참가자로부터 얻었습니다. 승인 문서는 미국 매사추세츠주 보스턴에 있는 MGH 부검 서비스에 보관되며 요청 시 제공됩니다.
1. 아가로스 임베딩 및 시료 절단
- 비커에 4x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% w/v 아가로스 용액을 준비하고 내부에 조직 블록을 삽입합니다. 실온(RT)에 도달할 때까지 기다렸다가 4°C에서 24시간 동안 보관합니다.
- 고정밀 절편을 얻으려면 샘플을 비브라톰의 시편 디스크에 붙이고 트레이를 차가운 1x PBS(pH 7.4)로 채웁니다. 슬라이스할 조직의 유형에 따라 주파수, 진폭 및 속도와 같은 진동 매개변수를 조정합니다(사용된 값: 주파수 = 5(50Hz), 진폭 = 0.4, 속도 = 3(0.15mm/s).
알림: 샘플 볼륨에 따라 다른 진동을 사용해야 합니다. 최대 부피가 70 x 40 x 15 mm인 샘플의 경우 진동체(예:....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에 설명된 프로토콜은 SHORT 방법을 사용하여 두께가 100μm에서 500μm에 이르는 여러 슬라이스를 동시에 처리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 전체 절차의 전체 처리 시간을 크게 줄입니다. 이 작업에서는 여러 사후 인간 뇌 두께 절편을 동시에 처리하기 위한 전체 파이프라인(그림 1)에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 한 번에 24개 슬라이스에 대한 프로토콜을 시연합니다(그림 2A). 투명화 및 공동 라벨링 기간은 이미징 및 이미징 후 처리를 제외하고 샘플의 크기와 두께를 고려하여 11일에서 30일 사이입니다(표 1). TDE에서 탈지질화 및 굴절률 매칭 후 회백질과 백질 모두에서 모든 조직 절편의 최적이고 균일한 투명도가 달성됩니다(그림 2B).
이미지 획득은 컨포칼
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.
다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하면 클리어링 및 다중 라벨링 단계에 정교한 맞춤형 장비가 필요하지 않습니다. 대량의 검체를 모두 처리할 수 있어 대형 인간 뇌 조직 블록의 처리 시간을 단축하고 기술적 변동성을 최소화할 수 있습니다.
탈색 및 에피토프 마스킹 해제 처리는 노후화되고 포르말린으로 고정된 인체 조직으로 작업할 때 매우 중요합니다. 과산화수소 및 알칼리 항원 회수 용액은 iDISCO 6,28
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구에서 분석된 인간 뇌 표본을 제공해 주신 매사추세츠 종합 병원, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology의 Bruce Fischl에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 보조금 계약 번호 654148(Laserlab-Europe)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램으로부터, 특정 보조금 계약 번호 785907(Human Brain Project SGA2) 및 No. 945539(Human Brain Project SGA3)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation으로부터 자금을 지원받았으며, 수상 번호 U01 MH117023에 따라 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 종합병원 법인 센터(General Hospital Corporation Center)로부터 보조금을 받았습니다. Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI 연구 인프라)의 틀에서 이탈리아 교육부에서. 마지막으로, 이 연구는 "Fondazione CR Firenze"의 기여로 수행되었습니다. 이 작업의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원의 공식....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2,2'- 티오 디 에탄올 | 머크 생명 과학 무역 | ||
| 아세트아미드 >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| 아가로스 높은 EEO | 머크 생명 과학 무역 | A9793 | |
| 붕산 | 머크 생명 과학 S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | 맞춤형 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨 염 이수화물 | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| 글루타르알데히드 | 머크 생명과학 S.R.L. | G7651 | |
| 글리신 | 산타 크루즈 생명 공학 | SC_29096 | |
| 과산화수소 30% | Merck 생명 과학 S.R.L. | ||
| 인큐베이터 ISS-4075 | 실험실 동반자 | / | |
| 광시트 형광 현미경(LSFM)/ | /맞춤형 | ||
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| 현미경 슬라이드 | Laborchimica | / | 맞춤형 |
| 인산염 완충액 식염수 정제 | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | 생산 중단 |
| 칼륨 수소 프탈레이트 | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| 아지드화나트륨 | 머크 생명과학 S.R.L. | S2002 | |
| 나트륨 도데 실 설페이 | 머크 생명 과학 S.R.L. | L3771 | |
| 아황산나트륨 | 머크 생명 과학 S.R.L. | S0505 | |
| 스페이서 | 마이크로 레이저 srl | 맞춤형 | |
| 가래 용기 (나사 뚜껑이있는 접시) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| 트리스베이스 | PanReac AppliChem (ITW 시약) | A4577,0500 | |
| 트리톤 X-100 | 머크 생명 과학 S.R.L. | T8787 | |
| 튜브 | Sarstedt | 62 547254 | |
| 트윈 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| 수조 | Memmert | WNB 7-45 | |
| 항체 및 염료 | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | 희석 사용, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 소 항염소 IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | 희석 사용, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure 알파카 안티 래빗 IgG (H + L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | 희석 사용, 1 : 200 |
| Anti-NeuN 항체 | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | 희석 사용, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin 항체(PV) | Abcam | ab32895 | 희석 사용, 1:200 |
| Anti-Vimentin 항체[V9] - 세포골격 마커(VIM) | Abcam | ab8069 | 희석 사용, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal 항체 | ProteinTech | 12278_1_AP | 희석 사용, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | 희석 중고, 1:100 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG H& L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | 희석 사용, 1:200 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | 희석 사용, 1:200 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H& L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | 희석 사용, 1:200 |
| 당나귀 안티 쥐 IgG H & L (Alexa Fluor 568) 사전 흡착 된 | Abcam | ab175475 | 희석 사용, 1:200 |
| 염소 안티 치킨 IgY H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | 희석 사용, 1:500 |
| 염소 안티 치킨 IgY H& L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | 희석 사용, 1:500 |
| 염소 안티 치킨 IgY H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | 희석 사용, 1:500 |
| 염소 안티 토끼 IgG H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | 희석 사용, 1:200 |
| 재조합 Alexa Fluor 488 Anti-GFAP 항체 | Abcam | ab194324 | 희석 사용, 1:200 |
| Somatostatin 항체 YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | 희석 사용, 1:200 |
| 혈관 활성 장 펩타이드(VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | 희석 사용, 1:200 |
참고문헌
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
