공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

요약

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

초록

여성 불임의 원인을 이해하는 데 있어 가장 큰 어려움은 난모세포라고 하는 여성 생식세포의 발달을 관장하는 메커니즘을 밝히는 것입니다. 난모세포의 발달은 세포 성장과 후속 분열로 특징지어지며, 난모세포가 정자와 융합하여 배아 발생을 시작할 수 있도록 준비하는 두 가지 중요한 단계입니다. 성장하는 동안 난모세포는 세포질을 재조직하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 생쥐와 인간의 성공적인 난모세포 발달을 예측하여 배아 생성 가능성을 예측하는 사건입니다. 쥐 난모세포에서 이러한 세포질 재편성은 세포골격에 의해 주도되는 것으로 나타났으며, 세포골격의 활동은 핵을 교반하고, 재배치하고, 관통하는 기계적 힘을 생성합니다. 결과적으로, 이 세포질에서 핵질로의 힘 전달은 생체 분자 응축물로 알려진 핵 RNA 처리 소기관의 역학을 조정합니다. 이 프로토콜은 높은 시간적 해상도로 생쥐 난모세포의 공간 규모에 걸쳐 세포골격이 핵에 미치는 영향을 문서화할 수 있는 실험적 프레임워크를 제공합니다. i) 난모세포 세포질의 세포골격 활성, ii) 난모세포핵의 세포골격 기반 교반, iii) 난모세포 핵의 생체 분자 응축물 역학에 미치는 영향을 평가하는 데 필요한 이미징 및 이미지 분석 단계와 도구를 자세히 설명합니다. 난모세포 생물학 외에도, 여기에 설명된 방법은 체세포에서 사용하여 규모 전반에 걸쳐 핵 역학의 세포골격 기반 조정을 유사하게 해결할 수 있습니다.

서론

핵 포지셔닝은 여러 세포 및 발달 기능에 필수적이다 ^1,2,3,4,5. 난모세포(oocyte)라고 불리는 포유류 암컷 생식세포는 크기가 비대칭적으로 분할됨에도 불구하고 세포질을 리모델링하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 후속 염색체의 중심에서 벗어난 염색체에 의존합니다⁶(그림 1). 이러한 핵의 중심화는 생쥐와 인간에서 성공적인 난모세포 발달을 예측하며, ^7,8 따라서 배아 형성 잠재력을 예측합니다(그림 1).

마우스 난모세포의 세포질 리모델링은 주로 악토미오신 세포골격(actomyosin cytoskeleton)⁹에 의해 주도됩니다(그림 2). 그 활동은 핵(¹⁰)을 교반하고, 재배치하고, 관통하는 기계적 힘을 발생시킨다(그림 2). 결과적으로, 이러한 세포질-핵질 힘 전달은 생체 분자 응축물 12,13,14,15,16으로 알려진 핵의 여러 막이 없는 소기관 중 하나인 핵 스페클 ¹¹이라고 불리는 핵 메신저 RNA 처리 소기관의 역학을 조정합니다(그림 2).

실시간 이미징은 핵 교반의 기능적 의미를 해독하는 데 결정적인 역할을 했습니다. 액틴 메쉬(actin mesh)와 벌크 세포질(bulk cytoplasm)에 대한 시간적 해상도가 높은 영상뿐만 아니라, 몇 시간에 걸친 핵 이동에 관한 영상은 서로 다른 시간 척도를 연결하는 핵 위치 결정(nuclear positioning)에 대한 이론적 모델을 정교화하는 데 크게 기여했다⁹. 또한, 세포질, 핵 윤곽 및 염색질 및 핵 응축물과 같은 핵 구성 요소의 높은 시간 해상도 동영상은 쥐 난모세포에서 RNA 처리 및 유전자 발현에 대한 핵의 세포골격 기반 교반의 역할을 강조하여 세포 내의 다양한 시공간 규모를 연결했습니다^10,11. 전체적으로, 실시간 이미징을 기반으로 한 이러한 스케일 교차 접근 방식은 핵의 세포골격 교반과 난모세포의 발달 성공을 연결하는 첫 번째 이론적 근거를 제공했습니다.

이 프로토콜은 생쥐 난모세포의 핵 및 내부 구성 요소로의 세포질 힘(주로 F-액틴에 의해 생성되고 부분적으로 미세소관에 의해 생성됨)의 전달을 연구하는 데 사용되는 이미징 및 이미지 분석 파이프라인을 제공합니다. 이러한 실험의 결과는 최근 두 가지 연구^10,11에서 볼 수 있듯이 세포질의 세포골격에서 핵 내부에 이르기까지 공간적 규모에 걸쳐 힘의 연속체를 포착하는 것이며, 이는 세포질 활성 운동, 핵 윤곽의 변동, 단일 유형의 핵 생체 분자 응축물의 움직임 및 표면 변동 사이의 연관성을 확립했습니다. 핵 얼룩. 동일한 접근법이 악성 암세포(¹⁷)의 맥락에서와 같이 세포질 힘이 변화할 것으로 예상되는 다른 모델 시스템에도 적용될 수 있다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 공동체의 지침에 따라 수행되었으며 프랑스 농무부(승인 번호 75-1170)와 DGRI(Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation; GMO 계약 번호 DUO-5291). 마우스는 주변 온도가 22-24°C이고 습도가 40%-50%인 12시간 명/어둠 주기로 동물 시설에 수용되었습니다. 여기에 사용된 마우스는 암컷 OF1(Oncins France 1, 8 내지 12주령) 및 암컷 C57BL/6(10 내지 14주령)을 포함한다.

1. 난모세포 채취 및 준비

1. ¹⁸ 및¹⁹에 기술된 바와 같이 8주에서 14주령 마우스의 난모세포를 수집합니다.
   1. 간단히 말해서, 먼저 난모세포에서 감수분열 재개를 방지하는 1μM 밀리논¹⁹가 보충된 예열된(37°C) M2+소 혈청 알부민(BSA) 배지에¹⁸에서와 같이 생쥐에서 난소를 추출합니다.
   2. 수술용 바늘로 난포를 찔러 난포에서 성장하는 난모세포를 방출합니다(난모세포 성장 종료²⁰).
   3. 난모세포 수집에 특화된 마이크로피펫으로 실험(성장 및/또는 완전히 자란 난모세포)에 필요한 크기의 난모세포를 채취한 후 미네랄 오일 아래에 신선한 배지를 넣어 세척하고 접시에 담습니다.
2. 피펫팅을 상하로 하여 전방 난포 세포에서 난모세포를 기계적으로 분리하고 후속 실험 단계를 진행하기 전에 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 안정화되도록 둡니다.
   참고: 난모세포는 모든 실험 단계에서 37°C로 유지됩니다. 이 프로토콜을 위해 가장 큰 난모세포, 즉 완전히 자란 난모세포를 수집했습니다.

2. 난모세포 미세주사

참고: 세포질에서 세포골격 기반 활동을 포착하기 위해 명시야 라이브 이미징이 사용됩니다. 따라서 형광 마커의 미세 주입이 필요하지 않으며 프로토콜은 3단계에서 재개할 수 있습니다. 핵 윤곽을 이미지화하기 위해 N-말단에 YFP 태그를 표시하고 C-말단^21,22에 CFP 태그를 표시하는 탐사선인 Rango를 사용했습니다. 488nm의 난모세포에서 이미지화하면 뉴클레소체²³을 제외한 전체 핵에 라벨을 붙이고 매우 날카로운 핵 윤곽을 표시합니다. 핵 스페클을 시각화하기 위해 핵 스페클¹¹의 마커인 SRSF2-GFP(NM_011358)를 사용했습니다. 난모세포 수집, 미세주입, 상보적 RNA 번역 및 살아있는 세포 이미징에도 동일한 배지가 사용됩니다.

1. Rango plasmid를 SfiI 또는 SRSF2-GFP plasmid와 AgeI 제한 효소로 선형화합니다.
2. 프로모터(Rango의 경우 T3 및 SRSF2-GFP의 경우 T7)에 따라 적절한 in vitro transcription kit로 캡핑된 상보적 RNA(cRNA)를 합성하고 앞서 설명한 바와 같이 컬럼 정제 키트를 사용하여 정제합니다²⁴.
   참고: 폴리아데닐화 키트를 사용하여 cRNA 안정성을 높이기 위한 폴리아데닐레이트 SRSF2-GFP RNA. 플라스미드 골격의 차이로 인해 두 개의 서로 다른 promoter가 사용됩니다.
3. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 cRNA 농도를 측정합니다.
4. dH₂O에서 Rango cRNA를 1000ng/μL로, SRSF2-GFP cRNA를 600ng/μL로 희석합니다.
5. 미세주입 전 25,000 x g 에서 최소 60분 동안 4°C에서 cRNA 분취액을 원심분리합니다.
6. ^11,25에 설명된 대로 YFP-Rango 또는 SRSF2-GFP를 코딩하는 cRNA를 미세인젝터를 사용하여 37°C M2+ BSA+Milrinone 배지에서 난모세포의 세포질에 주입합니다.
7. cRNA 번역을 위해 37°C의 배양 배지에서 난모세포를 최소 2시간 동안 배양합니다.
8. 난모세포를 미네랄 오일로 덮인 커버 유리 바닥이 있는 35mm 조직 배양 접시의 작은(5μL) 배양 배지 방울에 담습니다. 인접한 난모세포의 광표백을 방지하기 위해 방울당 하나의 난모세포를 배치합니다.

3. 살아있는 세포 화상 진찰

참고: 살아있는 쥐 난모세포는 Plan-APO 40x/1.25 NA 오일 이멀젼 대물렌즈, 전동 스캐닝 데크, 배양 챔버(37°C), 필터 휠에 결합된 CCD 카메라 및 회전 디스크가 장착된 도립 컨포칼 현미경으로 검사되었습니다. 높은 시간 해상도 이미지는 스트림 획득 모드에서 Metamorph(이하 이미징 소프트웨어라고 함)를 사용하여 획득됩니다.

1. 이미징 소프트웨어의 Acquire 창을 엽니다.
2. 노출 시간을 500ms로 설정하고, 카메라 영역을 Full Chip 으로, 비닝을 1로 설정합니다.
3. Acquire 탭에서 필요한 채널에 대한 조명을 설정합니다. 세포질 활동을 이미지화하려면 투과된 빛으로 난모세포를 비춥니다. YFP-Rango 또는 SRSF2-GFP로 표지된 핵을 이미징하려면 491nm의 여기 파장으로 난모세포를 조사합니다.
4. 세포질 교반 또는 YFP-Rango 실험의 경우 투과광으로 쉽게 관찰할 수 있는 난모세포 핵소체에 초점을 맞춥니다(그림 3A). 하나의 단일 비행기가 획득됩니다. 핵 스페클 실험의 경우 SRSF2-GFP 액적에 초점을 맞춥니다(그림 3C).
5. Special 탭에서 수집 속도를 최적화하기 위해 아래와 같이 파라미터를 설정합니다.
   카메라 셔터: 노출을 위해 열림
   클리어 모드: CLEAR PRESEQUENCE
6. 이미징 소프트웨어의 Stream Acquisition 창을 엽니다. 실험에 따라 스트리밍 매개 변수를 설정합니다. 두 연구^10,11 모두에 대해, 아래에 기술된 파라미터를 사용한다.
   1. Acquire 탭에서 다음 매개 변수를 설정합니다.
      획득 모드: RAM으로 스트리밍
      프레임 수: 480 (이미징 시간을 줄이기 위해 240프레임으로 줄일 수 있음)
      카메라 파라미터: 프레임 레이트로 이미지 획득
      건너뛸 프레임 수(Nb): 0
   2. Digital Camera Controller Parameters(디지털 카메라 컨트롤러 매개변수) 탭에서 다음 매개변수를 설정합니다.
      카메라 상태: HALT
      셔터 모드: OPEN NEVER
      클리어 모드: CLEAR PRESEQUENCE
      평균 프레임 수 Nb: 1
      참고 1: 스트림 모드에서 노출 시간이 설정되면 동영상 지속 시간은 프레임 수에 따라 결정됩니다. 예를 들어, 500ms의 노출 시간과 480개의 프레임은 4분 길이의 동영상을 생성합니다. 이미지 획득 중에 미리보기를 표시할 수 있습니다.
7. 객체 주위의 관심 영역(ROI)을 조정합니다. ROI 영역을 최소화하면 획득 시간이 단축됩니다.
8. 스트림 획득(Stream Acquisition) 창에서 획득(Acquire) 을 클릭하여 동영상을 실행합니다.
9. 촬영이 끝나면 동영상을 .tif 파일로 저장합니다.
   알림: 높은 시간 해상도 동영상 중에 핵 구조를 추적하려면 핵 프로브(YFP-Rango 및 SRSF2-GFP)가 이미지 분석의 추가 단계에서 물체의 분할을 용이하게 하기 위해 신호 대 잡음비가 높아야 합니다. 외인성 SRSF2-GFP 발현 프로파일은 내인성 핵 스페클 면역염색과 유사해야 합니다(그림 3C-D). 내인성 염색에 따른 SRSF2-GFP 발현 프로파일의 변화는 고용량의 cRNA 주입 및 번역을 반영할 수 있습니다²⁶(그림 3C-D).

4. 이미지 분석: 세포질 교반

참고: 난모세포에서 액틴 기반 세포골격 활성의 강도를 반영하는 세포질 교반은 실험실⁹ 의 이전 간행물에서²⁷일에 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 이미지 상관 분석에 의해 결정됩니다. 이 소프트웨어는 연속된 이미지 간에 얼마나 많은 픽셀 강도가 보존되는지를 측정합니다. 출력값은 시간에 따른 영상 간의 상관 관계 손실로,⁹에서와 같이 1에서 시작하여 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 감소합니다.

1. Fiji StackReg 플러그인(Plugins>StackReg)을 사용하여 원시 타임랩스 이미지(Δt=0.5초)를 정렬합니다. 플러그인 StackReg²⁸을 설치하려면 BIG-EPFL 업데이트 사이트²⁹ 를 활성화하여 플러그인에 대한 액세스 권한을 얻습니다.
2. 아래 단계에 따라 ~300μm2의 3-4개 세포질 영역에서 명시야 이미지 상관 관계를 계산합니다.
   1. 영역을 자르고 별도의 동영상 파일로 저장합니다. 터미널 창을 엽니다.
   2. oocyte를 입력하고 스페이스 바를 누른 다음 Enter 키를 누릅니다. Signal and Slot이라는 창이 나타납니다. 분석할 잘린 동영상 파일을 선택합니다.
      참고: 여러 동영상을 동시에 선택할 수 있습니다.
3. 응용 프로그램은 동영상과 동일한 폴더에 있는 파일을 반환합니다. .csv, .eps 및 .xls 확장자를 가진 세 개의 다른 파일이 생성됩니다. .xls 파일에는 한 영역에 대한 상관 플롯을 그리기 위한 데이터가 포함되어 있습니다. 셀 내 여러 영역의 평균 상관 관계 값입니다.
4. 시각적 명확성을 위해 1에서 각 시점의 값을 빼서 최종 상관 관계 값을 변환하여 ¹¹과 같이 반전된 지수 곡선을 얻습니다.

5. 이미지 분석: 세포질 벡터 맵

참고: 마우스 난모세포 세포질 벡터 맵은 피지 ³²에서 마우스 난모세포(³¹)의 세포질 흐름을 검출하기 위해 이전에 구현되고 ³³에서 사용할 수 있는 시공간 이미지 상관 분광법(STICS) 플러그인³⁰에 의해 생성되었습니다. 지도는⁹와¹¹에서와 같이 세포질 유속의 크기와 방향을 보여줍니다.

1. 명시야 타임랩스 이미지(Δt=0.5초)를 32비트 형식으로 변환합니다.
2. Plugins > StackReg에서 Fiji StackReg 플러그인으로 이미지를 재정렬하고 강체 변환을 선택합니다.
3. 플러그인 스택에서 이동 평균 jru v2를 빼면 (STICS 플러그인 제품군의 Detrend 도구에서) 영화의 시간 평균 이미지를 빼서 영화의 고정 구조를 제거합니다. Subtract Static Average(정적 평균 빼기 ) 및 Output Sub Stack(출력 하위 스택) 확인란을 선택하고 Maintain Spatial Average(공간 평균 유지 )를 선택한 다음 기간을 5로 설정합니다.
4. 플러그인의 테두리 효과를 피하기 위해 피질을 제외한 난모세포 주위에 ROI를 그립니다.
5. 하위 영역 크기 32픽셀, 단계 크기 16픽셀, STICS 시간 이동 3, X 및 Y 오프셋 0, 속도 승수 8, 크기 임계값 0 및 벡터 길이 정규화, 중심 벡터, 출력 속도 및 동영상 마스크 사용 확인란으로 STICS 맵 jru V2 플러그인(ICS 도구에서)을 실행합니다.
   참고: 플러그인은 .tif 형식의 난모세포 맵을 생성하며, 세포질 흐름을⁹ 및¹¹에서와 같이 흐름 진폭을 나타내는 색상이 있는 벡터로 표시하고 측정된 유속이 있는 엑셀 파일을 표시합니다.

6. 이미지 분석: 핵 개략 변동

참고: 핵막 교반을 반영하는 핵 윤곽 변동은 YFP-Rango로 표지된 핵 동영상에서 확인할 수 있습니다(그림 4A,C). 핵 윤곽 변동에 대한 이미지 분석에는 피지와 플러그인 StackReg(BIG-EPFL 업데이트 사이트²⁹가 StackReg 플러그인에 액세스할 수 있도록 함), PureDenoise³⁴ 및 Ovocyte_nucleus를 설치해야 합니다. StackReg 플러그인은 가능한 전역 동작을 수정하기 위해 이미지 등록을 수행합니다. PureDenoise 플러그인은 혼합 푸아송-가우스 노이즈에 의해 손상된 다차원 이미지의 노이즈를 제거하고 핵 윤곽을 매끄럽게 합니다. Ovocyte_nucleus 플러그인은 신호를 임계값화하고 뉴클레올리스에 해당하는 구멍을 채워 이진 핵 마스크를 생성하고, StackRreg로 재정렬하고, 모든 θ 각도(θ°에서 0°에서 360°까지 1° 증분)에 대해 핵 마스크의 중심에서 마스크 둘레까지의 거리 r을 계산합니다. 그림 4와 같습니다. 이 플러그인의 모든 코드는 ³⁵에서 찾을 수 있습니다.

1. 피지의 경우 Plugins > CIRB > Verlhac 메뉴에서 Ovocyte Nucleus Shape를 선택합니다.
2. 대화 상자에서 다음 항목을 선택합니다.
   1. 분석할 동영상이 들어 있는 폴더를 선택합니다.
   2. θ 각도(1°에서 360° 사이의 값을 선택할 수 있으며 최적의 윤곽선 해상도를 위해 1° 값이 사용됨), 자르기 여백(전체 핵을 유지하려면 5μm 권장)을 선택합니다.
   3. XY 보정 및 시간 간격을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
      참고: 결과는 원본 동영상이 들어 있는 폴더의 출력 폴더에 .xls 파일로 제공됩니다. 이 파일은 각 시간 t와 각 각도 θ에 대해 측정된 모든 반지름 r을 표시합니다. 출력 파일의 예는 보충 표 1에 나와 있습니다. out 폴더에는 핵 마스크의 동영상도 포함되어 있습니다.
3. 스프레드시트를 사용하여 정의된 각 θ 각도에 대한 모든 시간 점 t에 대한 평균 반지름 R을 계산합니다. 이를 통해 시간 경과에 따른 평균 형상을 표시할 수 있습니다(그림 4B). 보충 표 2의 예를 참조하십시오.
4. 각 t와 θ에 대해 반지름 r에서 시간 경과에 따른 평균 반지름 R을 뺍니다. 분산(r-R)² 은 핵 엔벨로프 변동의 측도입니다.
5. 각 핵에 대한 모든 시간 점 t와 모든 각도 θ에 대한 변동의 평균을 계산하고 결국 한 조건의 모든 핵에 대해 계산합니다.
   참고: 파쇄된 세포골격의 경우와 같이 핵의 모양이 현저하게 변경된 경우,¹⁰에서와 같이 핵 윤곽 변동 분석을 진행하기 전에 YFP-Rango로 표지된 핵을 피지에서 회전시켜 매끄러운 부분을 위로 향하게 하고 침습을 아래로 향하게 합니다.

7. 이미지 분석: 핵 스페클 운동(확산 역학)

참고: 핵 스페클 운동 분석을 통해 해당 소기관의 역학 유형(구동, 확산 또는 제한)을 트랙에서 추론할 수 있습니다.

1. 주로 X-Y축에서 이동하는 SRSF2-GFP 액적을 발현하는 난모세포의 스트림 모드 이미지를 선택합니다.
2. 피지에서 히스토그램 매칭 방법을 사용하여 SRSF2-GFP를 발현하는 난모세포의 타임랩스 이미지 표백을 보정합니다(이미지 > Adjust > Bleach Correction).
3. Fiji StackReg 플러그인으로 이미지를 다시 정렬합니다.
4. Fiji Manual Tracking 플러그인(플러그인 > 추적 > Manual Tracking)을 사용하여 SRSF2-GFP 액적 중심을 추적합니다. Add Track(트랙 추가 )을 눌러 추적을 시작하고 완료되면 End Track(트랙 종료 )을 누릅니다. 센터링 교정을 활성화하지 마십시오.
5. 트랙을 스프레드시트 파일에 복사하여 ¹¹에서와 같이 시간 평균 제곱 변위(MSD) 계산을 진행하고 각 20초 액적 궤적에서 시간 MSD를 계산합니다.
6. R 소프트웨어를 사용하여 확산 지수 알파(α)를 추정하기 위해 Nelder-Mead 방법으로 곡선(msd(t) = beta x t^α)을 피팅합니다.
7. 확산이 변칙적일 것으로 예상되므로 서로 다른 조건을 비교할 수 있도록 유효 확산 계수를 측정합니다(α< 1).
8. 시간적 MSD 곡선의 첫 번째 점 40개(20초)에 대한 선형 피팅(알파=1)에서 유효 확산 계수 D_eff 를 계산하고 액적 크기(D_eff (μm)²/s x 3/2 πr(μm))로 정규화합니다.

8. 이미지 분석: 핵 얼룩 표면 동요

참고: 이 세포소기관으로의 활동력 전달을 판독한 시간에 따른 핵 반점 윤곽 진화는 피지에서 사용하기 위해 맞춤형 플러그인 Radioak³⁶ 으로 측정되었으며³⁷에서 사용할 수 있습니다. 플러그인은 선택 중심 주변의 모든 각도에 대해 주어진 선택의 반지름 값을 추출합니다. 시간 경과에 따른 형상 변화는 각 각도에 대한 평균값과 상대적인 반경 값을 비교하여 측정되었습니다. 플러그인을 사용하면 형상 변동을 정량화할 수 있으며 이러한 역학을 시각화할 수 있는 옵션을 제공합니다. 설치하려면 Radioak_.jar 파일을 다운로드하여 피지의 플러그인 폴더에 저장하십시오. 피지를 다시 시작합니다. 이 플러그인은 위의 핵 개요 변동을 분석하고 유사한 파이프라인을 구현하는 데 사용되는 플러그인의 업데이트된 버전입니다.

1. SRSF2-GFP 액적의 스트림 동영상에서 비슷한 크기(반경 ~2.5μm)의 더 큰 액적을 선택합니다.
   알림: 액적이 너무 작으면 분해능이 충분하지 않으면 비정상적인 표면 변동 측정이 발생합니다.
2. 물방울 주위에 사각형을 그려 15초(Δt= 0.5초)에 걸친 물방울의 타임랩스 이미지를 자르고 Image > Crop 을 선택합니다(그림 5).
3. Plugins > StackReg에서 Fiji StackReg 플러그인으로 이미지를 재정렬하고 강체 변환을 선택합니다.
4. 이미지를 매끄럽게 하여 [처리] 아래의 [피지 매끄럽게 하기] 옵션을 사용하여 물방울 주위의 노이즈를 제거합니다.
5. Process > Binary에서 Fiji의 Convert to Mask 옵션을 사용하여 물방울의 이진 마스크를 만듭니다. 기본 방법을 사용하고 배경에는 어둡게 사용합니다(그림 5).
6. 피지의 Analyze(분석)에서 Analyze Particles(입자 분석) 옵션을 사용하여 생성된 바이너리 액적 마스크를 분석하고, Clear Results(결과 지우기) 및 Add to Manager(관리자에 추가) 옵션을 선택하고, Radioak에서 읽을 수 있도록 RoiManager(More > Save)의 관심 영역(ROI)을 zip 형식으로 저장합니다. ROI는 Radioak에서 각 동영상을 찾을 수 있도록 동영상의 동일한 폴더에 있는 contours라는 폴더의 imagename_UnetCortex.zip 파일에 저장해야 합니다.
7. Fiji Plugins > CIRB > Radioak 메뉴에서 Get Radii를 선택하여 하나의 동영상만 처리하거나 Do One Folder를 선택하여 동일한 폴더의 모든 동영상을 분석합니다.
   알림: 각도 번호와 스케일을 선택할 수 있는 창이 나타납니다. Radioak은 0°에서 360°(입력 360)까지 1° 각도 증분으로 발사되었으며 반경 값이 추출되었습니다.
8. 분석할 동영상 또는 동영상이 포함된 폴더를 선택합니다. 결과는 원본 동영상이 들어 있는 폴더의 radioakres 디렉토리에 .xls 파일(각 동영상마다 하나씩)로 제공됩니다. 각 파일은 각 시간 t(슬라이스 단위) 및 각 각도(라디안 단위)에 대해 측정된 모든 반경 r(스케일 매개변수가 채워진 경우 μm)을 표시합니다. 그림 5; 보충 표 3의 .xls 출력 예를 참조하십시오.
9. 스프레드시트에서 정의된 각 각도에 대한 모든 시간 지점 t에 대한 평균 반지름 R을 계산합니다( 보충 표 4의 예 참조). 이를 통해 시간 경과에 따른 평균 형상을 그릴 수 있습니다.
10. 액적 표면 변동 측정값에 해당하는 분산(r-R)² (단위:^μm2 )를 플로팅합니다.

결과

도 3의 이미지 패널은 전형적인 완전히 성장한 난모세포(그림 3A), YFP-Rango를 발현하는 완전히 성장한 난모세포의 핵질(그림 3B), 올바르게 발현하는 완전히 성장한 난모세포의 핵질(왼쪽 패널; 그림 3C) 또는 과도한(오른쪽 패널; 그림 3C) SRSF2-GFP cRNA의 투여량과 SC35 항체를 사용하여 완전히 성장한 난모세포에서 핵 반점의 면역염색(그림 3D). 마이크로주입에 대한 SRSF2-GFP cRNA의 정확한 투여량은 SRSF2-GFP의 발현 프로파일과 핵 반점의 내인성 프로파일 간의 시각적 비교를 기반으로 정의되었습니다.

STICS 벡터 맵과 이미지 상관 분석(⁹ 및¹¹ 참조)을 사용한 실험실의 이전 연구에서 알 수 있듯이 난모세포의 세포질 교반력은 유전적(예: FMN2 돌연변이 마우스) 및 화학적(예: Cytochalasin D) 세포골격 섭동에 의해 감소할 수 있습니다. 대조군 난모세포의 STICS 맵은 높은 유속을 나타내는 색상과 함께 수많은 벡터를 표시하는 반면, 세포골격력이 파괴된 난모세포 맵은 낮은 유속을 나타내는 색상으로 더 적은 벡터를 표시합니다. 마찬가지로, 이미지 상관관계는 세포골격 힘이 파괴된 난모세포에 비해 대조군 난모세포에서 매우 빠르게 손실됩니다. 이는 상관 곡선에서 관찰할 수 있으며, 세포골격력이 파괴된 난모세포에 비해 대조군 난모세포에 대한 곡선이 더 빨리 감소하거나⁹ 곡선이 반전될 때 더 빠르게 증가한다¹¹.

세포골격은 핵과 내부 소기관, 특히 핵 반점^10,11과 같은 핵 응축물을 동요시킵니다. 그림 4A에서 대조군 난모세포의 핵은 중요한 말초 변동을 받으며, 이는 핵 프로브 YFP-Rango를 사용하여 볼 수 있습니다. 세포골격력이 파괴된 난모세포의 핵 모양은 시간이 지남에 따라 안정적입니다(그림 4C). 핵 윤곽 변동 분석은 교반을 정확하게 정량화하는 데 중요합니다. 핵 중심에서 주변부까지의 거리 분산(r-R)²(그림 4B)을 측정하여 변동을 정량화할 수 있으며, 핵 교반은 세포골격력이 파괴된 난모세포보다 대조군 난모세포에서 6배 더 높다는 것을 보여줍니다¹⁰. 그림 5A-B에서 핵 스페클(SRSF2-GFP⁺ 액적)은 높은 시간 분해능에서 세포질 힘의 제어 및 교란 컨텍스트에 표시됩니다. 대조군에서 액적 표면은 세포질력이 파괴된 난모세포의 액적 표면보다 훨씬 더 많이 변동하며, 이는 Radioak³² 플러그인을 사용하여 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 시각적으로 녹색과 빨간색(그림 5A-B의 하단 이미지에서 볼 수 있는 Radioak 출력)은 플러그인이 연속된 이미지 사이의 표면 변화를 감지한 각도를 나타내고 흰색은 표면 변화가 없음을 나타냅니다.

그림 1: 후기 생쥐 난자형성과 초기 배아형성의 그림. 난모세포 성장 후반에 발생하는 핵 센터링, 난모세포 분열 중에 발생하는 염색체 오프 센터링, 배아 발생의 초기 단계(1세포 및 2세포 단계)의 그림. 여성 게놈(난모세포핵과 암컷 전핵)은 분홍색, 남성 전핵은 파란색입니다. 배아 핵(부모 게놈의 융합 후)은 보라색입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 성장하는 쥐 난모세포의 규모에 따른 세포질 및 핵 리모델링의 그림. 이 그림은 ^9,10,11의 주요 결과를 요약한 것입니다. 시공간 규모에 걸친 세포질의 악토미오신 기반 리모델링, 핵 교반 및 기능적 핵 생체 분자 응축물 리모델링의 그림. 핵 반점의 스케일 크로싱 리모델링은 그 기능과 관련된 생체 분자 반응(즉, pre-mRNA의 스플라이싱)을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 모든 이미징이 이미지 프레임 간에 0.5초의 동일한 시간적 해상도로 수행되기 때문에 공간 규모에 대해서만 핵 교반을 평가할 수 있지만 시간적 규모는 평가할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 완전히 성장한 난모세포와 핵형질의 샘플 이미지. (A) 핵소체를 둘러싸고 있는 염색질(청록색)을 보여주는 완전히 성장한 난모세포의 명시야 이미지. 점선으로 된 흰색 원이 핵의 윤곽을 그립니다. (B) YFP-Rango를 발현하는 살아있는 난모세포핵; 핵소체에 형광이 없다는 점에 유의하십시오. (C) 정확한 용량의 cRNA(왼쪽 패널) 또는 고용량의 cRNA(오른쪽 패널)를 미세주입한 후 SRSF2-GFP를 발현하는 살아있는 난모세포핵의 예; 왼쪽에는 응축(물방울) 및 용해된 단계가 있고 오른쪽에는 조건이 없습니다. (D) 고정된 난모세포에서 핵 스페클 면역염색; C (왼쪽 패널)에 있는 것과 비교할 수 있는 내생 표현 프로파일에 주목하십시오. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 제어 및 교란된 핵 윤곽 변동의 플러그인 출력. (A) YFP-Rango(위)를 발현하는 대조군 난모세포핵과 Ovocyte_nucleus 플러그인에 의해 생성된 해당 이진 마스크(아래)의 타임랩스. (B) 핵 외곽선 변동의 원리 시간 경과에 따른 및 주어진 방향으로의 측정. 방향은 0°에서 360°까지 1°씩 증가하는 회전 각도 θ로 정의됩니다. t=0초(노란색) 및 t=135초(보라색)에 있는 두 개의 대표적인 모양이 표시됩니다. 파란색 모양은 시간 경과에 따른 평균 모양에 해당합니다. (C) F-액틴(FMN2 돌연변이 마우스)과 미세소관(노코다졸 처리,¹⁰에서와 같이)의 파괴로 인해 세포골격력이 감소한 난모세포에서 핵의 핵 윤곽 변동. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 제어 및 중단된 액적 표면 변동의 플러그인 출력. (A) 프레임당 500ms로 이미징되고 LUT(Ice Look Up Table)에 표시된 대조군 SRSF2-GFP 핵 방울의 크롭(상단); 피지(Fiji)에 의해 생성된 동일한 물방울의 바이너리 마스크(중앙); 및 Radioak 플러그인은 액적(하단)의 표면 변동을 분석한 후 출력하며, 녹색과 빨간색은 플러그인이 연속된 이미지 사이의 표면 변화를 감지한 각도를 나타내고 흰색은 표면 변화가 없음을 나타냅니다. (B) F-액틴과 미세소관의 파괴로 인해 세포골격력이 감소한 난모세포에서 핵 방울의 표면 변동(¹¹에서와 같이). 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: Ovocyte_nucleus 플러그인 분석 출력의 예. 그림 4A에 표시된 것과 동일한 핵이 분석되었습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 반지름은 μm 단위입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 핵 윤곽 변동을 계산하는 데 사용되는 샘플 스프레드시트. 그림 4A에 표시된 것과 동일한 핵이 분석되었습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 탭 원시 및 평균: 반지름은 μm 단위입니다. 탭 r-R: r-R 거리는 μm 단위입니다. 표 (r-R)²: 변동 값은^μm2 단위입니다. 탭 x와 y는 원시 및 평균 탭의 반지름에 대한 데카르트 좌표에 해당합니다. 그들은 평균 모양 탭에서 시간 경과에 따른 핵의 평균 모양을 그릴 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: Radioak 플러그인 분석 출력의 예. 그림 5A에 표시된 것과 동일한 액적을 분석했습니다. 뚜렷한 시점과 각도에서 측정된 반경이 표시됩니다. 반지름은 μm 단위입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 4: 핵방울 표면 변동을 계산하는 데 사용되는 샘플 스프레드시트. 그림 5A에 표시된 것과 동일한 액적을 분석했습니다. 세타(θ)는 각도(도)이고 t1에서 t600은 프레임 번호에 해당하며 시간으로 변환할 수 있습니다. 탭 원시 및 평균: 반지름은 μm 단위입니다. 탭 r-R: r-R 거리는 μm 단위입니다. 표 (r-R)²: 변동 값은^μm2 단위입니다. 탭 x와 y는 원시 및 평균 탭의 반지름에 대한 데카르트 좌표에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜의 주요 단계에는 생존 또는 정상 기능에 영향을 미치지 않는 난모세포의 적절한 미세주입(^9,10,11)과 핵 반점과 같은 관련 구조의 정확한 시각화를 가능하게 하는 사전 정의된 양의 cRNA를 미세주입하는 것이 포함됩니다.

세포질과 (내)핵 역학 사이의 연관성을 확립하는 것은 세포골격이 핵 또는 그 내부를 어떻게 교반시키는지 연구할 때 필수적입니다. 이 프로토콜은 약간의 수정을 통해 세포질 교반 강도를 핵 YFP-Rango 또는 SRSF2-GFP 액적 역학과 연관시킴으로써 이를 허용합니다(¹¹에서와 같이). 계속 진행하려면 먼저 명시야 모드에서 120초 동안 난모세포를 촬영하여 세포질 교반을 캡처한 다음, 491nm 레이저로 즉시 120초 동안 촬영하여 핵 윤곽 또는 액적 역학을 캡처해야 합니다. 핵 SRSF2-GFP 액적의 경우, 유효 확산 계수(이 프로토콜의 7단계 참조)를 이미지 상관 분석(이 프로토콜의 4단계 참조)을 사용하여 얻은 세포질 교반의 반전된 최대 강도 값과 비교하여 상관관계를 간단히 평가할 수 있습니다. 또 다른 중요한 점은 액적 표면 변동 분석을 위해 선택한 응축수의 크기입니다. 크기가 표면 변동의 강도를 조절하므로 편향을 방지하기 위해 비교 분석을 위해 유사한 직경의 액적을 선택해야 합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 핵 외곽선 변동 분석은 YFP-Rango 또는 NLS-GFP와 같은 전체 핵 내 염색에 의존합니다. 핵 스페클에 대한 분석의 경우, 과도한 양의 SRSF2-GFP cRNA를 미세주입하면 이전에 다른 사람들이 검토한 바와 같이 이 응축수 마커의 상 분리 특성(그림 3C)에 명백한 변화가 발생할 수 있습니다²⁶. 따라서 외인성 단백질 발현 프로파일이 내인성 단백질 발현 프로파일과 유사한지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 상대적으로 작은 액적(반경 <2μm)은 여기에 정의된 도구를 사용한 공간 분해능의 한계로 인해 표면 변동 분석 파이프라인에서 제외해야 합니다. 이 해상도 문제는 일반적으로 더 해상도가 높은 현미경을 사용하여 해결할 수 있으며, 예를 들어 난모세포핵 또는 체세포의 상당히 작은 핵에서 더 작은 응축수의 표면 변동을 조사하는 데 필요할 수 있습니다.

전반적으로, 이 프로토콜은 스케일에 걸쳐 마우스 난모세포 핵의 액틴 및 미세소관 세포골격 기반 교반을 포착할 수 있습니다. 특히, 세포질의 세포골격 기반 동원, 핵 윤곽 변동, 액체와 같은 핵 반점 변위 및 표면 변동을 문서화할 수 있습니다. 다른 세포 유형에 대한 일부 연구는 개별 공간 규모에서 다양한 복잡성의 별개의 프로토콜을 통해 이러한 문제 중 일부를 다루지만(38,39,40), 이 간단한 프로토콜은 단일 작업 파이프라인에서 여러 규모에 걸쳐 언급된 세포 역학을 처리하는 데 필요한 도구를 처음으로 제공합니다. 더욱이, 이러한 접근법으로부터 생성된 데이터는,^10,11에서와 같이 생물물리학적 모델링으로 보완될 때, 다음의 최소 침습적 평가를 가능하게 한다: i) 핵역학의 변화¹⁰; ii) 세포질 내의 세포골격 기반 활동력이 핵(¹¹)의 응축물로 전달되는 것; iii) 서로 다른 세포 구획에 걸친 이 활성 에너지의 소산^10,11. 중요한 것은, 이 프로토콜은 뉴클레소체(^nucleolus)23와 같은 다른 핵 응축물뿐만 아니라 세포골격계 및 핵 응축물 거동 모두의 변화가 문서화된 암세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있기 때문에 다재다능하다는 것이다^17,41.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마	A3311
CSU-X1-M1 회전 디스크	요코가와
DMI6000B 현미경	Leica
Femtojet 마이크로인젝터	Eppendorf
Fiji
필터 휠	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph 소프트웨어	유니버설 이미징,		버전 7.7.9.0
미네랄 오일	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 및 C57BL/6 마우스	Charles River Laboratories
Poly(A) 테일링 키트	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD 카메라	QImaging
RNAeasy 키트	Qiagen	74104
SC35 항체	Abcam	ab11826	핵 반점 항체; 마우스 IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP 플라스미드;	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
스트리퍼 마이크로피펫	XLAB 난	자 수집에 특화된
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
온도 조절 챔버	생명 이미징 서비스
Windows Excel	Windows