방법 논문

Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex의 Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex(생쥐 해마와 전전두엽 피질의 이중 세포외 기록)

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DOI:

10.3791/66003

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2024년 2월 16일

 ,  ,  , 
1Neural Dynamics Laboratory, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 국소 자기장 전위를 기록하고 쥐 해마와 전전두엽 피질의 정보 흐름을 조사하기 위해 맞춤형으로 설계된 기록 장치와 전극의 사용을 간략하게 설명합니다.

초록

국소 전위(LFP)를 기록하는 기술은 국소화된 신경 세포 집단의 전기적 활동을 측정하는 데 사용되는 전기생리학적 방법입니다. 이는 인지 연구, 특히 해마와 전전두엽 피질과 같은 뇌 영역에서 중요한 도구 역할을 합니다. 이러한 영역 간의 이중 LFP 기록은 지역 간 신호 통신을 탐색할 수 있게 해주기 때문에 특히 흥미롭습니다. 그러나, 이러한 녹음을 수행하는 방법은 거의 설명되지 않으며, 대부분의 상용 기록 장치는 비싸거나 특정 실험 설계를 수용하기에 적응성이 부족합니다. 이 연구는 항정신병 약물 및 칼륨 채널 조절제가 이러한 영역의 LFP 특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스 해마와 전전두엽 피질에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 각 뇌 영역 내의 전력 스펙트럼 및 둘 사이의 일관성을 포함한 LFP 특성을 측정할 수 있습니다. 또한 이러한 실험을 위해 저비용의 맞춤형 녹음 장치가 개발되었습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 서로 다른 뇌 영역에서 높은 신호 대 잡음비로 신호를 기록하는 수단을 제공하여 뇌 내 지역 간 정보 통신의 조사를 용이하게 합니다.

서론

국소자기전위(LFP)는 세포외 공간에서 기록된 전기적 활동을 말하며, 국소적인 뉴런 그룹의 집합적 활동을 반영합니다. 1Hz의 느린 파동에서 100Hz 또는 200Hz의 빠른 진동에 이르기까지 다양한 범위의 주파수를 나타냅니다. 특정 주파수 대역은 학습, 기억 및 의사 결정과 같은 인지 기능과 관련이 있습니다 1,2. LFP 특성의 변화는 치매 및 정신 분열증을 포함한 다양한 신경 장애의 바이오마커로 사용되었습니다 3,4. LFP 기록을 분석하면 이러한 상태 및 잠재적인 치료 전략과 관련된 근본적인 병리학적 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이중 LFP 기록은 두 개의 특정 뇌 영역 내부 및 두 영역 사이의 국부적인 전기 활동을 측정하는 데 사용되는 기술입니다. 이 기술은 서로 다른 뇌 영역 내에서 그리고 서로 다른 뇌 영역 사이에서 발생하는 복잡한 신경 역학 및 신호 통신을 조사할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 이전 연구에 따르면 개별 뇌 영역의 신경 세포 특성의 변화를 감지하는 것은 복잡할 수 있지만 지역 간 대뇌 피질 통신의 변화는 관찰할 수 있습니다 5,6. 따라서 듀얼 LFP 녹음을 사용하면 이 문제를 해결할 수 있는 강력한 수단을 제공할 수 있습니다.

해마-전전두엽 연결성은 인지 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 기능 장애는 다양한 신경 장애와 관련이 있습니다 7,8. 이러한 영역의 이중 전극 기록은 이러한 상호 작용에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 영역 사이에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하는 방법에 대해 사용할 수 있는 정보는 제한적입니다. 더욱이, 상업적으로 이용 가능한 기록 장치는 일반적으로 비싸고 특정 실험 설계에 대한 적응성이 부족합니다. LFP를 기록하는 기존의 방법은 차폐 케이블을 사용하여 기록 장치를 동물의 뇌에 이식된 전극에 연결하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 모션 아티팩트 및 환경 노이즈에 취약하여 기록된 신호의 품질과 신뢰성에 영향을 미칩니다.

이 프로토콜은 동물의 머리에 배치할 수 있는 저비용 맞춤형 설계 헤드스테이지를 사용하여 쥐 해마와 전전두엽 피질에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하는 포괄적인 절차를 설명합니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 두 개의 분리된 대뇌 영역 내에서 영역별 진동 패턴을 조사하고 이러한 영역 간의 지역 간 정보 교환 및 연결성을 탐구할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 과학적 목적을 위한 동물 관리 및 사용에 대한 호주 규정에 따라 Florey Animal Ethics Committee(The University of Melbourne, No. 22-025UM)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 호주 동물자원센터(Animal Resources Centre)에서 얻은 C57BL/6마리의 수컷 마우스(8주)가 사용되었다.

1. 헤드스테이지 설계 및 제작

알림: 헤드스테이지 PCB 보드는 동물의 머리에 직접 배치하도록 설계된 소형 14mm x 12mm 4층 보드입니다. 상용 증폭기 칩( 재료 표 참조)을 사용하며 모든 디자인 및 Gerber 파일은 온라인에서 사용할 수 있습니다(GitHub 링크: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

  1. 제조업체에 다음 사양을 제공하십시오. 보드 두께: 0.6mm; 최소 트래킹/간격: 4mils; 최소 구멍 크기: 0.2mm.
  2. PCB 조립 과정에서 다음 순서를 따르십시오.
    1. 350°C로 설정된 열풍총을 사용하여 증폭기 칩을 보드에 납땜합니다.
    2. 수동 구성 요소를 납땜합니다.
    3. SPI 커넥터와 전극 커넥터를 납땜합니다( 재료 표 참조).
  3. 품질 보증을 위해 현미경으로 납땜을 검사하십시오. 안정성을 높이기 위해 에폭시를 사용하여 SPI 커넥터를 제자리에 고정합니다.
  4. 신호 수집을 위해 타사 녹음 소프트웨어와 제어 보드( 재료 표 참조)를 사용하십시오. 자세한 지침은 소프트웨어 사용 설명서를 참조하십시오.
  5. 설계된 헤드스테이지는 8개의 채널을 지원합니다. 소프트웨어에서 채널 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 및 23을 녹음할 수 있도록 활성화합니다.

2. 전극 제작

  1. PFA 코팅 텅스텐 와이어( 재료 표 참조)를 전두엽 피질 전극(12mm), 해마 전극(10mm) 및 접지 전극(6mm)과 같은 다양한 전극 유형에 대해 특정 길이로 자릅니다.
  2. 황동 튜브( 재료 표 참조)를 3mm 세그먼트로 자릅니다.
  3. 라이터를 사용하여 각 와이어 끝의 코팅 2mm를 제거한 다음 전극 와이어를 황동 튜브에 단단히 납땜합니다. 황동 튜브의 내경은 0.45mm이고 외경은 0.60mm입니다.
  4. 접지 전극의 경우 M1.2 스테인리스강 나사( 재료 표 참조)를 전극에 납땜합니다. 인산 기반 플럭스를 나사에 적용하여 납땜을 향상시킵니다. 납땜 후 알코올을 사용하여 나사를 청소하십시오.
    알림: 납땜 과정에서 보호를 위해 장갑을 착용하십시오.

3. 수술 절차

  1. 3% 이소플루란과 1L/min 산소 흐름이 있는 마취실에서 마우스를 마취합니다.
  2. 마취된 마우스를 가열 패드에 놓고 입체 프레임에 고정합니다( 재료 표 참조).
  3. 이소플루란의 유지율을 2.5-3%로 조정하고 산소 흐름을 500mL/분으로 줄입니다. 발가락 핀치를 사용하여 동물이 여전히 깊은 마취 상태인지 확인합니다.
  4. 카프로펜 0.5mg/kg을 피하주사하고 눈 보호를 위해 눈 연고를 바릅니다.
  5. 포비돈 요오드와 80% 에탄올을 사용하여 쥐의 머리를 면도하고 살균합니다.
  6. 두피 정중선을 따라 8mm 절개하여 절개 부위의 결합 조직을 제거합니다.
  7. 과산화수소를 바르고 두개골 표면을 청소하고 주변 피부를 만지지 않도록 주의합니다.
  8. 정확한 전극 배치를 위해 브레그마와 람다 랜드마크를 동일한 높이에 맞춥니다(브레그마와 람다는 시상 봉합사가 관상 봉합사와 람돔 봉합사와 교차하는 위치입니다).
  9. 지정된 좌표에서 기준/접지 전극, 앵커 나사(0.9mm 드릴 버) 및 활성 전극(0.3mm 드릴 버)용 구멍을 뚫습니다.
  10. 맞춤형 전극(2단계)을 입체 프레임 암에 부착하고 뇌와 수직이 되도록 합니다.
  11. 해마 CA1 영역(AP - 1.8mm, ML - 1.3mm, DV - 1.4mm)에 전극을 이식합니다.
    참고: AP, 전후; ML, 내측; DV, 배쪽.
  12. 전전두엽 피질(AP - 2.0mm, ML - 0.3mm, DV - 1.7mm)에 전극 이식을 반복합니다.
  13. 시중에서 판매되는 강력한 접착제와 치과용 시멘트로 전극을 고정합니다( 재료 표 참조).
  14. 움직임을 방지하기 위해 두 개의 1.2mm 고정 나사(AP - 1.8mm, ML -1.6mm)를 이식합니다.
  15. 기준/접지 전극을 경막과 직접 접촉하도록 배치하고, 람다 랜드마크에 대해 2mm 후방 및 2mm 일방적으로 배치합니다.
  16. 전극의 황동 튜브 쪽을 접지 전극이 중앙에 있는 다중 채널 소켓 커넥터( 재료 표 참조)에 연결합니다.
  17. 절연을 위해 중간 핀 외부에 0.8mm 열수축 튜브를 사용합니다.
  18. 전극, 앵커 나사 및 커넥터를 접착제와 치과용 시멘트로 고정합니다.

4. 수술 후 관리

  1. 수술 후 통증을 완화하기 위해, 3일 동안의 통증 평가에 근거하여 12-24시간마다 5-10 mg/kg의 용량으로 카프로펜을 피하 주사하십시오.
  2. 기록 또는 실험 절차를 시작하기 전에 동물에게 1주일의 회복 기간을 제공하십시오.

5. 녹음 절차

  1. 3일 연속으로 하루에 두 번, 15분 동안 동물을 다루십시오.
  2. 과도한 압력을 가하지 않고 쥐 주위의 손을 부드럽게 닫아 쥐를 들어 올립니다.
  3. 3일 연속 하루에 한 번 30분 동안 동물의 머리에 헤드스테이지 보드를 놓습니다.
  4. 녹음 당일에는 동물을 30분 동안 녹음실에 적응시킵니다.
  5. 외부 전기 간섭을 줄이기 위해 동물을 패러데이 케이지 내의 작은 녹음 챔버에 놓습니다. 녹음을 위해 사용자 지정 헤드스테이지를 부착합니다.
  6. 녹음 소프트웨어를 열고 2.00kHz 샘플링 속도를 선택합니다. 각 채널을 선택하고 스페이스 바를 눌러 13과 20을 제외한 모든 채널을 비활성화합니다.
  7. 하드웨어 대역폭 창에서 낮은 대역폭을 2Hz로 설정하고 상위 대역폭을 100Hz로 설정합니다.
  8. 소프트웨어 필터링 창에서 저역 통과 필터를 100Hz로, 고역 통과 필터를 2Hz로 조정합니다.
  9. Select File Name(파일 이름 선택)을 클릭하여 저장 경로를 선택한 다음 Record(기록)를 클릭합니다.
  10. 10분의 습관화 기간으로 각 녹음 세션을 시작한 다음 15분의 기본 EEG 기록으로 시작합니다.
  11. 기준선 기록 후 복강 내 주사를 통해 약물을 투여하고 지체 없이 추가로 30분 동안 녹음을 계속합니다.
    참고: 사용된 약물에 대한 자세한 내용은 결과 섹션을 참조하십시오.

결과

여기에 표시된 결과는 C57BL/6 수컷 마우스의 4개 코호트(각 코호트에 대해 n = 8, 연령: 8주, 체중: 24.0 ± 0.42g)에서 테스트한 국소 자기장 전위(LFP) 특성에 대한 여러 약물의 효과를 보여줍니다. 검사된 약물에는 항정신병 약물인 클로자핀, 칼륨 채널 조절제인 4-아미노피리딘(4-AP), 레티가빈, 대조군 생리식염수가 포함되었습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 마우스를 작은 기록 챔버에 넣고 맞춤형으로 설계된 헤드스테이지를 사용하여 해마(HIP)와 전전두엽 피질(PFC)에서 LFP를 수집했습니다. 이 연구는 주로 세타 및 감마 주파수 대역 검사에 중점을 두었기 때문에 기록된 신호는 먼저 2-100Hz의 주파수 범위 내에서 초기 대역 통과 필터링을 거친 다음 2000Hz에서 샘플링을 거쳤습니다. 그런 다음 신호는 여러 개의 2s epoch로 분할되었습니다. 뚜렷한 모션 아티팩트를 표시하는 모든 epoch가 식별되고 후속 분석 프로세스에서 제외되었습니다. HIP 및 PFC 모두에서 LFP의 전력 스펙트럼과 HIP-PFC 일관성은 다중 테이퍼 기반 분석 방법9을 사용하여 측정되었습니다. 이 분석은 5개의 슬레피안 테이퍼를 사용했으며, 최적의 스펙트럼 농도를 얻기 위해 시간 대역폭을 3으로 설정했습니다. 1초의 슬라이딩 윈도우와 100ms의 스텝 크기를 사용하여 시간-주파수 스펙트로그램과 HIP-PFC 일관성의 시간 경과를 생성했습니다.

그림 2 및 그림 3에서 볼 수 있듯이 식염수 투여는 HIP 및 PFC에서 LFP의 전력 스펙트럼 또는 HIP-PFC 일관성에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았습니다. 레티가빈(retigabine)과 클로자핀(clozapine) 모두 HIP 및 PFC에서 감마대역(30-100Hz) 전력과 감마대역 HIP-PFC 일관성에서 뚜렷한 감소를 보여주었습니다. 대조적으로, 4-AP는 HIP와 PFC 사이의 감마 대역 내 일관성이 증가와 함께 HIP 및 PFC에서 향상된 감마 대역 전력을 특징으로 하는 반대 효과를 나타냈습니다.

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그림 1: 실험 설정 개략도. 국소자기장 전위를 기록하기 위해 해마(HIP)와 전전두엽 피질(PFC)에 전극을 이식했습니다. 동물을 작은 녹음실에 넣고 맞춤 설계된 헤드스테이지를 전극 커넥터에 부착했습니다. 각 녹음 세션은 10분 기준선 세션으로 시작되었으며 30분 약물 세션이 이어졌습니다. 식염수, 클로자핀, 4-AP 및 레티가빈의 효과를 테스트했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 항정신병 약물과 칼륨 채널 조절제가 해마(HIP) 및 전전두엽 피질(PFC)의 지속적인 전기생리학적 활동에 미치는 영향. HIP-PFC 일관성과 함께 HIP 및 PFC의 국소 자기장 전위의 정규화된 스펙트로그램은 연구된 모든 약물에 대해 시간 의존적 효과를 나타냈습니다. 약물은 시간 t = 15 분에 복강 내 주사를 통해 투여되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 항정신병 약물과 칼륨 채널 조절제가 HIP 및 PFC의 전력 스펙트럼 밀도에 미치는 영향. 4-AP는 두 뇌 영역에서 감마대역 파워를 유의하게 향상시켰고, 클로자핀과 레티가빈은 두 영역 모두에서 감마밴드 파워를 억제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 프로토콜은 해마(HIP)와 전전두엽 피질(PFC)에서 이중 국소자기전위(LFP)를 동시에 기록하기 위해 특별히 설계된 맞춤형 헤드스테이지를 구성하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에 제공된 자세한 단계는 연구원이 각 영역 내 및 HIP와 PFC 간의 신호 통신을 철저히 조사할 수 있는 충분한 정보를 제공합니다.

맞춤형으로 설계된 헤드스테이지는 상업용 앰프 칩을 사용합니다. 현재 구성은 8개 채널의 녹음을 지원하지만 헤드스테이지는 전체 32채널 용량을 수용하도록 쉽게 조정할 수 있으므로 전극 어레이 녹음에 적합한 확장된 채널 용량에 대한 잠재력을 제공할 수 있습니다. 헤드 스테이지의 저렴한 비용을 고려할 때 한 가지 옵션은 보드를 동물의 머리에 영구적으로 부착하는 것입니다. 이 접근 방식은 모션 아티팩트를 최소화하고 움직임으로 인한 전반적인 방해 수준을 줄이는 이점을 제공합니다.

맞춤형 전극은 LFP의 안정적인 장기 기록을 보여주며 3-5개월 동안 우수한 신호 품질을 유지합니다. 또 다른 실행 가능한 접근법은 폴리이미드 기반 연성 회로 기판을 전극 어레이(10,11)로 사용하는 것입니다. 이 연성 회로 기판은 녹음 헤드스테이지와 통합되어 다중 채널 녹음을 가능하게 할 수 있습니다. 이 방법은 전극 준비 및 수술 절차를 단순화하는 이점을 제공합니다. 헤드스테이지가 있는 임플란트와 없는 임플란트의 무게는 각각 0.198g과 0.812g으로 매우 가볍기 때문에 아주 어린 마우스에 적합합니다.

전류 기록 기술의 한 가지 한계는 실험 중 동물의 자연스러운 행동을 방해할 수 있는 교수형 케이블로 인한 잠재적인 간섭입니다. 이 문제를 해결하기 위해 데이터 저장을 위해 SD 카드를 사용하거나 무선 신호 송신기 모듈을 구현하는 것과 같은 대체 솔루션을 고려할 수 있습니다.

프로토콜의 필수적이고 중요한 단계는 전극의 정확한 배치와 관련이 있습니다. 실험 간에 비교를 가능하게 하기 위해 정확하고 일관된 전극 배치를 보장하는 것이 중요합니다. 전극 위치를 확인하려면 조직학을 수행해야 합니다12. HPC에서 적절한 전극 위치 지정을 향상시키는 유용한 기술은 전극이 수직으로 삽입되는 동안 기록하는 것인데, 이는 강한 세타 리듬과 뉴런 발화가 올바른 배치를 나타내기 때문입니다. 생쥐가 나이가 들면서 신호 품질이 떨어지거나 잘못된 배치가 발생할 수 있으므로 8주 이상의 성체 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 고려 사항을 고려하면 실험 결과의 신뢰성과 타당성을 유지하는 데 도움이 됩니다.

결론적으로, 이 논문에 제시된 프로토콜은 서로 다른 뇌 영역 간의 신호 통신을 연구하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 이를 통해 연구자들은 이러한 영역 내부 및 지역 간의 뉴런 역학 및 상호 작용을 탐구할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation(A2087)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
황동 튜브 Albion Alloys, 미국내경 0.45 mm
Carprofen Rimadyl, 화이자 동물 건강 
상업용 증폭기 칩IntantechRHD 2132
제어 보드IntantechRHD 기록 시스템
치과 시멘트 Paladur
Heat 수축Panduit0.8 mm 직경
M1.2 스테인레스 스틸 나사시계 도구시계 및 시계 나사
다채널 소켓 커넥터 Harwin, AU1.27mm 피치, PCB 소켓
PFA 코팅 텅스텐 와이어 AM 시스템, 미국150 &MICRO의 내경; 엠 
인산 기반 플럭스칩 퀵CQ4LF-0.5
녹음 소프트웨어IntantechRHX 녹음 소프트웨어
입체 프레임세계 정밀 기기마우스 입체 기기
슈퍼 접착제UHU초고속

참고문헌

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