방법 논문

스코폴라민에 의해 유도된 눈물샘 기능 장애가 있는 쥐 안구건조증 모델

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DOI:

10.3791/66036

⸱

2024년 2월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Eye Hospital, Jinan University, 2Shenzhen Eye Institute, 3Shenzhen Research Institute, Wuhan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 눈물샘 기능 장애의 쥐 모델을 확립하여 수성 결핍성 안구건조증 연구의 기초를 제공합니다.

초록

수성 결핍성 안구건조증(ADDE)은 눈물 분비량과 질이 감소할 수 있는 안구건조증의 일종입니다. 비정상적인 눈물 생성이 장기화되면 각막 손상 및 염증을 포함한 안구 표면 환경의 교란을 유발할 수 있습니다. 심한 경우 ADDE는 시력 상실 또는 실명을 유발할 수 있습니다. 현재 안구건조증 치료는 안약이나 물리치료에 국한되어 있어 안구건조증을 근본적으로 치료할 수는 없을 뿐 안안약의 증상을 완화할 수는 없습니다. 안구건조증에서 눈물샘의 기능을 회복시키기 위해, 우리는 스코폴라민에 의해 유도된 쥐의 눈물샘 기능 장애에 대한 동물 모델을 만들었습니다. 눈물샘, 각막, 결막 및 기타 요인에 대한 포괄적인 평가를 통해 ADDE의 병리학적 변화에 대한 완전한 이해를 제공하는 것을 목표로 합니다. 현재의 안구건조증 마우스 모델과 비교했을 때, 이 ADDE 동물 모델에는 눈물샘의 기능적 평가가 포함되어 있어 ADDE의 눈물샘 기능 장애를 연구하기 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

서론

2021년까지 약 12%의사람들이 안구건조증을 심각하게 앓고 있으며1 이는 가장 흔한 만성 안과 질환 중 하나입니다. 안구건조증은 수성 결핍성 안구건조증(ADDE)과 증발성 안구건조증(EDE)2의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. ADDE는 쇼그렌 증후군(Sjögren's syndrome, SS)과 비SS(non-SS)로 나뉘는데, 대부분의 안구건조증 환자는 임상3에서 비SS 환자이다. 만성 안구건조증 증상은 환자의 시력에 심각한 영향을 미칩니다. 현재 기존의 안구 건조증 치료법은 인공 눈물을 사용하여 안구 표면을 윤활하고 눈꺼풀의 물리 치료를 포함합니다. 그러나 안구건조증은 많은 경우 완전한 치료법이 되지 않을 수 있습니다. 따라서 안구건조증의 발병기전을 연구하는 것은 새로운 치료법과 약물 개발에 매우 중요합니다. 안구건조증의 동물 모델은 추가 연구의 기초를 제공합니다.

안구건조증4의 동물 모델을 만드는 방법에는 호르몬 수치를 변화시켜 눈물 분비 수치를 변화시키는 여러 가지 방법이 있다. 예를 들어, 쥐의 고환을 제거하면 안드로겐 분비를 감소시키고 눈물 분비를 증가시키며 눈물 5,6에서 유리 분비 성분 (SC) 및 IgA의 농도를 감소시킬 수 있습니다. 또 다른 방법은 눈물샘을 조절하는 눈 표면 신경을 제거하여 눈물샘의 자가면역 반응을 나타내는 것입니다. 또한, 눈물샘을 외과적으로 제거함으로써 눈물 분비를 직접 감소시킬 수 있다7. 환경 조건의 변화도 눈물 증발을 가속화할 수 있습니다. 예를 들어, 습도가 낮고 환기가 잘 되지 않는 환경에서 동물을 배양하면 과도한 증발성 안구건조증 모델8을 만들 수 있으며, 이는 안구건조증의 중증도를 증가시키기 위해 다른 방법과 결합될 수 있다. 안구건조증 유발에 사용되는 주요 약물은 아트로핀(atropine)과 스코폴라민(scopolamine)이다9. 부교감신경 억제제로서 둘 다 눈물샘에서 콜린성(무스카린) 수용체의 약리학적 봉쇄를 유도하고 눈물 분비를 억제할 수 있습니다. 아트로핀 근육 주사로 인한 안구 건조증에 비해10 스코폴라민은 분비선에 대한 억제 효과가 강하고 약물 작용 지속 시간이 길며 심장, 소장 및 기관지 평활근에 대한 효과가 약합니다. 안구건조증 동물 모델을 위한 가장 성숙한 약물 중 하나입니다.

스코폴라민으로 안구건조증을 유도하기 위해 피하주사, 약물 펌프 또는 패치 도포와 같은 다양한 방법을 사용할 수 있다 4,11,12. 실험 동물에 대한 약물 투여 빈도를 줄이기 위해 많은 연구자들은 쥐의 꼬리에 경피 패치를 적용하거나 약물 펌프를 사용합니다. 그러나 이 두 가지 방법 모두 한계가 있습니다. 예를 들어, 경피 패치의 흡수는 마우스의 개별 흡수를 고려해야 하며, 이는 일관되지 않은 약물 투여로 이어질 수 있습니다. 약물 펌프는 각 투여의 투여량을 정확하게 제어할 수 있지만 전달되는 약물 또는 사용되는 농도와 항상 호환되는 것은 아닙니다. 또한 외과적으로 배치해야 하는데, 이는 동물에게 더 침습적이고 마취 사건이 필요하며 탈구와 같은 수술 후 합병증이 발생할 가능성이 있습니다. 피하 주사는 더 번거롭지만 각 투여에 대한 정확한 투여량을 보장하고 다른 쥐 간의 약물 투여의 일관성을 유지할 수 있습니다. 동시에 비용이 저렴하고 많은 수의 동물 실험을 수행하는 데 적합합니다.

이 연구는 안구건조증 쥐 모델을 확립하기 위해 스코폴라민을 반복적으로 피하주사합니다. 각막 결손, 눈물 분비량, 각막, 결막, 눈물샘의 병리학적 형태 등 안구건조증 지표를 분석합니다. 약물 농도, 병리학적 증상 및 안구건조증 증상을 결합하여 안구건조증 쥐 모델을 더욱 자세히 설명하여 안구건조증 치료 및 병리학적 기전 연구를 위한 보다 정확한 실험 데이터를 제공합니다. 또한 미래의 연구자를 위해 모델링 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 따라 수행되는 모든 동물 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행됩니다.

1. 동물 준비

  1. 160g ± 20g의 건강한 6주 된 SPF Wistar 암컷 쥐 12마리를 준비합니다.
  2. 세극등과 검안경을 사용하여 모든 쥐의 눈 상태를 검사하여 전방 분절이나 망막 질환이 없는지 확인합니다.
  3. 충분한 먹이와 물 공급원으로 1 주일 동안 모든 쥐를 키웁니다.
  4. 모든 쥐를 정상 스코폴라민 약물 농도 2.5mg/mL, 스코폴라민 약물 농도 5mg/mL, 스코폴라민 약물 농도 7.5mg/mL 그룹으로 무작위로 나누고 각 그룹에 3마리의 동물을 배치했습니다.

2. 용액 준비

  1. 스코폴라민 브로마이드를 0.9% 염화나트륨 용액에 녹여 7.5mg/mL, 5mg/mL 및 2.5mg/mL 농도의 용액을 만듭니다.
  2. 쥐의 대조군을 위한 주사로 사용할 스코폴라민 하이드로브로마이드가 없는 0.9% 염화나트륨 용액을 준비합니다.

3. 장비 및 재료 준비

  1. 작은 동물 현미경을 준비합니다.
  2. 바늘이 있는 1mL 일회용 주사기(26G)를 포함하여 실험을 위한 재료를 준비합니다. 플루오레세인 나트륨 안과 스트립; 쉬르머 인열 시험지; 절대 에탄올; 4% 파라포름알데히드; 크실렌; 중립 발삼; 헤마톡실린, 에오신; 및 주기적인 acid-Schiff 염색 키트.

4. 피하주사

알림: 이 절차는 쥐를 고정하는 데 도움이 되는 두 번째 사람의 도움이 필요합니다.

  1. 쥐의 몸을 안정적으로 잡고 왼쪽(또는 오른쪽) 뒷다리를 잡고 쭉 뻗습니다.
    알림: 보조자가 동물을 잡는 데 도움을 줄 수 있습니다.
  2. 알코올로 주사 부위를 청소하십시오.
  3. 바늘이 있는 일회용 주사기 1mL(26g)를 엄지와 손가락 사이의 피부 접힌 부분에 삽입합니다.
  4. 주사기 플런저를 뒤로 당겨 주사기를 흡인합니다. 주사기에 혈액이 있으면 바늘 위치가 잘못되었음을 나타냅니다. 바늘을 제거하고 위치를 변경합니다.
  5. 스코폴라민 하이드로브로마이드를 포함하거나 포함하지 않고 0.9% 염화나트륨 용액을 안정적이고 유동적인 동작으로 투여합니다.
  6. 모든 쥐에게 매번 0.5mL를 주사하고 매일 4회(9:00, 12:00, 15:00, 18:00) 연속 19일 동안 좌우 팔다리를 번갈아 가며 주사합니다.
    참고: 그룹의 이름은 다음과 같습니다.
    스코폴라민 하이드로브로마이드가 없는 그룹: 0군(대조군)
    스코폴라민하이드로브로마이드 2.5mg/mL 함유군: 2.5군
    스코폴라민 하이드로브로마이드 5mg/mL 함유군: 5군
    스코폴라민 하이드로브로마이드 7.5mg/mL 함유군: 7.5군
  7. 동물을 케이지로 돌려보내고 5-10분 동안 호흡과 행동을 모니터링합니다.

5. 눈물분비검사(Schirmer tear test, STT)

  1. 쥐를 위한 수정된 여과지 스트립 만들기11. 사람용 여과지 스트립의 절반을 중심선(1mm × 15mm)을 따라 자르고 스트립의 머리를 다듬어 매끄럽게 만듭니다.
    알림: 눈물 분비 검사를 수행하기 전에 쥐의 몸을 수동으로 제지하여 움직임을 방지하고 쥐의 눈이 노출되도록 하십시오.
  2. 여과지 스트립을 쥐의 아래 눈꺼풀 결막낭의 바깥쪽 1/3에 놓습니다.
  3. 테스트 시간을 5분 동안 측정합니다. 시술 내내 쥐의 눈을 감는 것을 제어하십시오.
  4. 측정 후 핀셋을 사용하여 여과지 스트립을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 튜브 벽에 표시를 하여 눈물량을 기록합니다.
  5. 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 눈물 분비를 측정합니다.

6. 각막 플루오레세인 염색

  1. 0.5% 플루오레세인 나트륨 용액 0.5μL를 각 쥐의 하부 결막낭에 떨어뜨립니다.
  2. 플루오레세인 점안 후 3분 동안 청색광 아래에서 각막을 관찰합니다.
  3. 각 쥐의 각막에 대한 형광 염색을 기록하고 각막 결함이 있는지 관찰합니다.
  4. 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 각막 플루오레세인 염색을 수행합니다.

7. 결막 조직의 조직학적 관찰

  1. 모델 개발을 완료한 후 동물의 긴장을 완화하기 위해 10% 수성 클로랄 수화물 0.4mL/100g의 복강 내 주사로 쥐를 깊이 마취합니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
  2. 각 쥐의 동일한 영역에서 약 2mm x 2mm 크기의 구근 결막을 채취합니다.
  3. 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 즉시 조직을 고정하고 파라핀13에 삽입합니다.
  4. 5μm 두께의 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(HE)14 및 주기적 산-쉬프(PAS) 염색으로 염색합니다(제조업체의 지침을 따름).

8. 각막 및 눈물샘 조직의 조직학적 관찰

  1. 모델 개발을 완료한 후 7.1단계에서 설명한 대로 쥐를 안락사시킵니다.
  2. 각 쥐의 오른쪽에 있는 각막을 채취하여 4% 파라포름알데히드 용액에 즉시 고정합니다.
  3. 귀와 눈초리를 연결하는 선을 따라 두부 표피와 피하 조직을 자르고 절개 부위를 양쪽으로 확장하여 황색을 띤 여분의 안와선을 더 분리합니다.
  4. 쥐의 털을 완전히 제거하고 0.9% 염화나트륨 용액으로 안와외 분비샘을 분리합니다.
  5. 분리된 안와외 땀샘을 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 넣고 파라핀에 넣습니다.
  6. ~5μm 두께의 연속 절편을 절단하고 각막 및 안와외 동맥 조직 표본을 위해 HE로 염색합니다.

9. 통계 분석

  1. 데이터의 통계 분석을 위해 적절한 소프트웨어를 사용하십시오.
    1. 데이터를 분석하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하고 그룹 간 비교를 위해 최하위 차이 검정(LSD)을 수행합니다. 통계적 유의성 수준을 α = 0.05로 설정하고 P < 0.05는 통계적 유의성을 나타냅니다.
      참고: SPSS 20 소프트웨어는 실험 데이터의 통계 분석을 위해 사용되었습니다.

결과

Schirmer I 테스트, SIT I
쥐의 눈물량은 실험 시작 후 0일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 측정되었습니다. 실험 결과, 스코폴라민 투여군(2.5군, 5군, 7.5군)의 눈물분비는 대조군(0군)에 비해 유의하게 감소하였으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.01). 2.5군, 5군, 7.5군에서는 통계적 유의성이 없었다(P > 0.05). 일수(P > 0.05)에 있어서는 서로 다른 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(그림 1, 표 1).

각막 플루오레세인 염색
각막 플루오레세인 염색은 실험의 0일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일 및 19일에 수행되었습니다. 그 결과 어떤 그룹에서도 각막 플루오레세인 염색이 없었으며, 이는 다양한 농도의 스코폴라민 약물을 사용한 20일간의 실험 동안 명백한 각막 상피 결함이 형성되지 않았음을 나타냅니다(그림 2).

각막 상피의 병리학적 분석
실험 후 각막 상피의 형태를 관찰하고 각막 상피층의 두께를 측정하기 위해 HE 염색을 위해 각 쥐의 각막 조직을 수집했습니다. 대조군의 각막 상피는 질서 정연하게 배열된 상피세포의 4-6개 층으로 구성되었으며, 그 중 기저층은 깔끔하고 촘촘하게 배열된 원주형 상피세포의 단일 층으로 구성되었습니다. 스코폴라민 그룹 2.5, 5, 7의 각막 상피는 대조군보다 현저히 얇았으며, 납작하고 위축된 세포 형태와 무질서한 세포 구조를 보였다. 그룹 7.5에서는 기저층에 느슨한 세포 간 연결과 액포 구조가 있었습니다( 그림 3에서 빨간색 화살표로 표시). 스코폴라민 투여군의 각막 상피와 비교했을 때, 정상 대조군의 각막 상피는 각막 상피층의 두께에 통계적 차이를 보였다(그림 4).

눈물샘의 병리학적 분석
쥐의 눈물샘 분비의 주요 분비선은 외안와눈물샘(extrorbital lacrimal gland)이다15. 눈물샘 절편을 관찰할 때, 눈물샘 상피세포의 형태 변화는 스코폴라민 농도의 증가와 함께 염증 및 조직 부종을 동반하는 것으로 관찰되었습니다. 대조군에서는 그러한 변화가 관찰되지 않았다. 병리학적 결과는 눈물샘의 염증성 변화, 세포 부종 및 선상피세포의 위축이 눈물샘의 기능적 손상에 대한 지표로 사용될 수 있음을 시사한다16 (표 2). 이러한 지표는 눈물 분비량과 관련된 안구건조증의 중증도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다(그림 5).

결막 염색 결과 분석
대조군의 결막 구조는 완전하며 주로 표층과 판막으로 구성됩니다. 표층은 적층된 원주형 상피 세포로 매끄럽고 완전하며 세포 표면에 미세 융모가 있습니다. 흩어져 있는 잔 세포는 상피 세포 사이에 존재했으며, 세포 세포질에는 큰 세포 부피와 점액 과립이 있었습니다. 3개의 스코폴라민 약물 그룹에서 결막 상피의 표층은 현저히 얇았고, 미세 융모 및 잔 세포의 수가 감소했으며, 세포 배열 구조가 불완전하고, 부종을 동반했으며, HE 염색에서 관찰된 바와 같이 소량의 염증 세포가 있었습니다(그림 6).

결막을 PAS로 염색하여 각 마우스의 3개의 독립적인 샘플에서 40x 현미경 필드당 평균 잔 세포 수를 계산하고 평균 ± SD로 표현했습니다(그림 7).

figure-results-1
그림 1: 각 그룹의 Schirmer 테스트 값 통계(mm) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 쥐 각막의 플루오레세인 나트륨 염색. 플루오레세인 나트륨을 사용한 20일간의 실험에서 모든 쥐의 각막에서 긍정적인 결과가 관찰되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 각막 상피 염색 및 두께 측정. 그룹 7.5에서는 기저층에 느슨한 세포 간 연결과 액포 구조가 있었습니다(빨간색 화살표로 표시) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 각 그룹의 각막 상피 두께 통계. 스코폴라민 투여군의 각막 상피와 비교했을 때, 정상 대조군의 각막 상피는 각막 상피층의 두께에 통계적 차이를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 쥐의 안와 외측 눈물샘의 HE 염색 결과. (A) 그룹 0: 시야에서 눈물샘은 소엽 구조를 보이며 관과 관으로 구성되어 있으며 관의 형태에 뚜렷한 이상이 없는 반면, 세뇨관은 세포질에 점액 물질이 풍부한 원뿔 모양의 선세포로 구성되어 있고, 결합 조직에 명백한 부종이 없고, 간질 혈관에 명백한 이상이 없으며, 명백한 괴사 및 염증성 세포 침윤이 없습니다. (B) 그룹 2.5: 시야에서 눈물샘 상피 세포의 간헐적인 위축이 관찰되며, 부피 감소, 불규칙한 모양의 확장된 선강 및 공동 내 점액 물질 감소(빨간색 화살표로 표시)가 관찰됩니다. 또한 간헐적으로 기질에 자유 림프구가 침윤하지만(파란색 화살표로 표시) 유관 형태에 뚜렷한 이상이나 부종의 징후는 관찰되지 않습니다. (C) 그룹 5: 시야에서 눈물샘 상피세포는 간혹 위축되어 크기가 줄어들고, 선강이 커지고, 공동의 점액 물질이 감소하고(빨간색 화살표), 간헐적으로 기질에서 자유 림프구 침윤이 관찰되었으며(파란색 화살표), 눈물샘 소엽 사이의 관 형태 또는 결합 조직 부종의 뚜렷한 이상이 관찰되지 않았습니다. (D) 그룹 7.5: 부종은 시야에서 볼 수 있습니다. 눈물샘 사이의 간격이 넓어지고 배열이 불규칙하며(녹색 화살표), 눈물샘의 상피세포가 종종 위축되고 부피가 작아지며 모양이 불규칙하고(노란색 화살표), 때로는 동맥강이 커지고, 구멍의 점액질이 감소하고(빨간색 화살표), 때로는 자유 림프구가 침윤되고(파란색 화살표), 덕트 형태에 명백한 이상이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 쥐 결막의 HE 염색. 대조군의 결막 상피와 비교했을 때, 스코폴라민 약을 투여한 결막 상피의 세 그룹 모두 다양한 정도의 구조적 손상을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 결막의 PAS 염색. (A) 정상 대조군 쥐. (B) 스코폴라민 그룹 쥐. (C) 각 그룹의 잔 세포 밀도(20x). 검은색 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Schirmer I 검정, SIT(평균값, 단위[mm])
그룹0 일3 일5 일7 일11일15일19일
064.25875.56.3
2.522.722.73.33.73
52.32.71.72.33.23.73
7.52.33.22.52.82.73.22.8

표 1: 서로 다른 시점(mm)에서 4개 그룹의 쥐에 대한 Schirmer 테스트. 약물을 투여한 후 쥐의 눈물 분비는 현저히 감소했습니다.

수괴 사염증부상피 위축
0 Grp-10000
0 Grp -20000
0 Grp -30000
2.5 그룹 -10100
2.5 그룹 -20000
2.5 Grp -30101
5 Grp -10101
5 그룹 -20101
5 그룹 -30001
7.5 Grp -10121
7.5 그루프 -20101
7.5 그루프 -30122

표 2: 쥐의 눈물샘의 병리학적 조직 점수. 채점 기준: 0: 정상적인 조건에서 동물의 나이, 성별 및 변형과 같은 요소를 고려하여 조직이 정상으로 간주됩니다.

1: 관찰된 변경 사항이 정상 범위를 초과했습니다. 2: 병변이 관찰될 수 있지만 아직 심각하지는 않습니다. 3: 병변이 뚜렷하고 계속 악화됩니다. 4: 병변이 매우 심하고 전체 조직에 영향을 미쳤다16.

토론

수성 결핍성 안구건조증(ADDE)은 전체 안구건조증 인구의 약 1/3을 차지하는 중요한 유형의 안구건조증이며17 ADDE의 주요 원인은 눈물샘 병리학적 손상과 염증이다13. 이러한 유형의 안구건조증의 경우 가장 일반적인 임상 치료 방법은 증상을 완화하기 위한 인공눈물이나 스테로이드 또는 사이클로스포린의 국소 도포입니다18 반면, 눈물샘 손상에 대한 치료 옵션은 거의 없습니다. 따라서 눈물샘 기능 재건술이 안구건조증에 미치는 영향을 탐색하고 눈물샘 기능 장애의 동물 모델을 확립하는 것이 매우 중요합니다. 쥐의 눈물샘 분비를 억제하기 위해 약물을 반복적으로 투여하는 방법을 사용하여 만성 눈물샘 기능 장애 안구건조증 동물 모델을 만들었습니다.

이 안구건조증 모델을 만들기 위해 쥐를 선택했는데, 이는 다른 동물 모델에 비해 더 많은 장점을 가지고 있다19. 예를 들어, 토끼는 몸집이 더 크고 원하는 효과를 얻기 위해 더 많은 양의 약물이나 더 자주 주사해야 합니다. 또한 토끼는 약간 더 비싸기 때문에 실험 비용이 더 많이 듭니다. 마우스는 또한 안과 연구에서도 일반적으로 사용되지만, 일반적으로 쇼그렌 증후군 모델(20)을 구성하는 데 사용된다. 이 모델은 장기 염증과 림프구 침윤을 비교하여 면역병리학적 메커니즘을 탐구하는 데 중점을 둡니다. 생쥐는 몸집이 작고, 눈물샘의 해부학적 구조가 복잡하며, 눈물 분비가 적어 눈물 분비를 정확하게 반영하기 어렵습니다. 쥐 동물 모델은 편리한 약물 주입이 가능하고, 섭식 조건이 비교적 간단하며, 임상 및 실험 연구 모두에 적합하고, 비용 측면에서도 장점이 있기 때문에 안구건조증 모델에 더 적합합니다. ADDE에 적합한 동물 모델입니다.

콜린성 수용체 차단제인 스코폴라민을 투여하여 쥐의 체내 콜린성 수용체를 억제하여 눈물샘 분비를 감소시키고 눈물샘 세포의 병리학적 구조를 변화시켜 안구건조증 환자의 눈물샘 상태를 근본적으로 시뮬레이션했습니다. 다른 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 자연 상태에서 눈물샘의 손상된 상태를 더 잘 시뮬레이션합니다. 염화벤잘코늄 점안액(benzalkonium chloride eye)21을 사용하거나 습도를 낮추고 안구 표면 증발을 증가시키는 것과 같은 외부 조건을 변경하는 것과 같은 다른 방법들은4,8 안구 표면 환경을 교란시킬 뿐, 눈물샘의 기능적 상태를 변화시키지 않는다. 따라서 장기간의 만성 안구건조증 질환에는 적합하지 않습니다.

쥐의 눈물 분비량을 측정하기 위해 Schirmer 눈물 테스트 스트립을 개선했습니다. 먼저 인간이 사용하는 눈물 테스트 스트립을 중심선을 따라 자릅니다. 그런 다음 상단을 둥근 호 모양으로 자르고 쥐의 하부 결막낭에 쉽게 삽입할 수 있도록 상단에서 부드럽게 접었습니다. 쥐는 활동적이며 5분 동안 눈물을 측정하기 어렵다는 점에 유의해야 합니다. 쥐의 하부 결막낭에 Schirmer 눈물 테스트 스트립을 삽입한 후 쥐의 눈을 수동으로 감아 편안함을 높이고 측정 결과에 영향을 줄 수 있는 긴 눈물 측정 중에 어려움을 겪지 않도록 했습니다.

눈물샘을 추출할 때 먼저 눈물샘을 찾아야 합니다. 눈물샘 국소화의 지점은 귀 앞쪽과 안쪽 안각 사이의 중간 지점입니다. 그런 다음 모피 아래의 피부 조직을 잘라 조각난 모피의 유입을 최소화하고 나중에 처리 과정을 줄입니다. 추출 과정에서 조각난 모피를 적시에 청소하는 것도 중요합니다. 특히 눈물샘을 분리할 때는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 식염수를 사용하여 반복적으로 헹구고 절편 결과에 영향을 줄 수 있는 다른 조직과의 혼합을 피하십시오.

개발된 안구건조증 동물 모델의 장점은 프로토콜이 다양한 약물 농도와 눈물샘 손상 정도를 연관시킨다는 것입니다. 이것은 눈물샘 기능 장애의 치료에 대한 연구를 위한 실험적 기초를 제공합니다. 연구자에게 보다 자세한 참조 자료를 제공하기 위해 모델링 프로세스의 일부 운영 단계를 개선했습니다. 또한 안구건조증 동물 모델에 대한 분석 지표를 추가하여 각막, 결막, 눈물샘의 형태학적 지표를 통합하고 결막 세포를 계산하고 눈물샘 손상 정도를 채점했습니다. 염증, 부종, 위축으로부터 눈물샘 기능을 평가했다. 안구건조증과 눈물샘 기능 장애의 정도를 반영하기 위해 가장 포괄적이고 비용 효율적이며 정확한 분석 방법을 선택했습니다.

그러나 이 방법에는 특정 제한 사항도 있습니다. 동물 모델을 구성하는 긴 과정으로 인해 실험자는 반복적으로 주입해야 합니다. 현재 약물 펌프나 경피 패치와 같은 수동 주사를 대체하는 몇 가지 방법이 있지만 여전히 사용에는 몇 가지 합병증이 있습니다. 약물 투여 빈도를 줄이고, 합병증 발생을 방지하고, 복용량의 정확성을 보장하기 위해 더 나은 방법을 적용하는 방법이 우리의 다음 목표입니다. 결론적으로, 스코폴라민 주사로 인한 안구건조증 동물 모델을 개선하여 ADDE의 눈물샘 기능 장애 연구를 위한 실험적 기반을 제공했습니다.

공개 사항

저자는 이 절차에 사용된 약물 및 재료와 관련된 잠재적인 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 광둥성 고위급 임상 핵심 전문 분야(SZGSP014)와 선전 자연과학 재단(JCYJ20210324125805012)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨 용액SJZ No.4 제약H13023201
4% 파라포름알데히드Wuhan Servicebio Technology Co., LtdG1113
절대 에탄올Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.
플루오레세인 나트륨 안과 스트립톈진 Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-YG-I
헤마톡실린 및 에오신난징 Jiancheng 생명 공학 연구소D006
중성 발삼베이징 Solarbio 과학 및 ; 테크놀로지 주식회사 G8590
파라핀베이징 Solarbio 과학 및 공급자:Technology Co., Ltd.YA0012
주기적인 산-쉬프 염색 키트Beyotime BiotechnologyC0142S
쉬르머 인열 테스트 스트립Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-LZ-I
스코폴라민 하이드로브로마이드Shanghai Macklin Biochemical Co., LtdS860151
소동물 현미경헤드 생명공학 Co., Ltd. 주식회사ZM191
크실렌시노팜 화학 시약 Co., Ltd.
1000921810023418

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