생쥐의 대장염 암 모델 확립 및 한의학 치료 효과 평가

대장암(CRC)은 흔한 위장관 악성 종양으로, 세계에서 세 번째로 흔한 악성 종양이자 두 번째로 흔한 사망 원인으로, 전 세계 암 발생률의 10%, 전체 암 관련 사망의 9.4%를 차지합니다 ^1,2. 유전적 요인, 만성 염증, 고지방 식단, 당뇨병 및 비정상적인 장내 세균총은 CRC ^3,4의 위험 요인입니다. 그 중에서도 염증성 장 질환, 특히 궤양성 대장막염(UC)은 CRC ^5,6의 명백한 위험 인자입니다. UC-associated CRC (UC-CRC)는 대장직장의 만성 염증을 기반으로 하는 염증, 비정형 증식증 및 암의 전이 과정으로, CRC ^7,8의 전형적인 선종-선암 발생 모델과는 다릅니다. CRC의 위험은 일반인에 비해 염증성 장질환 환자에서 약 10-40배 더 높다⁹.

현재 CRC는 수술이 표준 치료법이며, 종양의 위치와 병기에 따라 방사선 요법, 전신 약물 요법 또는 이 둘의 조합이 가능하다¹⁰. 이러한 전통적인 치료 방식은 큰 진전을 이루었지만 CRC의 높은 이질성과 재발률로 인해 예후가 좋지 않고 치료 효과가 이상적이지 않습니다^11,12. 따라서 CRC 환자의 생존율 향상을 위해서는 조기 발견, 조기 진단, 종합 치료가 중요하며, 특히 UC에서 CRC로의 전환에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 수년에 걸쳐 한의학(TCM)은 부작용이 적고 효능이 높아 UC-CRC 또는 만성 위염 치료에 많은 관심을 끌었습니다. 변증법적 치료를 바탕으로 다양한 세대의 유명한 한의학 개업의들은 Huangqi Jianzhong 달인¹³, Sijunzi 달인¹⁴ 및 Sishen 알약¹⁵와 같은 많은 고전적인 처방을 만들었습니다.

Liujunzi 달인 (LJZD)은 명나라에서 편찬 된 Yi Xue Zheng Zhuan의 작품에서 유래했으며 TCM¹⁶의 고전적인 처방입니다. 표 1에서 볼 수 있듯이 LJZD는 Codonopsis pilosula(Franch)를 포함한 6가지 전통 허브로 구성되어 있습니다. 난프. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) 늑대 (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) 및 Pinellia ternata (Thunb.) 기(氣)를 보충하고 비장을 튼튼하게 하며 습기를 건조시키고 가래를 해소하는 효과가 있는 브라이트(Banxia)입니다. 현대 임상 실습에서는 만성 위염, 위궤양 및 십이지장 궤양을 치료하는 데 자주 사용됩니다. 현대 약리학 연구에 따르면 LJZD 및 변형 LJZD는 UC 및 소화관암의 보조 치료에 높은 응용 가치를 가지고 있습니다 17,18,19.

현재 UC-CRC 마우스 모델을 구성하는 방법에는 여러 가지가 있지만 아족시메탄(AOM)/덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도 마우스 모델이 가장 널리 사용되는 UC-CRC 모델입니다. 임상 증상, 형태학적 및 병리학적 관찰을 통해 모델이 인간 UC-CRC^20,21과 매우 유사하다는 것이 입증되었습니다. 기본 원리는 먼저 화학 발암물질인 AOM으로 발암을 유도한 후 마우스를 DSS의 염증 자극 환경에 지속적으로 노출시켜 장 점막 상피의 지속적인 손상 및 복구를 시뮬레이션하여 UC-CRC 마우스 모델⁽²²)을 구축하는 것이다. 본 연구의 목적은 단기적으로 AOM의 복강내 주사와 DSS의 주기적 자극에 의한 UC-CRC의 마우스 모델을 확립하고, UC-CRC에 대한 약물의 효과와 LJZD의 분자 기전을 평가하여 UC-CRC 치료에 대한 과학적 근거를 제공하는 것이다.

동물 시술은 장춘 중의대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2021214). 특정 병원체가 없는 C57BL/6J 마우스(8-10주, 체중 18-22g), 수컷 및 암컷은 22°C 및 65% 상대 습도에서 독립적으로 환기되는 케이지에 수용되었습니다. 생쥐는 7 일 적응 먹이 후에 실험을 시작했으며, 그 동안 물과 식단에 자유롭게 접근 할 수있었습니다.

1. 약물 준비

1. LJZD의 제조
   참고: 사용된 한약은 장춘중의과대학 부속병원에서 구입한 것으로 정품으로 확인되었다( 표 1 참조).
   1. Dangshen (12g), Baizhu (12g), Gancao (6g), Chenpi (12g), Jiangbanxia (9g)를 특수 도자기 냄비에 넣습니다 ( 재료 표 참조). 증류수 1000mL를 넣고 실온에서 1시간 동안 담가둡니다( 그림 1A 참조).
   2. 분말 12g 그라인더로 미세한 분말에 풀링하고 실온에서 1시간 동안 다른 용기에 증류수 300mL를 담근다.
   3. 위의 한약을 특수 도자기 냄비에 섞습니다. 혼합물을 끓인 다음 달인 물이 300mL만 남을 때까지 중간 불에서 유지합니다. 여과를 위해 의료용 거즈를 사용하고 여과액을 실온에서 보존하십시오.
   4. 증류수 1000mL를 넣고 위의 달인 작업을 한 번 더 반복합니다. 의료용 거즈를 사용하여 다시 여과하십시오. 여과액을 혼합하고 150mL만 남을 때까지 끓입니다.
   5. 농축액을 10,000 x g 에서 5분간 원심분리하고, 얻어진 상층액을 중불에서 30mL까지 더 농축시킨다. 최종 농축액을 접시에 옮기고 용질만 분말로 남을 때까지 전기 건조 오븐을 사용하여 건조합니다.
   6. 위의 고체의 무게를 측정하고 멸균 증류수에 용해시켜 마우스의 일일 투여량인 0.2mL(114.16mg/mL)당 22.85mg의 약물을 함유한 용액을 얻습니다.
2. 5-아미노 살리실산의 제조
   참고: 5-아미노 살리실산(5-ASA, 자료표 참조)은 UC-CRC에 대한 우수한 예방 효과가 있으며, 본 연구에서 양성 약물로 사용되었다²³.
   1. 64mg 5-ASA 분말을 멸균 증류수 200mL에 녹여 1.82mg/mL 5-ASA 용액을 얻습니다. 쥐 한 마리의 일일 투여량은 0.2mL였습니다.
3. AOM 주입액 제조
   1. 2.5mL의 멸균 증류수를 25mg AOM 분말에 첨가하고( 재료 표 참조) 와류 믹서( 재료 표 참조)로 혼합하여 10mg/mL AOM 원액을 만들고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
   2. AOM 원액을 멸균 증류수로 10:1(1mg/mL)로 희석하여 AOM 주입 용액을 준비합니다.

2. UC-CRC 모델 구축

참고: 실험은 대조군, 모델군, LJZD, 5-ASA군의 4개 그룹으로 나뉘었으며, 각 그룹에는 10마리의 마우스가 배치되었습니다. 대조군을 제외한 나머지 그룹은 AOM 및 DSS로 치료했습니다.

1. AOM 주입액의 복강내 주사
   참고: 7일 적응 급식 후, 마우스에게 복강 내 주사에 의해 AOM 주입 용액(1mg/mL)을 투여했습니다( 그림 1B 참조).
   1. 배를 위로 향하게 하고 머리를 약간 아래로 향하게 하여 쥐를 잡습니다. 뒷 피부를 잡아 복부 피부를 조이고 1mL 주사기로 복부 중앙선에서 양쪽 허벅지 뿌리선의 교차점에서 약 1cm 오른쪽으로 피부를 뚫습니다( 재료 표 참조).
   2. 1mL 주사기 바늘을 복부 정중선과 평행하게 유지하면서 피부 아래 3-5mm까지 밀어 넣고 바늘을 0.3-0.5mm로 복강에 45° 삽입합니다.
   3. 팁이 복부 근육을 통과한 후 작업자는 갑작스러운 저항 상실을 감지합니다. 그런 다음 주사기를 바깥쪽과 뒤로 당겨 액체 누출이 발생하는지 관찰합니다. 그렇지 않은 경우 AOM 주입 용액을 0.1mL/10g의 속도로 마우스에 천천히 밀어 넣습니다.
2. 2% DSS 용액의 주기적 자극
   참고: 각 AOM 유도 마우스는 3주, 6주 및 9주차에 500mL의 DSS 용액을 투여받았고, 마우스는 이 기간 동안 자유롭게 마셨습니다.
   1. 2g DSS에 멸균 증류수 500mL를 첨가하여 10% DSS 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 와류 믹서와 혼합하여 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 각 AOM 유도 마우스는 AOM 유도 후 3주, 6주, 9주에 7일 동안 500mL의 2% DSS 용액을 자유롭게 마십니다.

3. 약물 치료

참고: 성인은 하루에 63g의 LJZD가 필요합니다. 실험용 마우스와 인간 약물 용량의 변환 공식에 따르면, 마우스에 대한 등가 실험 용량(mg/kg) = 인간 용량(mg/kg)/체중(60kg) x 9.1, 마우스의 일일 용량은 약 9.6g/kg이었습니다.

1. LJZD 및 5-ASA 그룹을 각각 7주차 및 15주차에 위축으로 준비된 LJZD 및 5-ASA 용액 0.1mL/10g으로 처리합니다.
   1. 마우스의 위장 내 투여를 위해 다음 절차를 수행하십시오. 왼손에는 마우스를 잡고 오른손에는 위 관류 장치를 잡습니다. 주사기 바늘을 입에 삽입하고 쥐의 인두 뒤쪽 벽 아래로 밀어 넣습니다. 쥐가 삼킬 때 인두를 아래로 밀어 넣고 계속 앞으로 나아갑니다. 저항감이 있고 주사기를 인두에 밀어 넣을 수 있을 때 바늘을 빼내고 주사를 완료합니다.
2. 대조군과 모델 그룹을 동일한 양의 식염수로 처리합니다( 재료 표 참조).
3. 투여 기간 동안 하루에 한 번 적절한 약물로 각 그룹의 마우스를 치료하십시오.

4. UC-CRC 모델 평가 및 LJZD의 효능

1. 질병 활동 지수 점수
   참고: 표 2에 따르면, 질병 활성 지수(DAI) 점수는 마우스의 체중 감소, 분변 점도 및 대변 출혈을 결합하여 평가되었습니다.
   1. 적응 급식의 시작부터 약물 치료가 끝날 때까지 매일 쥐의 체중을 기록하십시오.
   2. 각 실험용 쥐의 대변 농도를 주의 깊게 관찰하고 배변을 정상, 묽은 변, 묽은 설사의 세 가지 조건 중 하나로 기록합니다.
   3. 실험동물의 분변출혈을 출혈 없음, 출혈 적음, 대변에 피가 보이는 세 가지 조건 중 하나로 기록한다.
2. 혈청 내 IL-6 수치 검출
   1. LJZD 또는 5-ASA로 마우스를 9주 동안 치료합니다. 왼손으로 쥐의 목 피부를 잡고 실험대를 부드럽게 눌러 측면 욕창 자세를 취하여 쥐를 고정합니다. 가위로 쥐의 수염을 자릅니다. 혈액 오염을 방지하기 위해 가위로 쥐의 수염을 조심스럽게 잘라냅니다( 재료 표 참조).
      참고: 자유롭게 흔들 수 없는 마우스는 제대로 고정된 것으로 간주되었습니다. 이것이 발생하지 않으면 마우스를 수정해야 합니다.
   2. 2% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 안구 주위의 피부를 에탄올로 소독합니다( 재료 표 참조). 옆쪽의 눈 피부를 부드럽게 눌러 안구가 울혈되고 튀어나오도록 합니다.
   3. 팔꿈치 핀셋으로 안구를 고정하고 안구를 정확하고 빠르게 제거합니다. 혈액이 원심 튜브로 떨어지도록 합니다( 재료 표 참조). 이 과정에서 쥐의 심장을 탭하면 혈액 채취 속도가 빨라집니다.
   4. 채취한 혈액을 실온에서 30분간 보관하고 3,500 x g 에서 10분간 원심분리합니다. 상층액을 수집하고 IL-6 함량 검출 키트 지침에 따라 IL-6 수준을 검출합니다( 재료 표 참조).
3. 결장 직장 조직 분리
   1. 동물 윤리에 따라 5% 과다 투여된 이소플루란 및 자궁경부 탈구( 재료 표 참조)를 흡입하여 혈액 샘플링 후 마우스를 안락사시킵니다.
   2. 쥐를 극저온 해부학적 환경에 보관하십시오. 쥐를 누운 자세로 움직이지 못하게 합니다. 하복부 털을 가위로 자르고 에탄올로 소독합니다.
   3. 두 허벅지 뿌리와 복부 정중선 사이의 교차점을 눈꺼풀 집게로 꼬집습니다( 재료 표 참조). 가위로 약 1-1.5cm 가로 절개를 자릅니다.
   4. 횡방향 절개의 중간 지점에서 xiphoid 돌기를 향해 복부의 정중선을 따라 세로 절개를 클립합니다.
   5. 항문 방향으로 대장 주위 조직을 제거하여 주변 조직에서 결장 직장을 분리합니다. 대장이 손상되지 않도록 주의하십시오.
   6. 복부의 피부를 옆으로 밀어 대장을 완전히 노출시킵니다. 눈꺼풀 집게로 복강에서 결장 직장을 제거하고 항문에서 맹장까지의 분절을 잘라냅니다 (제외). 전체 길이는 약 10cm입니다. 얻어진 대장 직장 조직을 4 °C의 식염수에 보관합니다.
4. 직장의 길이와 무게 평가
   1. 4 °C에서 5 mL 바늘로 식염수를 추출하여( 재료 표 참조) 대장 내부를 씻어냅니다. 그런 다음 조직의 수분을 흡수하기 위해 흡수성 종이 위에 colorectum을 놓습니다.
   2. 대장 조직의 무게를 잰 다음 A4 용지에 올려 길이를 측정합니다.
5. 결장직장의 종양 수 측정
   1. 대장항문을 세로로 잘라 완전히 펴고 대장항문에 있는 종양의 수와 크기를 관찰합니다.
6. 결장직장의 병리학적 분석
   1. 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 결장직장을 고정합니다. 녹인 파라핀에 고정된 직장 조직을 삽입하고 조직 동결 마이크로톰에 의해 5μm 두께로 연속적으로 절편합니다.
   2. Hou et ^al.24의 절차에 따라 자일렌에서 절편을 왁스를 제거한 다음 연속 농도의 에탄올로 탈수합니다. 헤마톡실린 용액으로 5분 동안 염색한 후 순수한 물로 부분을 헹굽니다. 그 후, 0.5 % 에오신 용액으로 1 분 동안 염색하십시오 ( 재료 표 참조).
   3. 그래디언트 탈수 및 크실렌 투명 처리를 다시 수행합니다. 섹션을 밀봉하고 Xie et ^al.25에 설명된 대로 광학 현미경(재료 표 참조)과 사진으로 관찰합니다.
7. 대장의 면역조직화학적 분석
   1. 위의 방법에 따라 섹션을 왁스를 제거하고 탈수하십시오. Gok et ^al.26에 의해 기술된 바와 같이 고압 열 복구 기술로 절편의 항원을 복구합니다.
   2. 실온에서 내인성 과산화효소 차단제에 절편을 담그십시오. 염소 혈청으로 섹션을 밀봉하십시오( 재료 표 참조).
   3. 1차 항체 ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) 및 KI67 (1:500; 재료 표 참조)을 절편에 추가하고 4 °C에서 밤새 배양합니다. PBS 완충액( 재료 표 참조)으로 절편을 헹구고 범용 2차 항체(1:5000, 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   4. DAB 솔루션( 재료 표 참조)을 색상 개발 섹션에 추가합니다. 절편을 헤마톡실린 용액으로 대조염색합니다.
   5. 단면을 탈수하고, 투명화하고, 다시 밀봉합니다. 광학 현미경으로 단백질의 발현을 관찰합니다.

LJZD의 달임은 표 1의 약물 조성비와 도 1A의 TCM의 달임방법에 따라 제조하였다. 도 1B에 나타낸 시점에 따라, 마우스는 7일째에 1mg/mL AOM을 복강내로 주사하고, 마우스는 3주, 6주, 9주에 2% DSS를 함유한 식수를 자유롭게 이용할 수 있게 하였다. UC-CRC 마우스 모델은 15주차에 성공적으로 확립되었습니다. 한편, 마우스는 7주차부터 15주차까지 LJZD로 개비지로 처리되었습니다. 데이터는 대조군과 비교하여 UC-CRC 모델 그룹이 상당한 체중 감소를 보였으며 이는 LJZD 치료에 의해 완화되었습니다(그림 2A, P < 0.01). 임상시험이 끝날 무렵, LJZD 치료는 UC-CRC 모델 그룹에 비해 DAI 점수를 개선했습니다(그림 2B). 대조군과 비교했을 때, UC-CRC 모델군은 결장직장 길이가 더 짧았으며, 이는 LJZD 치료에 의해 증가했다(그림 2C,D, P < 0.01). 체중에 대한 대장 체중의 비율은 마우스에서 CRC의 발달을 반영하며, 비율이 높을수록 급성 종양 발생을 나타낸다27. 대조군에 비해 모델군의 대장직장 장기 지수가 유의하게 증가하였고, LJZD 치료는 대장직장 장기 지수를 크게 감소시켰다(그림 2E, P < 0.05). 또한, LJZD 치료는 대장 종양의 형성을 억제하고(그림 2F, P < 0.01) 혈청 전염증 인자 IL-628의 수준을 억제했다(그림 2G, P < 0.05).

병리학적 결과, 대조군에 비해 UC-CRC 모델군의 마우스는 대장암 종양이 더 크고 선암이 형성된 반면, LJZD 치료는 종양의 크기와 등급을 감소시켰다(그림 3). 면역조직화학적 데이터는 LJZD 치료가 ZO-1 및 Occludin29 의 단백질 발현 증가로 알 수 있듯이 UC-CRC 모델 마우스에서 결장 장벽 기능을 향상시킨다는 것을 보여주었습니다(그림 4). 이와 병행하여 LJZD 처리는 암 마커 KI6730 의 단백질 발현 수준을 억제했습니다(그림 4).

그림 1: LJZD의 제조 및 대장막염 암의 마우스 모델 확립.( A) 당셴(12g), 바이주(12g), 간차오(6g), 첸피(12g) 및 생강 가공 반샤(9g)의 혼합물을 증류수 1000mL에 실온에서 1시간 동안 담갔다. 12g의 풀링 분말을 300mL의 증류수에 실온에서 1시간 동안 담갔다. 상기 6가지 허브의 혼합물을 100°C에서 40분 동안 달인하였다. (B) 7일째에, C57BL/6J 마우스에 1mg/mL AOM을 복강내로 주사하였다. 마우스는 3주,6 주 및 9 주에 2 % DSS ad libitum을 함유 한 물을 투여 받았다. 7주 내지 15주에, 마우스는 LJZD를 개비젼으로 투여하였다. 약어: AOM, 아조메탄; DAI, 질병 활성 지수; DSS, 덱스트란 황산염 나트륨; LJZD, Liujunzi 달인; w, 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: UC-CRC 모델 평가 및 LJZD의 효능. (A) LJZD는 UC-CRC 모델 마우스의 체중을 개선했습니다. (B) LJZD ACLIATED DAI 점수는 UC-CRC 모델 마우스에서 나타났다. (씨, 디) LJZD는 UC-CRC 모델 마우스에서 결장직장의 길이를 증가시켰습니다. (E) LJZD는 UC-CRC 모델 마우스에서 결장직장의 장기 지수를 감소시켰습니다. (F) LJZD는 대장직장염 암 모델 마우스에서 결장직장 종양형성을 억제하였다. (G) LJZD SUPPRESSED SERUM IL-6 level in UC-CRC model mouses(UC-CRC 모델 마우스에서 LJZD 억제 혈청 IL-6 수준). #대조군과 비교한 P< 0.05 및 ##P< 0.01; *모델 그룹과 비교했을 때 P < 0.05 및 **P< 0.01입니다. 데이터는 평균± 표준 편차(n=10)로 표현되었으며 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 검정으로 분석되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 헤마톡실린-에오신 염색에 의한 생쥐 대장 조직의 병리학적 특성 평가. 대조군에서는 병리학적 손상이 없었다. UC-CRC 모델군의 종양 조직은 크기가 커서 선암과 고등급 종양을 형성한 반면, LJZD 치료군은 소량의 국소 선종과 저등급 종양을 동반한 종양 조직이 감소했다. 검은색 화살표는 전암성 이형성 종양선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: UC-CRC 모델 마우스의 결장직장 장벽 기능 및 암 마커에 대한 LJZD의 효과. (A) ZO-1, Occludin 및 KI67의 면역조직화학적 이미지. (B) ZO-1, Occludin 및 KI67의 단백질 발현에 대한 통계적 결과. LJZD 치료는 UC-CRC 모델 마우스에서 대장 장벽 기능성 단백질인 ZO-1 및 Occludin의 발현을 증가시키는 반면, 암 마커 KI67의 수치를 감소시켰습니다. ## 대조군과 비교하여 P < 0.01; ** P< 0.01로 모델 그룹과 비교했습니다. 데이터는 평균± 표준 편차(n=10)로 표현되었으며 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 검정으로 분석되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: LJZD에서 약물의 구성 및 비율.

표 2: 마우스의 UC-CRC 모델에 대한 질병 활성 지수 점수.

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