인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 염증 자극에 반응하여 호중구에서 압출된 거미줄 모양의 염색질 구조입니다. NET은 DNA, 히스톤 및 다양한 항균 단백질/펩타이드로 구성되어 감염성 병원체를 포획하여 죽이고 염증 반응을 유발합니다¹.

NET은 병원균에 대한 숙주 방어에 도움이 되지만, 다양한 자가면역질환², 혈전증³, 대사질환⁴, 암5의 전이성 성장의 잠재적 동인으로 주목^{받고 있다.} 따라서 NET 형성 억제는 이러한 질병에 대한 잠재적인 치료 옵션입니다. 그러나, 개발⁶에서 일부 유망한 NETs-표적 분자에도 불구하고, 이 메커니즘에 특이적으로 영향을 미치는 승인된 치료법은 아직 없다. 이는 적어도 부분적으로는 NET 형성을 위한 객관적이고, 편향되지 않고, 재현 가능하고, 처리량이 많은 정량화 방법이 부족하기 때문입니다.

우리는 이중 색상 라이브 셀 이미징 플랫폼 ^7,8을 활용하는 새로운 방법을 수립하고 보고했습니다. 막 투과성 핵 염료 및 막 불투과성 DNA 염료로 염색된 호중구의 타임 랩스 이미지는 소프트웨어에 의해 분석되며, NET 형성 전후 호중구의 수는 여러 시점에서 계산됩니다. PKCα 매개 라민 B 및 CDK4/6 매개 라민 A/C 분해⁹의 조절에 의해 NET 형성 중에 원형질막의 무결성이 손실되기 때문에, NET 형성 호중구는 막불침투성 DNA 염료에 의해 염색되는 반면 건강한 호중구는 그렇지 않습니다. 이 방법은 NET 형성을 정량화하기 위해 이전에 보고된 기술의 문제를 극복하고 자동화된 방식으로 편향되지 않고 처리량이 높으며 재현 가능하고 정확한 NET 정량화를 제공합니다.

건강한 인간 피험자의 호중구는 미국 국립보건원(NIH)의 임상시험계획위원회(IRB) 승인 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의가 제공된 후 획득되었습니다. 이 프로토콜은 NIH 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 호중구의 염색 및 분석판의 준비

1. 각 기관의 지침에 따라 적절한 서면 동의서와 함께 말초 혈액을 채취하고 원하는 방법을 사용하여 호중구를 분리합니다. 예를 들어, 피콜-덱스트란 방법(^10,11)은 인간 말초 혈액으로부터 호중구를 분리하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이다.
   참고: 여기서 논의된 방법은 인간 호중구를 사용하지만 마우스 호중구도 유사한 프로토콜을 사용하여 분석할 수 있습니다.
2. Roswell Park Memorial Institute(RPMI, 재료 표 참조) 1640 배지에서 2.0 x 10⁶ 호중구/mL로 호중구를 재현탁시키고 호중구 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
   참고: FBS의 알부민은 NET 형성¹² 을 감소시킬 수 있고 FBS의 열 안정성 뉴클레아제는 NETs¹³을 분해할 수 있기 때문에 일반적으로 배양 배지에 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하지 않습니다.
3. 호중구 현탁액 1.5mL당 1μL의 막투과성 적색 DNA 염료( 재료 표 참조)를 추가합니다.
4. 어두운 곳에서 실온에서 5분 동안 배양합니다. 실온에서 2500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
5. 호중구를 RPMI 1mL에 재현탁시킨 다음 실온에서 2500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 2x 반복합니다(총 3x 세탁).
6. RPMI 1mL에 호중구를 재현탁시키고 세포 카운터를 사용하여 계수합니다. 호중구 현탁액을 1.5 x 10⁵ neutrophils/mL로 희석합니다.
7. 호중구 현탁액 1mL당 4μL의 1:100 사전 희석된 막 불투과성 녹색 DNA 염료( 재료 표 참조)를 추가합니다.
8. 웰당 100μL의 호중구 현탁액을 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에 넣습니다( 재료 표 참조). 각 조건을 세 배로 설정합니다.
   참고: 우리는 이전에 7에서 호중구를 폴리-L-라이신 코팅이 있거나 없는 플레이트에 배치하는 경우 이 방법으로 NET 형성 및 정량화에 차이가 없음^{을 보여주었습니다.} 그러므로, 이 방법에는 조직 배양 처리된 플레이트를 사용하는 것으로 충분하다.
9. 억제제가 있거나 없는 자극 시약을 포함하는 100μL의 RPMI 또는 각 웰에 관심 있는 기타 시약을 추가합니다. 항상 500 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 또는 2.5 μM calcium ionophore (A23187)를 첨가하여 positive control well을 사용하였으며, 30 μM AKT 억제제를 사용하였다.
10. 5%_CO2 인큐베이터에 있는 살아있는 세포 분석 시스템(재료 표 참조)에 플레이트를 놓습니다.
    알림: 이 단계 후 몇 분 후에 플레이트의 상단과 하단에 응결이 나타날 수 있습니다. 이로 인해 적절한 이미징이 방해받을 수 있습니다. 스캔을 시작하기 전에 결로를 철저히 닦고 제거하십시오. 플레이트를 기계에 놓고 소프트웨어를 시작하고 스캔 프로토콜을 입력한 다음 첫 번째 스캔 직전에 플레이트를 닦습니다.

2. NET 형성 호중구를 시각화하기 위한 스캐닝 플레이트

1. 소프트웨어를 시작합니다(소프트웨어 세부 정보는 자료표 참조). 왼쪽 상단 모서리에 있는 +를 눌러 Add Vessel 을 시작합니다.
2. Scan on Schedule(예약에 따라 스캔)을 선택합니다. 새로 만들기를 선택합니다.
   참고: 이 프로토콜이 생성되면 Copy Previous(이전 복사 )를 선택하고 다음 화면에서 stored protocol(저장된 프로토콜)을 선택하여 동일한 스캔 프로토콜을 실행합니다.
3. 표준을 선택합니다. 스캔 설정을 다음과 같이 설정합니다: Cell-by-Cell 옵션: 없음; 이미지 채널: 위상, 녹색(획득 시간: 200ms), 빨간색(획득 시간: 400ms); 목표: 20x.
4. 목록에서 사용 중인 플레이트를 선택합니다. 살아있는 세포 이미징 시스템의 트레이에 플레이트를 놓을 용기 위치를 선택합니다.
5. 샘플이 있는 웰을 선택하고 웰당 몇 개의 이미지를 촬영할지 결정합니다. 웰당 이미지 수를 기준으로 플레이트의 예상 스캔 기간을 생성합니다. 일반적으로 웰당 4개의 이미지면 충분합니다. 그러나 이는 스캔의 조건과 빈도에 따라 달라질 수 있습니다.
6. 플레이트 맵 생성(Create Plate Map)을 클릭하여 각 웰의 정보(예: 세포 유형 및 화합물)를 입력하여 스터디 이름을 입력합니다.
   알림: 플레이트 맵은 소프트웨어의 플레이트 맵 편집기를 사용하여 미리 준비하고 저장할 수 있습니다. 저장된 플레이트 맵 데이터는 이 단계에서 가져올 수 있습니다. 원하는 경우 플레이트 맵 정보 입력을 건너뛰고 나중에 수행할 수 있습니다. 플레이트 레이아웃 정보를 입력하지 않고도 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나 후속 분석을 더 쉽게 하기 위해 플레이트 정보를 입력하는 것이 좋습니다.
7. 다음 화면에서 분석 유형으로 Basic Analyzer(기본 분석기 )를 선택하고 이전에 사용한 분석 정의(스캐닝 프로토콜 아님)를 표시하는 드롭다운 목록에서 Analysis Protocol(분석 프로토콜 )을 선택합니다. 녹색과 적색 모두에 대한 스펙트럼 불혼합은 0.0%로 유지할 수 있습니다.
   참고: 원하는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
8. 검사를 예약합니다. 여기 실험의 경우 15시간 동안 20-8분마다 스캔합니다. 화면 상단의 흰색과 회색 막대를 드래그하여 스캔 시작 시간을 설정합니다.
   참고: 너무 자주 스캔하지 않으면 과열로 인해 기기가 제대로 작동하지 않을 수 있습니다. 스캔 시간은 24시간당 12시간을 초과해서는 안 됩니다. 스캔이 너무 잦은 경우 경고가 표시될 수 있습니다.
9. 다음 화면에서 스캔 설정을 확인하고 Add to Schedule(예약에 추가 )을 눌러 스캔을 시작합니다. 초기 이미지 세트가 스캔될 때까지 기다렸다가 모든 것이 제대로 작동하는지 확인합니다.
   1. 때때로 세포의 초점이 제대로 맞지 않을 수 있습니다. 이 경우 결로가 있는지(그리고 그에 따라 닦아내십시오), 플레이트가 트레이에 올바르게 설정되어 있는지, 플레이트의 위치가 올바르게 지정되었는지 등을 확인하십시오. 세포가 여전히 떠 있고 웰 바닥에 가라앉지 않은 경우 스캔하기 전에 약 5분 동안 기다리십시오.

3. NET을 정량화하기 위한 분석 정의 설정

1. 보기(View) 탭에서 분석할 스터디(vessel)를 엽니다. 화면 왼쪽에서 Launch Analysis(분석 시작 )를 누릅니다. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성)을 선택합니다.
   1. 이전에 분석을 수행한 경우 기존 분석 정의 복사(Copy Existing Analysis Definition)를 선택하여 약간의 변경을 가한 동일한 분석 정의를 사용합니다. 이 경우 3.3단계로 이동합니다. 변경하지 않고 분석을 사용하는 경우 기존 분석 정의 사용(Use Existing Analysis Definition)을 선택합니다. 형광 수준은 날마다 분석마다 다를 수 있으며 일반적으로 약간의 수정이 필요하기 때문에 권장되지 않습니다.
2. 기본 분석기를 선택합니다. 모든 이미지 채널(위상, 녹색, 빨강 및 겹침)을 사용합니다.
   참고: 일반적으로 초록색과 빨간색 오브젝트 마스크를 사용하여 NET을 계산하지만, 겹침 오브젝트 마스크는 파편이 중요할 때 유용합니다. 이러한 경우 겹치는 개체 수 수가 녹색 개체 수 대신 분자로 사용됩니다(3.9단계 참조). 녹색 물체 수 대신 겹침 물체 수를 사용하는 경우 모든 빨간색 신호를 올바르게 계산해야 합니다. 적색 신호 설정을 조정하여 이후 시점에서 촬영한 이미지에서 적색 신호가 낮은 모든 적색 물체를 계산하지만 파편은 계산하지 않습니다.
3. 학습을 위해 6 - 8개의 대표적인 샘플 이미지를 선택합니다. 여기에 있는 실험의 경우 다음 이미지를 포함합니다.
   0분에서 20분 사이에 촬영한 이미지는 비 NET 형성 호중구에서 생성될 수 있는 미묘한 녹색 신호를 보정하기 위해 녹색 신호 설정을 최적화합니다.
   NET 형성 호중구를 정의하기 위해 녹색 신호 설정을 최적화하기 위해 3-6시간(시간은 사용된 자극에 따라 다름) 사이에 촬영된 양성 대조군의 최대 NET 이미지
   핵 적색 신호가 1시간 시점(모든 세포가 우물 바닥에 가라앉았을 때)에서 가장 강하고 세포 사멸로 인해 점차 감소하기 때문에 총 세포 수(빨간색 염료로 염색됨)를 계산하기 위해 1시간 시점 주위에 촬영한 이미지.
   파편이 포함된 이미지, 집계에서 제외하기 위해.
4. 분석 정의를 설정합니다. 적색 물체와 녹색 물체는 각각 모든 호중구의 핵과 NET을 형성하는 핵에 해당합니다. 다음 예제로 시작하여 현재 미리보기 또는 전체 미리보기를 누르고 각 매개변수를 변조하여 결과를 최적화합니다.
   녹색의 경우: 세분화 - 배경 빼기: Top-Hat; 반경: 100μM; 임계값: 0.3 GCU; 가장자리 분할: 켜기; 가장자리 감도 : -20; 정리 - 구멍 채우기 : 100 μm²; 크기 0 픽셀을 조정하십시오. 필터 면적 : 최소 20 μm², 최대 500 μm²; 편심: 최대 0.97; 평균 강도 : 최소 1.00
   빨간색의 경우: 세분화 - 배경 빼기: Top-Hat; 반경: 10μM; 임계값: 1.0 GCU; 가장자리 분할: 켜기; 가장자리 감도 : -50; 클린업 홀 채우기 : 50 μm²; 크기 0 픽셀을 조정하십시오. 필터 면적 : 최소 20 μm², 최대 400 μm²; 평균 강도: 최소 1.5.
   1. NET을 형성해서는 안 되는 호중구에서 과도한 녹색 신호가 나타나는 경우(예: 소엽 핵이 있는 0분의 자극되지 않은 호중구), 녹색 채널에서 감지된 적색 신호의 오버플로 때문일 수 있습니다. 이 경우 3.1단계로 돌아가 화면 왼쪽의 이미지 레이어 를 열고 스펙트럼 혼합 해제를 사용하여 녹색 채널에서 빨간색 신호를 제거합니다.
   2. 또 다른 옵션은 핵 적색 염료로 단일 염색을 위해 하나의 웰을 설정하여 녹색 채널에서 얼마나 많은 적색 신호를 제거해야 하는지 명확히 하는 것입니다. 반면, 일반적으로 녹색 신호가 빨간색 채널로 흘러도 분석에 영향을 미치지 않습니다.
      알림: 적색 신호에 대한 감도가 낮고 모든 적색 신호가 이후 시점(예: 6시간 시점)에서 촬영된 이미지에 캡처되지 않는 것은 중요하지 않습니다. 각 이미지의 최대 적색 물체 수는 이미지의 총 호중구 수로 간주되며 3.9단계에서 분모로 사용됩니다. 일반적으로 핵 적색 신호는 약 1시간 시점에서 최고조에 달하고 세포 사멸로 인해 점차 감소합니다(그림 1B). 따라서 최대 적색 신호가 있는 영상에서 적색 물체를 올바르게 계산하도록 적색 신호 설정을 조정하십시오.
5. 분석할 스캔 시간과 웰을 선택합니다. 일반적으로 모든 시점과 웰을 분석해야 합니다. 분석 정의에 레이블을 제공합니다.
6. 요약을 확인하고 분석을 시작합니다. 분석을 완료하는 데 몇 시간이 걸립니다(소요 시간은 시점과 우물의 수에 따라 다름). 분석이 실행되면 분석 정의의 이름이 보기 탭의 스터디 이름 아래에 표시되며, 분석이 완료되면 완료 날짜가 표시됩니다.
7. 완료되면 해석 정의의 이름을 두 번 클릭하여 해석된 스터디를 엽니다. 화면 왼쪽에서 레이어 를 열고 각 셀이 올바르게 표시되었는지 확인합니다. 올바르게 표시되지 않은 경우 3.1단계로 돌아가 후속 단계를 반복합니다.
8. 화면 왼쪽의 그래프 메트릭 을 클릭하여 데이터를 내보냅니다. Green Count, Red Count 또는 Overlap Count (Per Image)를 선택한 다음 내보낼 시점과 웰을 선택합니다. 그룹화 선택(Select grouping)의 경우, 스캔이 완료될 때 모든 웰이 올바르게 지정된 경우 플레이트 맵 복제(Plate Map Replicates )를 선택합니다.
9. 데이터를 내보냅니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 다음 방정식으로 각 조건/시점에 대한 NET 형성 셀의 백분율을 계산합니다.
   
   참고: 분모가 최대 적색 물체 수인 이유는 적색 물체의 수가 약 1시간 시점에서 최고조에 달하고 세포 사멸로 인해 점차 감소하기 때문입니다.

이 방법은 각 시점에서 촬영한 위상차, 적색 형광(막 투과성 염료) 및 녹색 형광(막 불투과성 염료) 이미지를 제공합니다. NET 형성 과정과 함께 위상차 및 적색 형광 이미지에서 형태학적 변화가 관찰되며, 막이 뚫리면 녹색 형광을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 이 분석에서 NET 형성 호중구는 일반적으로 거미줄과 같은 구조를 형성하는 대신 둥글다. 이는 기계의 해상도가 미세한 거미줄과 같은 구조와 막이 뚫린 후 방출되기 전에 막 불투과성 녹색 염료 염색질 염색을 캡처할 만큼 충분히 높지 않기 때문입니다. 우리는 이전에 4시간 배양 후 검색된 96웰 플레이트에서 공초점 이미징을 사용하여 NET을 시각화할수 있음을 7 번 보여주었습니다.

분석 정의가 적절하게 설정되면 이미지의 모든 호중구는 빨간색 물체로 표시되고 NET 형성 호중구는 녹색 물체로 표시됩니다(그림 2). 기계는 각 시점에서 빨간색과 녹색 물체의 수를 계산합니다. NET 형성의 시간 경과는 각 시점에서 NET 형성 호중구의 백분율을 표시하여 시각화됩니다(그림 3). NET 형성을 표적으로 하는 잠재적 분자(예: AKT 억제제)는 이 방법론을 사용하여 고처리량 방식으로 테스트할 수 있습니다.

그림 1: NET 형성을 겪고 있는 호중구의 형태학적 변화. (A) 2.5μM 칼슘 이온단으로 3시간 동안 자극된 인간 말초 혈액 호중구. (B) 위상차 이미지, 적색 채널(막 투과성 핵 염료), 녹색 채널(막 불투과성 DNA 염료) 및 병합 이미지의 대표적인 단일 세포 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 호중구와 NET의 소프트웨어 인식을 보여주는 대표 이미지. 인간의 건강한 지원자로부터 얻은 호중구를 2.5μM 칼슘 이온단으로 1시간 동안 자극하였다. 위상차 이미징과 각 신호 또는 마스크의 오버레이된 이미지가 표시됩니다. 핵은 (A) 막 투과성 적색 염료로 염색되었고, 소프트웨어는 (B) 핵을 인식하고 계수했으며, NET은 (C) 막 불투과성 녹색 염료로 염색하고 소프트웨어는 (D) 보라색으로 표시했습니다. (E) 과잉 감지 또는 (F) 과소 감지가 발생하면 매개변수를 변경해야 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: NET-forming 호중구 비율의 시간 경과. 호중구는 25nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) 또는 2.5μM 칼슘 이온단에 의해 자극되어 NET을 유도하거나 RPMI에서 자극하지 않은 상태로 두었습니다. NET 형성을 차단하기 위해 30μM AKT 억제제를 첨가하였다. 이미지는 6시간 동안 20분마다 소프트웨어에 의해 획득되었습니다. NET-형성 세포의 백분율은 녹색 물체 수(= NET-형성 세포의 수)를 적색 물체 수(= 모든 호중구의 수)로 나누어 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 재정적 이익 경쟁이 없습니다.