방법 논문

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

DOI:

10.3791/66051

⸱

2023년 12월 1일

 ,  , 
1Systemic Autoimmunity Branch, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH)

이 논문에서

요약

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당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

초록

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호중구는 선천성 면역 체계의 중요한 부분을 형성하는 골수성 계통 세포입니다. 지난 10년 동안 호중구는 항균 방어에 중요한 구조인 호중구 세포외 트랩(NET)의 형성을 포함한 여러 메커니즘을 통해 면역 조절 장애의 시작 및 영속에 기여함으로써 암, 자가면역 질환 및 다양한 급성 및 만성 염증 상태의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 편향되지 않고 재현 가능하며 효율적인 방식으로 NET 형성을 정량화하는 기술의 한계로 인해 건강과 질병에서 호중구의 역할을 더 깊이 이해할 수 있는 능력이 제한되었습니다. 세포 내 및 세포 외 DNA를 이미지화하기 위해 두 가지 다른 DNA 염료를 사용하는 막 투과성 의존적 이중 염료 접근 방식과 결합된 살아있는 세포 이미징 플랫폼을 사용하여 NET 형성을 진행 중인 호중구를 정량화하는 자동화된 실시간 고처리량 방법을 설명합니다. 이 방법론은 호중구 생리학을 평가하고 NET 형성을 표적으로 할 수 있는 분자를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

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호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 염증 자극에 반응하여 호중구에서 압출된 거미줄 모양의 염색질 구조입니다. NET은 DNA, 히스톤 및 다양한 항균 단백질/펩타이드로 구성되어 감염성 병원체를 포획하여 죽이고 염증 반응을 유발합니다1.

NET은 병원균에 대한 숙주 방어에 도움이 되지만, 다양한 자가면역질환2, 혈전증3, 대사질환4, 암5의 전이성 성장의 잠재적 동인으로 주목받고 있다. 따라서 NET 형성 억제는 이러한 질병에 대한 잠재적인 치료 옵션입니다. 그러나, 개발6에서 일부 유망한 NETs-표적 분자에도 불구하고, 이 메커니즘에 특이적으로 영향을 미치는 승인된 치료법은 아직 없다. 이는 적어도 부분적으로는 NET 형성을 위한 객관적이고, 편향되지 않고, 재현 가능하고, 처리량이 많은 정량화 방법이 부족하기 때문입니다.

우리는 이중 색상 라이브 셀 이미징 플랫폼 7,8

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프로토콜

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건강한 인간 피험자의 호중구는 미국 국립보건원(NIH)의 임상시험계획위원회(IRB) 승인 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의가 제공된 후 획득되었습니다. 이 프로토콜은 NIH 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 호중구의 염색 및 분석판의 준비

  1. 각 기관의 지침에 따라 적절한 서면 동의서와 함께 말초 혈액을 채취하고 원하는 방법을 사용하여 호중구를 분리합니다. 예를 들어, 피콜-덱스트란 방법(10,11)은 인간 말초 혈액으로부터 호중구를 분리하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이다.
    참고: 여기서 논의된 방법은 인간 호중구를 사용하지만 마우스 호중구도 유사한 프로토콜을 사용하여 분석할 수 있습니다.
  2. Roswell Park Memorial Institute(RPMI, 재료 표 참조) 1640 배지에서 2.0 x 106 호중구/mL로 호중구를 재현탁시키고 호중구 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
    참고: FBS의 알부민은 NET 형성12 을 감소시킬 수 있고....

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결과

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이 방법은 각 시점에서 촬영한 위상차, 적색 형광(막 투과성 염료) 및 녹색 형광(막 불투과성 염료) 이미지를 제공합니다. NET 형성 과정과 함께 위상차 및 적색 형광 이미지에서 형태학적 변화가 관찰되며, 막이 뚫리면 녹색 형광을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 이 분석에서 NET 형성 호중구는 일반적으로 거미줄과 같은 구조를 형성하는 대신 둥글다. 이는 기계의 해상도가 미세한 거미줄과 같은 구조와 막이 뚫린 후 방출되기 전에 막 불투과성 녹색 염료 염색질 염색을 캡처할 만큼 충분히 높지 않기 때문입니다. 우리는 이전에 4시간 배양 후 검색된 96웰 플레이트에서 공초점 이미징을 사용하여 NET을 시각화할수 있음을 7 번 보여주었습니다.

분석 정의가 적절하게 설정되면 이미지의 모든 호중구는 빨간색 물체로 표시되고 NET 형성 호중구는 녹색 물체로 표시됩니다(

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토론

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NET을 생체 외(ex vivo)로 정량화하는 현재의 방법에는 호중구, NET 및 잠재적 치료 표적을 편향되지 않은 고처리량 방식으로 연구하는 능력을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다10,14. 예를 들어, NET의 정량화를 위한 황금 표준으로 간주되는 면역형광 염색 후 NET-형성 세포의 직접 계수는 처리량이 낮고 작업자의 주관적인 관점에 따라 달라집니다. 막불투과성 DNA 염료의 형광을 검출하는 플레이트 분석은 NET의 대리 마커로서 세포 외 DNA를 객관적이고 높은 처리량 방식으로 정량화하지만, 이 방법으로 형태학적 정보를 얻을 수 없기 때문에 다른 유형의 세포 사멸에 의한 DNA 방출은 NET으로 잘못 간주될 수 있습니다. 반면에 이 방법은 NETs7의 높은 처리량과 객관적인 정량화를 제공합니다. 호중구의 형태학적 변화와 시간 경과에 대한 정보를 얻을 수 있다.......

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공개 사항

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저자는 재정적 이익 경쟁이 없습니다.

감사의 글

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미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 과학 기술 사무소(Office of Science and Technology)의 광 이미징 부서(Light Imaging Section)에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, ZIA AR041199)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AKT 억제제Calbiochem124028
Clear 96-well plateCorning3596
Live cell analysis systemSartoriusN/AIncucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye Thermo Fisher ScientificS7020
핵 적색 염료EnzoENZ-52406호중구 펠릿은 염색 후 푸르스름하게 변합니다.
RPMIThermo Fisher Scientific11835030Phenol red containig RPMI를 사용할 수 있습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288....

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