관절 내 주입 후 노화된 Dunkin-Hartley 기니피그의 무릎에 대한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석

요약

Dunkin-Hartley 기니피그는 골관절염 연구를 위한 확립된 동물 모델입니다. 이러한 연구는 새로운 약제를 조사하거나 질병을 치료하는 등 다양한 이유로 관절 내 주사의 이점을 얻을 수 있습니다. 기니피그에서 관절 내 무릎 주사를 위한 방법론과 관절염 관련 무릎 변화를 평가하는 후속 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석을 설명합니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 연구자들이 기니피그에서 관절 내 무릎 주사의 촉진 유도 기술을 수행하고 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 평가하도록 안내하는 것입니다. Dunkin-Hartley 기니피그는 무릎에 자발적으로 골관절염이 발생하기 때문에 골관절염 연구를 위한 강력한 모델입니다. 관절 내 약물 전달은 in vivo 임상시험용 약물의 효과를 연구하는 일반적인 방법입니다. 인간의 경우, 관절 내 주사를 통해 투여하는 치료제는 통증을 완화하고 골관절염의 추가 진행을 지연시킬 수 있습니다. 다른 종과 마찬가지로 관절 공간에 바늘을 삽입하면 부상을 입을 가능성이 있으며, 이로 인해 통증, 절름발이 또는 감염이 발생할 수 있습니다. 이러한 부작용은 동물 복지를 저해하고, 연구 결과를 혼란스럽게 하며, 연구 목표를 달성하기 위해 추가 동물을 필요로 할 수 있습니다. 따라서 합병증을 예방하기 위해 적절한 주입 기술을 개발하는 것이 필수적이며, 특히 여러 번의 반복적인 관절 내 주사가 필요한 종단 연구에서는 더욱 그렇습니다. 제시된 방법을 사용하여 5마리의 기니피그는 전신 마취 하에 양측 무릎 주사를 받았습니다. 주사 7일 후, 골관절염의 중증도를 분석하기 위해 동물을 인도적으로 안락사시켰다. 마취 또는 무릎 주사 후 절뚝거림, 통증 또는 감염을 포함한 부작용이 발생하지 않았습니다. 무릎의 X선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석은 골관절염과 관련된 병리학적 변화를 감지할 수 있습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 데이터에 따르면 골관절염은 나이가 들면서 골밀도와 섬유주 두께가 증가하는 것으로 나타난 동물에서 더 심각합니다. 이러한 결과는 조직학적 변화 및 Modified Mankin 점수와 일치하며, 이는 동일한 동물에서 관절염 중증도를 평가하기 위해 확립되고 널리 사용되는 점수 시스템입니다. 이 프로토콜은 기니피그에서 관절 내 주사를 정제하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

골관절염(OA)은 3,250만 명의 미국 성인에게 영향을 미칩니다. 관절 연골의 점진적인 손실, 관절 안팎의 경미한 염증, 골종(osteophytes) 및 뼈 낭종(bone cysts)의 형성에 의해 발생한다 ^1,2. 증상은 일반적으로 질병의 말기에 나타나며, 현재의 치료법은 완화적 완화만 제공할 뿐 아니라 전신 부작용도 있습니다. 질병 변형 약물의 부족은 질병의 근본적인 메커니즘에 대한 이해가 부족하기 때문에 발생한다³. 그 결과, 골관절염을 치료하기 위해 개선된 약제에 대한 중요하고 지속적인 의학적 필요성이 있습니다.

골캉염의 여러 동물 모델을 통해 질병 과정의 다양한 구성 요소를 검사할 수 있다⁴. 전방십자인대의 절제술과 내측 반월상 연골의 불안정화를 포함한 여러 수술 모델이 존재하지만, 이는 침습적이며 높은 수준의 기술적 기술을 필요로 한다⁵. 화학적으로 유도된 모델은 골관절염 통증 기전을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 비교적 덜 침습적인 시술이다⁶. 이러한 널리 사용되는 마우스 모델 중 하나는 요오드화나트륨(MIA)의 관절 내 무릎 주사에 의한 OA 유도와 관련이 있습니다. 이 모델은 MIA 투여량을 변경하여 등급을 매길 수 있는 재현 가능하고 견고하며 빠른 통증과 유사한 표현형을 생성합니다⁷. 이 모델을 유도하는 기술적 세부사항은 이전에 설명되었다⁷. 이 기술을 기니피그와 같은 더 큰 설치류로 번역하는 것은 해부학적 차이로 인해 어렵습니다. 몇 가지 차이점으로는 기니피그에서 인접한 뼈와 관절 공간을 둘러싼 근육 조직이 증가하고, 생쥐⁸에서 볼 수 있는 원위 유합술과 비교하여 관절 비골과 경골이 증가한다는 것이 포함된다. 널리 사용 가능한 기니피그 균주인 Dunkin-Hartley 기니피그는 자연적으로 이 질병이 발병하기 때문에 확립된 OA 동물 모델이며, 따라서 관절 내 주사로 투여되는 새로운 치료제가 질병 진행에 미치는 영향을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공한다⁹. Dunkin-Hartley 기니피그는 생후 3개월에 골관절염이 발병하기 시작하며, 수컷은 발육이 가속화되고 표현형이 더 심하다¹⁰. 기니피그에서 골관절염은 나이가 들면서 진행되며, 12개월이 되면 영상에서 관련 병리가 뚜렷하게 나타난다¹¹. Dunkin-Hartley 모델과 같은 자발적 골관절염 모델은 골관절염을 유도하기 위한 개입이 필요하지 않으므로 인간에서 질병 표현형의 발달 및 진행을 요약하여 강력한 번역 모델^{(translational model)10}을 제공한다. 더욱이, 골관절염의 자발적인 발달은 새로운 치료법이 주어진 동물의 한쪽 무릎에 일방적으로 투여될 때 내부 통제를 가능하게 합니다. 이러한 내부 통제는 데이터를 분석할 때 동물 간 변동성의 영향을 최소화하고 전체 동물 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

X선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 분석은 골관절염 중증도¹²를 정량적으로 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. μCT는 회전 샘플 또는 회전 X선 소스 및 검출기(¹³)에서 얻은 여러 고해상도 X선 이미지를 스캔하는 것을 포함합니다. 그런 다음, 3차원(3D) 체적 데이터는 적층된 이미지 슬라이스(¹⁴)의 형태로 재구성된다. 광물화된 뼈는 μCT에서 우수한 대비를 갖기 때문에 이 양식은 3D 특징을 평가하고 OA^15,16,17과 관련된 변화에 대한 정량 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. μCT는 조직 병리학 및 보행 분석을 포함하여 널리 사용되는 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 조직의 한 부분 또는 몇 개의 조직학적 평가와 달리, μCT는 전체 관절을 스캔하고 골관절염 병변에 대한 보다 전체적인 평가를 제공한다¹⁸. 보행 분석은 시간이 지남에 따라 관절 기능의 증상적 변화를 식별할 수 있지만, 관절 변화는 골관절염과 관련된 기능적 변화보다 훨씬 전에 발생합니다. μCT는 파행이 시작되기 전에 골관절염 발병에 대한 보다 민감한 측정을 제공할 수 있습니다. 특히 관련성이 높은 두 가지 정량적 측정에는 골밀도와 섬유주 두께가 포함되며, 둘 다 OA^19,20의 진행에 따라 증가합니다. 분석을 연골하판(subchondral plate)과 섬유주골(trabecular bone)로 나누는 것이 도움이 될 수 있는데, 이들은 서로 다른 특징을 가지고 있기 때문에 보다 강력한 측정 및 비교를 달성하기 위해 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 연구자들이 기니피그에서 관절 내 주사를 성공적으로 수행할 수 있도록 돕는 것입니다. 제시된 프로토콜은 5개월된 온전한 수컷 Dunkin-Hartley 기니피그를 사용했습니다. 시술은 관절 내 무릎 주사가 필요한 다른 기니피그 균주 및 연령으로 추정할 수 있습니다. Dunkin-Hartley 모델과 같은 골관절염의 자발적 모델에서는 질병 진행 및 연속적인 치료에 대한 반응이 종종 몇 주에서 몇 개월에 이르는 장기간에 걸쳐 모니터링됩니다⁹. 이 확장된 프로토콜은 여러 관절 내 주사를 초래하므로 통증, 절뚝거림 또는 감염을 포함한 부작용을 예방하기 위해 적절한 주입 기술을 갖추는 것이 중요하며, 이 모든 것은 동물 복지에 영향을 미치고 연구 결과를 혼란스럽게 할 수 있으며 연구에 추가 동물이 필요할 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 기니피그에서 관절 내 주사의 방법론과 μCT 데이터의 후속 분석을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 사우스캐롤라이나 의과대학의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 연구는 3R의 원칙을 따랐습니다.

1. 관절 내 주사 제제

1. Dunkin-Hartley 기니피그가 실험을 시작하기 최소 일주일 전에 시설에 적응하도록 합니다.
   참고: 5-(n=2), 9-(n=1) 및 12-(n=2) 개월 된 수컷 기니피그가 사용되었습니다. 남성은 OA의 발달이 가속화되고 더 심각한 표현형을 보입니다.
2. 전기 면도기로 무릎 부분을 면도하십시오.
   알림: 젖꼭지를 내측으로 조심하십시오.
3. _O2 혼합물(유속 2.5L/min)에 3-5% 이소플루란을 전달하는 이소플루란 챔버에서 기니피그를 마취한 다음 기니피그를 비호흡 마취 회로에 연결된 노즈콘으로 옮깁니다. 일반적으로 0.5-1 L/min 및 1-3% 이소플루란의 산소 유속으로 주사 중 수술 마취면을 유지하기 위해 이소플루란을 조정합니다.
   참고: 관절 내 주사는 경미하고 일시적인 통증을 유발합니다. 고통스러운 자극에 대한 인식을 방지하고 주입 정확도를 향상시키기 위해 시술 중에 동물을 마취합니다. 제시된 연구에서 비스테로이드성 항염증제를 포함한 진통제의 투여는 골관절염 진행을 방해할 수 있다²¹. 순간적인 통증, 마취 및 진통제가 모델을 혼란스럽게 할 가능성이 있기 때문에 동물이 주사 후 절뚝거림과 관절 촉진 시 통증 징후를 포함한 부작용을 보이지 않는 한 진통제를 투여하지 않았습니다. 조사관은 일상적인 주사에 진통제의 사용을 고려해야 합니다. 진통제는 부작용이 발생했을 때 권장됩니다. 진통제 요법은 연구를 시작하기 전에 기관 수의사와 논의하고 IACUC의 승인을 받아야 합니다.
4. 기니피그가 발가락 꼬집음 반응이 없어 적절한 마취 깊이에 있는지 확인하십시오.
5. 건조와 부상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 멸균 안구 윤활제를 바릅니다.
6. 베타딘을 멸균수로 10%로 희석합니다.
7. 200 프루프 에탄올을 멸균수로 70% 에탄올로 희석합니다.
8. 멸균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 주입할 용액을 준비합니다. 제시된 프로토콜에서는 멸균 차량(1x 인산염 완충 식염수)을 사용하여 양쪽 무릎을 주입했습니다. 솔루션은 연구 목표에 따라 변경될 수 있습니다.
   알림: 멸균을 보장하기 위해 주입 세션 직전에 주입을 위해 새 용액을 희석해야 합니다. 사용하지 않는 용액은 각 주입 세션이 끝날 때 폐기해야 합니다.
9. 멸균 일회용 인슐린 주사기에 주입용 용액을 채웁니다. 조인트 공간에 볼륨이 과도하게 쌓이지 않도록 달성할 수 있는 가장 작은 볼륨을 활용하도록 주의하십시오. 본 연구에서는 50μL를 사용하였다.
10. 기니피그와 노즈콘을 열 지지용 가열 패드가 있는 깨끗한 표면에 놓고 머리 아래에 패딩을 넣어 약간 들어 올립니다.
11. 수술 가운, 헤어 네트, 멸균 장갑 및 마스크를 착용하고 주사 절차를 수행합니다.
12. 면봉에 베타딘 10%를 붓고 양쪽 무릎 부위를 닦아냅니다.
13. 면봉에 70% 에탄올을 붓고 양쪽 무릎 부분을 닦습니다.
14. 1.12와 1.13을 두 번 더 반복합니다.
    참고: 데모를 위해 해당 비디오는 10% 베타딘과 70% 에탄올로 무릎과 주사 부위를 한 번 청소하는 것을 보여줍니다. 주입 부위는 이후 원형 운동을 두 번 더 사용하여 이러한 용액을 번갈아 가며 청소했습니다. 무균 기술을 달성하기 위해 스크럽 용액과 알코올을 번갈아 사용하는 3번의 연속 스크럽이 권장됩니다.

2. 관절 내 주사

1. 절차 전체를 위해 기니피그를 누운 자세로 놓습니다.
2. 새 멸균 장갑을 착용하고 무릎 관절을 촉진합니다.
   참고: 제시된 프로토콜 및 비디오에서는 오토클레이브 니트릴 장갑이 사용되었습니다. 고압멸균 니트릴 장갑 또는 수술용 장갑을 포함한 멸균 장갑은 무균 기술에 사용해야 합니다.
3. 수동으로 무릎을 90°로 구부립니다.
4. 손가락을 슬개골 원위부로 이동하여 뒷다리를 구부리고 펴서 관절 공간의 원위부 측면의 홈을 찾습니다.
   참고: 슬개골은 이 위치에서 관절 공간 바로 위에 위치한 작고 단단한 구조로 촉진될 수 있습니다. 경골은 슬개골 원위부에 있는 뼈 구조로 느낄 수 있습니다. 경골과 슬개골의 위치가 결정되면 홈으로 느껴지는 관절은 그 사이에 있으며 슬개골의 원위부와 경골의 근위부에 있습니다.
5. 인슐린 바늘을 관절 공간 내 슬개골 원위부의 정중선에 조심스럽게 삽입합니다. 바늘은 관절 공간으로 들어가기 위해 피부 아래 1-2mm에 삽입해야 합니다.
   참고: 무릎을 구부린 상태에서 관절 공간을 위한 가장 큰 접근 창은 슬개골 바로 원위인 정중선에서 사지의 전방에 있습니다. 전방에서 후방 방향으로 정중선에 주입하면 뼈 구조를 관통하지 않고 관절 공간에 정확하게 주입하는 데 도움이 됩니다. 관절 공간에 정확하게 주입하는 것은 외측에서 내측으로의 접근 방식을 사용하여 달성할 수 있지만 특히 무릎을 구부릴 때 접근 창이 더 좁습니다.
6. 용액 50μL를 관절에 천천히 주입합니다. 바늘이 쉽게 삽입되고 내용물이 저항 없이 주입되는지 확인하십시오.
   알림: 관절이나 뼈 손상을 일으키고 원치 않는 염증 및/또는 통증을 유발할 수 있으므로 바늘을 너무 깊게 삽입하지 마십시오. 관절 공간에 해당하는 홈이 발견되지 않으면 바늘이 대퇴골, 슬개골 또는 경골을 관통할 수 있습니다. 따라서 관절 공간에 해당하는 홈을 자신 있게 촉진하여 관절 주위 주사 또는 뼈 구조를 관통하는 것과 관련된 부상을 예방하는 것이 좋습니다. 피하의 주사 부위에 기포가 생기면 주입이 너무 얕아 액체가 피하 공간에 들어가 버린 것입니다. 사용된 약제의 특성에 따라 약물이 확산을 통해 관절 공간으로 들어가거나 다른 주입 시도가 필요할 수 있습니다.
7. 완료되면 바늘을 날카로운 물건 통에 버리십시오.
   참고: 연습 및 훈련 목적으로 염료가 포함된 액체를 비슷한 크기의 설치류 또는 기니피그에서 사체의 관절 공간에 주입하십시오. 그런 다음 관절을 절개하여 주입 위치를 확인합니다.
8. 관절을 몇 번 구부리고 펴서 무릎을 마사지하면 관절 공간 내에서 약물의 확산을 촉진합니다.
9. 2.1x PBS 용액으로 반대쪽 사지에 2.5-1단계를 한 번 반복합니다.

3. 관절 내 주사로부터의 회복

1. 이소플루란을 끄고 동물이 의식을 회복할 때까지 산소로 100% 흐름을 유지하십시오.
2. 보행할 때까지 열 지원을 위해 동물을 가열 패드에 놓습니다.
3. 종이 타월을 장벽으로 삼아 무릎에 얼음 팩을 30초 동안 바르면 주사로 인한 붓기를 줄이는 데 도움이 됩니다.
4. 동물을 주거로 돌려보내기 전에 보행 시 동물의 걸음걸이를 평가하십시오.
   알림: 보행 이상이 발견되면 진통제와 지지 치료가 필요할 수 있습니다. 정상적인 움직임을 보장하기 위해 마취에서 회복된 후 몇 시간 후에 걸음걸이를 다시 평가하는 것이 좋습니다.

4. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캔

1. 조직 채취를 위해 100% 산소와 5% 이소플루란 혼합물로 수술 평면을 설정합니다.
2. 발가락 꼬집기 자극에 대한 반응이 없는 수술 마취면을 확인합니다. 기관 정책 및 승인된 동물 사용 프로토콜에 따라 ≥ 150mg/kg의 펜토바르비탈을 정맥 투여 하여 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
   참고: 제시된 프로토콜에서 5마리의 기니피그는 각각 양쪽 무릎에 한 번씩 주사를 맞았습니다. 동물들은 주사 일주일 후에 마취시키고 인도적으로 안락사시켰다.
3. 주변 근육에서 피부를 절개하여 양쪽 뒷다리를 채취합니다.
4. 다음으로, 대퇴골의 중간 축과 발목 근위부에서 Rongeurs로 뒷다리를 분리합니다.
   참고: 사용된 스캐닝 베드와 표본 홀더는 성인 기니피그의 뒷다리 전체를 수용할 수 없었습니다. 대형 시편 홀더는 더 큰 시편 크기에 대해 상업적으로 사용할 수 있습니다.
5. μCT를 수행하기 전에 고정을 위해 조직을 중성 완충 포르말린 용액에 72시간 동안 놓습니다.
6. μCT 스캔 소프트웨어를 열고 포르말린이 함유된 샘플을 μCT 표본 폴더에 맞는 호환 가능한 용기에 넣으면서 시야에서 조직을 유지합니다.
7. 제조업체 권장 사항에 따라 암시야 및 라이트 필드 노출에 대해 μCT 기계를 보정합니다.
8. 18μm에서 Al+Cu 필터로 샘플을 스캔합니다. 오프셋 카메라로 360°를 위해 0.7° 회전 단계를 사용합니다.
   참고: 스캔이 자동으로 저장됩니다.

5. 뼈 미세건축 매개변수를 평가하기 위한 이미지 처리

1. μCT 이미지 재구성을 위한 μCT 재구성 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다.
2. 소프트웨어 폴더를 선택하고 두 번 클릭하여 소프트웨어를 엽니다.
3. 이미지 슬라이스를 클릭하여 μCT 이미지에서 하나의 슬라이스를 선택합니다.
4. 재구성 파일 대상을 선택합니다. 찾아보기를 선택하고 Recon이라는 새 폴더를 만듭니다. 선택한 파일 형식은 BMP(8)여야 합니다.
5. 정렬 불량 보정을 확인합니다.
   참고: 일반적으로 추정치는 정확에 가깝지만 오른쪽 및 왼쪽 가장자리가 가능한 한 가깝게 정렬되도록 겹치는 이미지를 이동하도록 수동으로 조정할 수 있습니다.
6. Settings(설정)에서 Smoothing(스무딩), Beam Hardening(빔 강화), CS Rotation(CS 회전) 및 Ring Artifacts(링 아티팩트) 알고리즘을 적용합니다.
   참고: 재구성하기 전에 선명도를 결정하기 위해 미리보기 이미지를 선택하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 미세 조정 설정은 어떤 설정이 가장 적합한지 결정하는 데도 도움이 될 수 있습니다.
7. 시작을 선택하여 재구성 처리를 시작합니다.

6. 복원된 이미지에서 마이크로아키텍처 데이터 수집

1. Dataviewer를 다운로드하여 설치합니다.
2. VOI를 선택하고 나중에 더 쉽게 분석할 수 있도록 시료를 수직으로 정렬하도록 방향을 지정합니다.
3. 편집한 VOI를 새 폴더로 저장합니다.
4. 마이크로아키텍처 매개변수의 골 특성 분석을 위해 CTAnalyser를 다운로드하여 설치하십시오.
   참고: CTAnalyser의 무료 버전은 기능이 제한되어 있으므로 정식 라이선스를 취득하는 것이 좋습니다.
5. subchondral plate와 trabecular bone을 별도의 이미지 범위로 저장하여 분석을 분할합니다.
   참고: 분석을 분할할 필요는 없지만, 연골하판과 섬유주골은 서로 다른 특징을 가지고 있기 때문에 별도의 분석이 강력한 측정 및 비교에 도움이 될 수 있습니다.
6. 시작하려는 이미지 슬라이스를 클릭하여 subchondral plate부터 시작하여 분석할 이미지 범위를 선택합니다.
7. 각 이미지의 관심 영역을 선택하여 관심 영역 탭을 클릭하여 뼈를 둘러싸고 있는지 확인합니다.
8. 바이너리 선택 탭을 선택합니다. 배경과 뼈가 완전히 분리되도록 히스토그램을 조정합니다.
9. Bone Mineral Density (BMD)(골밀도(BMD)) 탭을 선택합니다. 해당 데이터를 새 해석 데이터 폴더에 저장합니다.
10. Custom Processing(사용자 지정 처리)을 선택하고 Internal 탭으로 이동합니다.
11. 먼저 임계값 설정을 수행하고 Automatic Otsu를 선택한 다음 Run을 선택합니다.
12. 그런 다음 Despeckle을 선택하고 Remove black speckles(블랙 스페클 제거)를 선택한 다음 Run(실행)을 선택합니다.
13. Despeckle(반점 제거)을 반복하고 Remove white speckles(흰색 반점 제거)를 선택한 다음 Run(실행)을 선택합니다.
14. 3D 분석을 선택하고 기본 값과 추가 값을 선택합니다.
15. 6.2.2-6.4.5단계를 반복하여 섬유주 뼈 분석을 위해 이미지를 재설정합니다.
    참고: 출력 파일이 BMD 데이터와 동일한 파일의 새 폴더에 있는지 확인합니다.

결과

살아있는 동물에게 관절 내 주사를 수행하기 전에, 정확한 주입 위치를 보장하기 위해 3개의 쥐 사체에 대해 위의 프로토콜을 실행했습니다. 연습 세션 동안, 위에서 설명한 방법론을 사용하여 50μL의 70% 새로운 메틸렌 블루 염료를 양쪽 무릎 관절에 주입했습니다. 이는 6번의 연습 주사에 해당합니다. 주사 후 무릎 관절을 절개하여 관절 공간의 두개골 측면, 슬개골 원위부, 슬개골 인대를 통해 절개하여 관절 공간을 시각화하고 염료 침착 위치를 확인했습니다. 새로운 메틸렌 블루 염료는 밝은 파란색 용액이기 때문에 염료 증착의 위치를 전체적으로 시각화할 수 있습니다. 사체 주입의 대표적인 이미지가 그림 1에 포함되어 있습니다. 그림 1A는 접합 공간 내에 염료가 존재함을 보여주며, 이는 정확한 주입 위치와 기술을 나타냅니다. 이 연습 세션 동안 무릎 관절은 6번의 시도 모두에서 성공적으로 주입되었습니다(100% 성공률). 시연을 위해 잘못된 사출 주입점의 예가 그림 1B-C에 포함되어 있습니다. 피하 공간에 주사를 투여하면 그림 1B에서 볼 수 있듯이 체액이 축적되어 피부 아래에 잡티가 생깁니다. 관절 공간이 주입되지 않으면 그림 1C에서 볼 수 있듯이 무릎 관절 내에 염료가 존재하지 않습니다.

5마리의 기니피그 각각은 주사 타당성을 보장하고 연령 관련 OA 변화에 대한 후속 μCT 분석을 보장하기 위한 파일럿 실험의 일환으로 1x 인산염 완충 식염수를 사용한 단일 양측 무릎 주사 절차를 받았습니다. 동물은 전반적인 건강 및 부작용에 대한 절차에 따라 하루에 한 번 이상 육안으로 평가되었습니다. 이들 동물 중 통증, 절름발이 또는 감염을 포함한 주사와 관련된 부작용을 경험한 동물은 하나도 없었다(0%). 주사 후 7일 후, 동물을 수술용 마취 비행기 아래에 놓고 무릎 적출 및 후속 μCT 분석을 위해 인도적으로 안락사시켰습니다.

이전에 발표된 바와 같이, μCT 분석은 시간 경과에 따른 OA 중증도와 관련된 정량적 변화를 측정하는 기능을 포함하여 기니피그의 무릎 변화를 평가하는 데 활용될 수 있습니다 ^22,23. 제시된 연구에서는 μCT를 활용하여 다양한 연령의 기니피그에서 OA 변화를 확인했습니다. 이러한 결과는 골관절염 진행을 지연시키기 위한 새로운 치료법을 평가하는 향후 연구를 위한 기준 데이터로 사용할 수 있습니다. 위에서 설명한 방법론을 사용하면 향후 연구에서 μCT 분석을 표준화할 수 있습니다. 연골하판(subchondral plate, 그림 2A)과 섬유주골(trabecular bone, 그림 2B)은 뼈의 특성이 크게 다릅니다. 따라서 이러한 영역은 주입 후 1주일 후에 보다 강력한 결과를 얻기 위해 개별적으로 분석됩니다.

골밀도(BMD)는 생후 12개월 된 기니피그가 5개월 및 9개월 된 기니피그에 비해 더 높습니다(그림 3). 12세, 9개월, 5개월 된 기니피그에서 평균 연골하판 BMD는 각각 0.898 g/^cm3, 0.952 g/^cm3, 0.588 g/^cm3이었다. 이는 12개월 된 기니피그의 연골하 BMD가 5개월 된 기니피그에 비해 1.53배 증가했음을 보여줍니다. 12개월령, 9개월령, 5개월령 기니피그에서 평균 섬유주 뼈 골밀도는 각각 0.825 g/^cm3, 0.839 g/cm3, 0.427 g/^cm3 이었다. 이는 12개월 된 기니피그의 섬유주 BMD가 5개월 된 기니피그에 비해 1.93배 증가한 것입니다. 전반적으로 Dunkin-Hartley 기니피그는 생후 5개월에서 12개월로 나이가 들면서 BMD가 증가합니다(그림 3).

또한 다양한 연령의 기니피그 간에 섬유주 두께에 차이가 있었다 (그림 4). 평균 섬유주 두께의 경우 12개월령(0.558mm)이 9개월령(0.403mm)에 비해 1.38배 증가하고, 5개월령(0.225mm)에 비해 12개월령(0.558mm)이 2.48배 증가한다. 따라서 Dunkin-Hartley 기니피그에서 5개월에서 12개월까지 나이가 들면서 섬유주 두께의 평균이 증가합니다.

2D에서 OA 변화를 평가하기 위해 검증되고 널리 사용되는 방법인 조직학적 변화 및 변형된 Makin 점수는 μCT 결과를 뒷받침합니다(그림 5). 변형된 Mankin 점수는 기니피그가 나이가 들면서 증가했습니다(그림 5A). 조직학적으로 프로테오글리칸 손실, 저세포성 및 균열을 포함한 골관절염의 징후는 기니피그가 생후 5개월에서 12개월로 나이가 들면서 유병률이 증가합니다(그림 5B-D).

그림 1: 올바른 사출 주입점과 잘못된 사출 주입점의 대표 이미지. (A) 관절 공간 내에 새로운 메틸렌 블루 염료가 있는 쥐 무릎을 절개했습니다. 참고를 위해 무릎 왼쪽에 스케일이 포함되어 있습니다. (B) 무릎이 얕은 주사를 보여 피하 공간에 기미가 형성됩니다. (C) 패널 B의 무릎을 절개하여 관절 공간 내에 새로운 메틸렌 블루 염료가 없음을 확인했습니다. 참고를 위해 무릎 오른쪽에 스케일이 포함되어 있습니다. 모든 이미지에서 두개골은 이미지의 맨 위에 있고 꼬리는 맨 아래에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 연골하판(subchondral plate)과 섬유주(trabecular bone) 측정 필드에 대한 세분화. 연골하판(subchondral plate)은 섬유주골(trabecular bone)과 다른 성질을 가지고 있습니다. 이러한 영역을 개별적으로 분석하면 OA 진행 과정 전반에 걸쳐 서로 다른 지역 간의 비교가 가능합니다. 영역 A(빨간색)는 분석에 사용된 연골하판 세그먼트 영역에 대한 코로나 보기를 나타냅니다. 지역 B(녹색)는 분석에 사용되는 섬유주 뼈 세그먼트에 대한 관상 보기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 노화된 Dunkin-Hartley 기니피그의 골 미네랄 밀도 변화. 골밀도(BMD)는 생후 5개월(n=2), 9개월(n=1) 및 12개월(n=2)에 기니피그에서 평가되었습니다. 측정은 두 가지 다른 측정을 위해 연골하판과 섬유주골에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 노화된 Dunkin-Hartley 기니피그의 섬유주 두께 변화. 섬유주 두께 측정은 5개월령(n=2), 9(n=1) 및 12개월(n=2)령 기니피그에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: Dunkin-Hartley 기니피그의 OA 변화에 대한 조직학 분석. (A) 5-(n=2), 9-(n=1) 및 12-(n=2) 생후 기니피그의 조직학적 샘플에 대한 수정된 Mankin 점수. Modified Mankin 점수는 연골 구조, 세포성, 조수 표시 및 골식물 형성의 개별 점수를 합산하여 계산되었습니다. (B) 5개월 된 기니피그의 톨루이딘 블루로 염색된 대표적인 조직학 이미지. (C) 9개월 된 기니피그의 톨루이딘 블루로 염색된 대표적인 조직학 이미지. 검은색 *= 프로테오글리칸 손실. D. 12개월 된 기니피그의 톨루이딘 블루로 염색된 대표적인 조직학 이미지. 검정 * = 균열; 백색 *= hypocellularity. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

골관절염의 증상적 치료의 최근 발전에도 불구하고, 골관절염²⁴의 발병을 예방하거나 진행을 지연시키는 치료제는 완전히 부족하다. 현재 중증 골관절염의 유일한 치료법은 관절 치환술인데, 이는 비용이 많이 들고 침습적이며 환자의 이환율과 사망률을 초래할 수 있다²⁵. 그 결과, 골관절염 동물모델에 대한 지속적인 연구와 새로운 치료제의 지속적인 개발이 절실히 필요합니다. 골관절염의 다양한 구성 요소를 연구하기 위해 여러 동물 모델을 사용할 수 있으며, 여기에는 자발적 및 화학적 또는 외과적 유도 모델이 포함됩니다. MIA 마우스 모델에서와 같이 화학물질의 주입은 통증을 연구하는 데 필수적이지만, 연구자가 골관절염 발병의 진행을 추적하고 질병이 진행되는 동안 원하는 시점에 개입할 수 없도록 한다²⁶. 외과적 방법은 침습적 시술을 필요로 하며, 인간에서 골관절염이 시작되는 과정을 충실히 반영하지 못한다²⁷. Dunkin-Hartley 기니피그는 자연적으로 골관절염을 발병하여 널리 사용 가능한 자연식 골관절염²⁸ 모델입니다. 이 자발적 모델은 개입이 필요하지 않고 인간의 변화를 반영하는 병리학적 변화를 특징으로 하기 때문에 기계론적 OA 발달을 연구하는 중개 연구에 이상적입니다⁶. 이전에 발표된 연구는 Dunkin-Hartley 기니피그에서 자발적 골관절염의 진행에 대한 새로운 치료법의 효과를 테스트하기 위해 관절 내 주사를 활용했습니다 29,30,31.

생쥐에서의 관절 내 주입은 이전에 설명되었지만, 해부학적 차이는 기니피그에서 이 절차에 추가적인 도전을 제기한다⁷. 관절 내 주사는 기니피그 골관절염 연구에 필수적이지만, 이 절차는 아직 체계적으로 상세화되지 않았습니다. 설명된 방법론을 통해 기니피그에서 관절 내 주사를 정제하여 절차 관련 합병증의 가능성을 줄이기 위한 주요 고려 사항을 강조합니다. 인간에서 관절 내 주사 후 흔한 부작용으로는 통증, 부종, 패혈성 관절염 및 신경병증이 있으며, 이는 기니피그에서 주사를 시행할 때 잠재적인 합병증으로 고려되어야 한다³². 우리의 경험에 따르면, 바늘이 관절 공간에 너무 깊숙이 삽입되거나 주사 중 뼈 구조와 접촉할 때 절뚝거림과 관절 촉진 통증을 포함한 부작용이 발생할 수 있습니다. 살아있는 동물에게 주사를 놓기 전에 주사를 연습할 수 있는 시체가 있으면 보다 정확한 주사를 보장하는 데 도움이 되었습니다. 얕은 주입 깊이를 보장하기 위해 기술을 개선하면서 관절 내 무릎 주사 후 부작용이 관찰되지 않았습니다. 따라서 적절한 주입 기술은 동물 복지를 보장하는 데 가장 중요하며, 특히 수개월에 걸쳐 여러 번 주입해야 하는 연구의 경우 더욱 그렇습니다. 절차의 주요 단계에는 무균 기술 사용이 포함됩니다. 생존 절차를 수행하기 전에 충분한 교육; 주사 시 통증 지각 및 움직임을 방지하기 위해 수술 마취 평면을 달성하는 단계; 그리고 적절한 주입 깊이를 보장하여 화합물을 다시 투여해야 할 수 있는 뼈 원위 및 관절 주위 주사와의 접촉을 피합니다.

OA 관련 변화를 체계적으로 평가하기 위해 3D 이미지 렌더링을 포함한 μCT 분석을 설명하여 영향을 받는 조직의 시각화, 분할, 라벨링 및 객관적인 측정을 가능하게 합니다. 설명된 방법은 시간 경과에 따른 OA 관절 및 뼈 변화를 체계적으로 평가하는 데 효과적이고 효율적이었습니다. μCT 결과에 따르면 12개월 된 Dunkin-Hartley 기니피그는 5개월 된 기니피그보다 골밀도가 증가하고 섬유주 두께가 증가함에 따라 OA가 더 심한 것으로 나타났습니다. 이처럼 시간이 지남에 따라 골관절염이 악화되는 것으로 나타났으며, 이는 골밀도와 섬유주 두께를 평가한 μCT 분석을 포함하여 이 골관절염 모델에서 이전에 발표된 결과와 일치한다¹³. 이전 연구와 제시된 대표 결과는 μCT^22,23으로 측정한 바와 같이 시간이 지남에 따라 골밀도 및 섬유주 두께가 증가하고 있음을 보여줍니다. 또한 2차원에서 무릎에 대한 조직학적 평가는 μCT 데이터의 타당성을 뒷받침합니다. 조직학적으로 골관절염의 징후는 생후 5개월 된 동물에 비해 9개월 된 기니피그와 12개월 된 기니피그에서 더 두드러집니다. 골관절염과 관련된 조직학적 변화에는 프로테오글리칸 손실, 열구, 저세포성 등이 포함됩니다. ¹⁰ 이러한 특징들은 각각 더 오래된 기니피그에서 볼 수 있습니다. 또한 나이가 많은 기니피그는 OA 중증도¹⁰을 평가하기 위해 널리 활용되고 검증된 방법인 Modified Mankin 점수가 더 높습니다. 당사의 조직학적 분석은 예상되는 OA 변화를 보여주지만, μCT는 하나 또는 몇 개의 조직 절편이 아닌 전체 샘플을 스캔하기 때문에 조직학적 검토보다 OA 변화에 대한 보다 심층적인 평가를 제공합니다¹⁸. 또한, 2차원 및 3차원 모두에서 뼈 병변의 정도에 대한 보다 객관적인 측정을 제공한다¹⁸. 연구자는 조직학적 OA 변화를 평가할 때 국제 골관절염 연구 협회(Osteoarthritis Research Society International histologic assessment guidelines)와 같은 기존 지침을 참조해야 한다¹⁰. 연구자들은 골관절염 발달의 심층적인 특성화를 위해 보행 분석을 포함한 추가적인 보조 검사를 고려해야 한다³⁴. 보행 분석은 시간 경과에 따른 기능적 변화를 밝힐 수 있지만, 골관절염 병변은 절뚝거림이 시작되기 훨씬 전에 발생하므로 μCT는 질병 초기 단계에서 골관절염 관련 변화를 더 민감하게 측정하는 수단이 됩니다.

Dunkin-Hartley 기니피그는 골관절염 진행과 새로운 치료법의 효과를 연구하기 위한 강력한 모델을 제공하지만, 이 모델에는 한계가 있습니다. 자발적 모델은 일반적으로 외과적 또는 화학적으로 유도된 OA³⁵ 후 변화의 급속한 발전에 비해 더 긴 연구 기간을 필요로 합니다. 이로 인해 비용과 연구 기간이 늘어날 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 골관절염의 발병은 같은 연령의 동물마다 다르며, 이는 골관절염 관련 변화를 순차적으로 평가해야 할 수 있다³⁶. 이러한 차이에도 불구하고 연구자들은 모든 Dunkin-Hartley 기니피그가 3개월부터 골관절염이 발병하여 연골하 및 섬유주 뼈의 변화를 보인 후^10,19세가 됨에 따라 점진적인 골관절염 변화를 보일 것으로 예상할 수 있습니다. 연구자들은 각 동물의 한쪽 팔다리에 치료를 적용하여 반대쪽 사지가 내부 통제 역할을 할 수 있도록 함으로써 동물 간 변동성의 영향을 줄일 수 있습니다. 제시된 방법론의 범위를 벗어나지만, 초음파 유도 주입은 주입 정확도를 더욱 향상시키는 데 도움이 될 수 있으며, 기니피그에서 활용되어 왔다³⁷. 본 명세서에서 제안된 연구는 이 이미징 방식을 활용하지 않고 촉진 유도 주입의 타당성을 설명하며, 이는 현장에서 널리 사용되는 기술이다(³⁷). μCT는 병리학 및 뼈 구조를 분석하는 강력한 도구이지만, 광범위한 분석 기능을 지원하는 소프트웨어의 가용성은 분석에서 사용자 간 변동성을 유발할 수 있다³⁸. 본 연구에서 μCT 스캐닝 베드의 직경은 6.35cm로 전체 기니피그 또는 관절의 in situ 이미징을 방지했습니다. 전체 동물 이미징을 용이하게 할 수 있는 더 큰 침대 부착물이 상업적으로 이용 가능합니다. 이 소프트웨어는 일반적으로 사용자 친화적이며 몇 가지 제안된 설정을 제공하지만 더 높은 해상도와 정확도를 위해 수동으로 설정을 편집하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 기계학습을 포함한 자동화 기법이 계속 발전함에 따라, 이러한 수동 조정은 표준화를 강화하기 위한 새로운 자동 소프트웨어 기법으로 대체될 수 있다³⁹. 제시된 원고는 사용된 μCT 및 해당 소프트웨어에 대한 단계별 지침을 설명하지만 이러한 동일한 분석은 다른 브랜드 및 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 연구원은 다른 기계 및/또는 소프트웨어를 사용할 때 이미지 분석을 최적화하고 표준화하기 위해 해당 사용자 설명서를 참조해야 합니다. 변동성을 줄이려면 모든 샘플에서 동일한 설정을 유지하는 것이 중요합니다. 이미지 분석의 주관성은 여러 명의 맹검 실험자에 의한 분석을 복제함으로써 더욱 줄어들 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 목표는 기니피그에서 기술적으로 어려운 절차를 수행하고 관련 OA 변화에 대한 후속 μCT 분석에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다. 기술 및 데이터 분석의 표준화는 비용을 최소화하고 효율성을 높이는 데 도움이 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
200 프루프 에탄올	Decon Laboratories	2701	살균제
3D. SUITE 소프트웨어	Bruker		μ-CT 분석 소프트웨어
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	살균제
인슐린 주사기 바늘이 있는	Ulticare	91008	주사
Isoflurane	Piramal	803249	동물 마취
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		&-CT 재구성 소프트웨어
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	제어 및 희석제
SkyScan 1176	Bruker		를 사용하여 샘플을 스캔합니다.