이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.
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방법 논문
아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집
이 논문에서
요약
초록
게놈 편집 기술은 쥐를 포함한 유전자 변형 동물을 생산하는 데 널리 사용됩니다. DNA 복구 템플릿과 CRISPR-Cas 시약의 세포질 또는 전핵 주입은 배아에 전달하는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나 이러한 유형의 미세 조작은 특수 장비에 대한 접근이 필요하고 힘들며 일정 수준의 기술이 필요합니다. 더욱이, 미세주입 기술은 종종 배아에 가해지는 기계적 스트레스로 인해 배아 생존율을 낮춥니다. 이 프로토콜에서는 미세주입 없이 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 함께 작동하는 대규모 DNA 복구 템플릿을 제공하는 최적화된 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 단일 가닥 DNA 공여 템플릿의 AAV 매개 DNA 전달과 전기천공에 의한 CRISPR-Cas9 리보핵단백질(RNP) 전달을 결합하여 2세포 배아를 변형합니다. 이 새로운 전략을 사용하여 42%에서 90% 사이의 효율로 1.2-3.0kb 크기의 DNA 염기서열을 삽입하는 표적 knock-in rat 모델을 성공적으로 생산했습니다.
서론
CRISPR 기반 게놈 편집 도구의 개발은 새롭고 더 정교한 유전자 조작 쥐 모델을 효율적으로 생성하는 능력을 가속화했습니다. 단일 가이드 RNA는 Cas9 뉴클레아제와 함께 결합되어 게놈 내에서 관심 있는 DNA 염기서열을 표적으로 하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하고 이중 가닥 DNA 절단을 초래합니다. 세포 DNA 복구 메커니즘은 오류가 발생하기 쉽기 때문에 복구 과정에서 삽입 및 결실(INDEL)이 도입되어 표적 유전자의 기능을 방해할 수 있습니다. 게놈 편집 시약과 함께 원하는 조작된 DNA 염기서열(복구 템플릿)의 동시 전달이 있는 경우, 이중 가닥 DNA 절단을 포함하는 영역에 복구 템플릿의 삽입은 상동성 유도 복구(HDR)라는 프로세스를 통해 발생합니다. 이는 표적 DNA 삽입/치환(knock-in)을 통해 동물 모델을 생성하는 데 효과적인 전략입니다. 한 가지 한계는 knock-in 염기서열의 크기가 큰 경우가 많아 유전자 편집 효율이 감소하여 원하는 모델을 생성하기가 더 어려워진다는 것입니다1. knock-in 효율을 높이기 위한 전략에는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 및 단일 가닥 DNA(ssDNA) 복구 템플릿의 선형화와 DNA 복구 템플릿의 화학적 변형이 포함됩니다 2....
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프로토콜
모든 실험 절차는 미주리 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC 프로토콜 #25580)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 사용 및 관리 가이드에 명시된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. AAV 매개 DNA 복구 템플릿 전달
- 두 상동성 암 사이에 원하는 knock-in 시퀀스를 포함하도록 DNA 구조를 설계합니다. 일반적인 상동성 암 길이는 300-500bp입니다. 적절한 플라스미드 백본으로 클로닝하고 재조합 ssAAV1 또는 ssAAV6(혈청형 1 또는 6)으로 패키징하여 전체 DNA 복구 템플릿(homology arm + desired knock-in sequence)이 반전 말단 반복(ITR)에 의해 측면에 있는지 확인합니다.
참고: sgRNA 표적 염기서열이 DNA 복구 템플릿에 존재하는 경우, 이 염기서열을 방해하는 침묵의 돌연변이를 설계하여 올바르게 표적화된 대립유전자의 CRISPR-Cas9 매개 편집을 방지하는 것이 중요합니다.
주의: 재조합 AAV 바이러스 벡터는 비통합적이며 BSL-1로 분류됩니다. 표준 무균 기술은 바이러스에 노출된 배아를 피펫팅하고 처리하는 데 사용됩니다. - 엔지니어링된 ssAAV1 또는 ssAAV6(DNA 복구 템플릿과 함께 ....
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결과
프로토콜에 따라 DNA 복구 템플릿의 효과적인 AAV 매개 전달이 있어 2세포 배아를 CRISPR-Cas9 RNP로 전기천공한 후 매우 효율적인 HDR을 수행할 수 있습니다. 비디오에서 볼 수 있듯이 성공적인 electroporation 공정은 각 전극에 기포를 형성하고(그림 2C) 임피던스가 0.100 및 0.300kΩ 범위 내에서 유지되는 결과를 낳습니다. 전기천공법 후 배아가 부풀어 올라 조나 펠루시다(zona pellucida) 내부의 유리관 주변 공간을 채우는 것은 드문 일이 아닙니다(그림 3). 이 붓기는 배양에서 몇 시간 후에 가라앉아야 합니다. 또한 2세포 배아를 전기포킹한 후 세포 융합 사건의 작은 비율(최대 20%)을 보는 것도 드문 일이 아닙니다(그림 3). 세포 융합은 전극 사이의 수직 축 .......
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토론
CRISPR-Cas 게놈 편집 시스템은 다양한 동물 종에서 간단하고 복잡한 맞춤형 유전자 변형을 효율적으로 생산할 수 있도록 함으로써 유전 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 게놈 편집과 관련된 기술의 빈번한 개선과 개선은 그 다양성을 더욱 강화합니다. 여기서는 CRISPR-Cas9 시약을 2세포 설치류 배아에 주입하는 2세포 배아 전기천공법과 함께 ssAAV 매개 DNA 전달을 사용하는 새로운 접근법을 설명했습니다. 우리는 이것이 표적 knock-in 동물 모델을 생산하는 효과적인 방법임을 입증했습니다.
AAV 사용의 주요 이점은 미세 주입 기술 없이 더 큰 DNA 복구 템플릿을 배아에 전달할 수 있다는 것입니다. AAV 매개 전달은 또한 전기천공법 단독의 DNA 템플릿 크기 제한을 다소 우회하는 데 도움이 됩니다. 그러나 AAV를 사용할 때 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 수정란을 둘러싸고 있는 경화된 당단백질 매트릭스인 조나 펠루시다(zona pellucida)는 종종.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 비디오 촬영 및 비디오 편집에 도움을 준 Nolan Davis에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 전극용 악어 클립이 있는 리드 | NepaGene | C117 | |
| 미네랄 오일 | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
참고문헌
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directe....
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재인쇄 및 허가
