2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

행동하는 유기체의 신경 활동을 조사하는 것은 몇 가지 과제를 제시합니다. 예를 들어, 뇌 조직에 대한 물리적 접근은 온전함을 유지해야 할 필요성에 의해 제한되기 때문에 뇌의 표재 영역을 더 쉽게 고려할 수 있습니다. 온전한 조직 내에서 특정 표적을 분리하는 것은 종종 어려운 작업이며 때로는 불가능합니다. 해리된 균질한 신경 세포 배양은 신경 회로의 개별적(하위) 세포 구성 요소의 분자, 생화학 및 생물물리학적 특성에 편리하게 접근할 수 있지만 온전한 뇌의 현실적인 연결성 및 해부학적 조직은 손실됩니다. 이러한 근본적인 제약은 생체 내 복잡성을 피하는 동시에 구조를 체외에서 구성할 수 있는 중간 지점을 달성하기 위한 연구 노력에 영감을 주었습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 특히, 모듈식 신경 세포 배양은 지난 수십 년 동안 광범위한 연구의 주제였으며, 아래에 설명된 바와 같이 뇌 생리학의 주요 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다.

조직: 생체 내 연구에 따르면 뇌는 해부학적으로 정확한 세포 유형과 돌기 배열이 있는 층으로 구성되어 있습니다. 기능적 분석은 정확한 연결 체계^10,11을 사용하여 노드 어셈블리 및 모듈에서 신경 네트워크의 조직을 밝혔습니다. 그러나 연결성과 미세회로 모티프의 역할은 관련된 시냅스의 수가 너무 많을 뿐만 아니라 발달 및 활동 의존적 가소성의 얽힌 효과로 인해 생체 내에서 적절하게 연구될 수 없습니다.

신호 전송: in vivo 또는 무작위 in vitro 배양에서는 신호 전달을 평가하기가 어렵습니다. 축삭돌기 전도 및 축삭돌기 길이에 따른 활동 전위를 검사하려면 표면 기능화 또는 화학적 패터닝에 의해 신경돌기 돌출부를 유도해야 하며, 전기적 활동의 세포외 판독에서 높은 신호 대 잡음비를 제공해야 한다¹².

번역 관련성: 병리학적 조건에서 시냅스 전후 요소의 배타적 역할을 해독하려면 이러한 요소에 개별적으로 접근할 수 있어야 합니다. 시냅스 전후 요소를 효과적으로 분리하는 제한된 연결성을 가진 모듈식 배양은 이를 위해 필수적인 도구입니다¹³.

신경 세포 배양에서 어떤 형태의 구조를 얻기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. 크게 화학적 및 물리적 표면 조작으로 분류할 수 있다⁹. 전자의 방법^(14,15)은 특정 (생)화학 화합물에 부착하는 신경 세포의 성향에 의존한다. 이를 위해서는 접착제 또는 매력적인 분자를 마이크로 스케일의 정밀도로 표면에 증착하고 상세한 패턴을 따라야 합니다. 이를 통해 원하는 패턴에 따라 세포 표면을 부분적으로 커버할 수 있지만, 화학적 방법은 본질적으로 제한적이며 신경돌기 성장 유도에서 상대적으로 낮은 성공률을 갖는다¹⁶. 축삭 방향성을 완전히 제어하려면 축삭 유도¹⁷을 형성하기 위해 임시 화학 물질의 공간적 구배를 설정해야 합니다. 후자의 방법은 물리적 표면 조작을 포함하며 체외에서 신경 네트워크를 구조화하는 데 더 일반적으로 사용됩니다. 신경 세포는 미세한 챔버, 벽, 채널 등과 같은 기하학적 구속에 의해 원하는 위치에서 물리적으로 제약되어 폴리디메틸실록산(PDMS)3,5,6,7,18,19,20과 같은 생체 적합성 폴리머를 형성하여 경화되고 미세유체 장치로 응고됩니다. PDMS 미세유체 제조를 위한 사실상의 방법은 소프트 포토리소그래피(soft photolithography)(²¹)이며, 여기서 2차원 마스크는 마이크로 스케일로 패터닝되고 UV 노광시 실리콘 기반 재료를 선택적으로 에칭하기 위해 채용된다. 간단히 말해서, UV 경화 수지(즉, 포토레지스트)는 스핀 코팅을 통해 실리콘 웨이퍼에 코팅되어 점도와 회전 속도에 의해 결정되는 특정 높이에 도달합니다. 그런 다음, 패터닝된 마스크를 포토레지스트 위에 위치시키고 UV 광에 노출시킨다. 관심 영역에 해당하는 마스크 내의 투명한 영역은 UV 광선이 포토레지스트 분자의 국부적인 가교를 유도할 수 있도록 합니다. 노출되지 않은 포토레지스트 영역은 용매를 사용하여 씻겨 나가 마스터 몰드를 형성합니다. 이것은 선택한 엘라스토머(예: PDMS)를 베이킹하는 데 반복적으로 사용되며, 원하는 만큼 복제품에 원하는 형상으로 새겨집니다. 이러한 제조 방법은 미세유체 장치(²²)를 제조하는 가장 일반적인 방법이다. 아마도 연질 포토리소그래피의 주요 한계는 주목할만한 자본 투자의 전제 조건과 필요한 기술과 전문 지식을 갖춘 생물학 실험실의 생소함일 것입니다. 마스크의 준비와 복잡한 다중 높이의 높은 종횡비 형상을 설계하는 데 필요한 소프트 포토리소그래피의 단계는 사소하지 않으며(²³) 종종 아웃소싱을 필요로 한다. 대안적이고 저예산적인 방법들이 제안되었지만, 그것들이 생물학적 프로토타이핑의 고정밀 요구사항들을 항상 만족시키는 것은 아니다²⁴.

여기에서는 이광자 중합(2PP) 및 적층 제조에 의존하는 대체 제조 방법을 제시합니다. 간단하며 고급 미세 가공 및 미세 포토그래피 전문 지식이 필요하지 않습니다. 2PP 마이크로 매뉴팩처의 연구 분야는 90년대 후반²⁵년에 등장했으며 그 이후로 기하급수적인 성장을 목격했습니다²⁶. 이 기법의 기본 원리에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 찾을 수 있다²⁶. 간단히 말해서, 3차원 공간에 여기광 임펄스를 집중시킴으로써 2PP는 강도에 대한 다광자 흡수의 비선형 의존성을 활용합니다. 이는 제한된 흡수 기능을 부여하여 매우 국부적인 영역 내에서 정확하고 선택적인 여기를 보장합니다. 본질적으로, 네거티브-톤 포토레지스트는, 광 노출시 용해도가 감소된 물질로서, 낮은 듀티 사이클⁽²⁷)에서 펨토초 레이저 펄스의 집속된 빔에 노출된다. 이를 통해 낮은 평균 전력에서 높은 강도의 충격을 허용하여 재료에 해를 끼치지 않고 중합을 가능하게 합니다. 광유도 라디칼 단량체의 상호작용은 라디칼 올리고머를 발생시키고, 광저항 전체에 걸쳐 뚜렷한 부피, 즉 복셀까지 확장되는 중합을 개시하며, 그 크기는 레이저 펄스(²⁸)의 강도 및 지속시간에 의존한다.

이 연구에서는 A) 일회용 고분자 신경 세포 배양 장치를 생산하기 위해 여러 번 재사용할 수 있는 3D 프린팅 금형의 설계 및 신속한 제작(그림 1)과 B) 평면 신경 세포 배양 기질 또는 생체 전기 신호의 다중 사이트 기록이 가능한 기판 통합 미세 전극 어레이의 표면에 기계적 결합이라는 두 가지 구성 요소가 제시됩니다.

3D 기계 모델의 컴퓨터 지원 설계는 여기에서 매우 간략하게 설명되며 3D 프린팅 금형 및 PDMS 장치 제작으로 이어지는 단계도 자세히 설명되어 있습니다.

다양한 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 시작 3D 개체 모델을 생성하고 STL 파일을 생성하여 2PP 인쇄 프로세스를 제어할 수 있습니다. 자료 목차에서 나열된 첫 번째 및 마지막 응용 프로그램은 무료이거나 무료 라이선스와 함께 제공됩니다. 3D 모델을 구성하려면 항상 2D 스케치를 작성해야 하며, 이 스케치는 후속 모델링 단계에서 돌출됩니다. 이 개념을 설명하기 위해 프로토콜 섹션에서 일반적인 3D CAD 소프트웨어 설계 프로세스가 강조 표시되어 겹치는 큐브로 구성된 구조로 이어집니다. 보다 포괄적인 정보를 보려면 자료 표에 표시된 대로 다양한 온라인 자습서 및 무료 교육 리소스를 사용할 수 있습니다.

그런 다음 결과 STL 파일은 3D 프린터에서 실행할 일련의 명령으로 변환됩니다(즉, 슬라이싱 절차). 사용 중인 특정 2PP 3D 프린터의 경우 소프트웨어 DeScribe를 사용하여 STL 파일을 가져와 독점적인 GWL(General Writing Language) 형식으로 변환합니다. 2PP 프린팅 공정의 성공 여부는 다양한 매개변수, 특히 레이저 출력과 스캔 속도, 스티칭 및 해칭 슬라이싱 거리에 달려 있습니다. 대물렌즈 및 포토레지스트의 선택과 함께 이러한 매개변수의 선택은 설계의 가장 작은 기능과 의도된 응용 분야에 따라 달라집니다. 따라서 파라미터 최적화는 다양한 설계 시나리오 및 사용 사례의 요구 사항을 충족하는 데 필수적입니다. 이 작업을 위해 권장 레시피 IP-S 25x ITO Shell(3D MF)이 인쇄 매개변수에 대한 구성으로 고려되었습니다. 궁극적으로 기계적으로 안정적인 프린팅 부품은 3D 프린팅 시간을 최소화하면서 필요한 해상도로 프린팅됩니다.

이 작업에서 시연된 금형 설계 및 관련 STL 파일은 세포 배양 공간을 외부 영역(즉, 이후에 소스라고 함)과 내부 영역(즉, 이후에 타겟이라고 함)의 두 구획으로 분리하는 정사각형 프레임으로 구성됩니다. 이 두 구획은 각각 날카로운 각도의 경계가 특징인 마이크로 채널 세트를 통해 연결되며, 표적에서 근원으로의 신경돌기의 성장을 특별히 방해하도록 설계되었지만 그 반대의 경우도 마찬가지이며, 따라서 두 영역에서 성장하는 뉴런 간의 방향성 시냅스 연결을 촉진합니다.

이전 연구에서는 신경돌기의 방향성 성장을 촉진하기 위해 다양한 미세채널 형상을 사용했습니다. 예를 들어, 삼각형 형상(¹⁸), 수로 미늘 구조물⁽¹⁹) 및 테이퍼링 관로⁽²⁰)가 있다. 여기에는 마이크로 채널의 경계를 가로지르는 날카로운 각도 장벽이 있는 디자인이 사용되며, 비대칭 입구도 특징입니다. 이러한 마이크로 채널은 밀폐된 내부인 타겟 구획과 외부 영역인 소스 구획 사이의 연속성을 설정하는 역할을 합니다. 소스 측에서 마이크로 채널 초기 부분의 깔때기 모양은 소스와 타겟을 연결하는 최단, 즉 직선 경로를 따라 축삭 다발의 형성과 성장을 촉진하도록 설계되었습니다. 예리한 각도를 향하여 구현된 삼각형 공간은 타겟 측에서 더 큰 부피를 가지므로 신경돌기의 경로 찾기를 효과적으로 지연시키는 동시에 소스에서 비롯된 번들의 빠른 발사를 선호하고 사용 가능한 공간을 점유하는 것을 선호합니다. 마이크로채널의 길이에 대해 540μm를 선택하면 일반적으로 더 짧은 수지상 돌출부(³⁹)를 효과적으로 걸러낸다. 또한 5μm 높이로 세포 소마타가 마이크로 채널을 통해 침투하는 것을 방지합니다. 전반적으로, 이 구성은 외부, 소스 및 내부 Target 모듈 간의 단방향 연결을 촉진하는 것으로 입증되었으며, 여기에는 많은 대안 선택 중 원칙 증명으로 제시되어 있습니다.

2PP 몰드로 제작된 PDMS 장치는 유리 커버슬립 또는 페트리 접시와 같은 일반적인 세포 배양 기판의 표면에 부착할 수 있지만, 이 작업에서는 상업적으로 이용 가능한 기판 통합 미세 전극 어레이가 사용되었습니다. 미세전극 어레이 레이아웃에 대한 3D 설계를 최적화하기 위한 노력은 없었으며, 기계적 결합은 어레이를 가로질러 장치를 배치하는 것만을 목표로 실체현미경 유도 하에 수행되었으며, 일부 미세전극은 소스와 타겟 양쪽에 노출되지 않은 상태로 남겨두었습니다. 이를 통해 신경 세포 배양에서 제한된 연결성의 기능적 결과를 예비적으로 평가할 수 있습니다.

동물 취급과 관련된 모든 절차는 유럽 및 이탈리아 법률(2010년 9월 22일 유럽 의회 및 이사회 지침[2010/63/EU]; 2014 년 3 월 4 일 이탈리아 정부 법령 (no. 26)은 Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati의 기관 OpBA (동물 보호위원회)에 의해 명시 적으로 승인되었으며 이탈리아 보건부 (인증 번호 22DAB)에 의해 공식적으로 승인되었습니다. N.UVD)입니다. 이로 인해 이식된 쥐의 뇌 조직에서 지각이 없는 물질을 사용할 수 있게 되었으며, 이 연구에서 제시된 방법의 실험적 검증에 사용되었습니다.

이광자 중합에 의한 1. 3D 금형 제작

1. CAD 파일 생성
   참고: 다음 단계는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어(예: SolidWorks)를 사용하는 일반적인 3D 설계 워크플로를 보여줍니다. 이 작업에 설명된 샘플 STL 설계 파일(그림 2)은 Zenodo(https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110)를 통해서뿐만 아니라 보조 코딩 파일 1로도 사용할 수 있습니다.
   1. 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어 데스크톱 응용 프로그램을 실행합니다. 상단 메뉴 모음에서 새로 만들기를 선택합니다.
   2. 옵션에서 파트: 단일 설계 구성요소의 3D 표현을 선택합니다. Ctrl + 5 키 조합을 눌러 스케치의 평면도를 설정합니다.
   3. 측면 패널에서 스케치(Sketch )를 선택하고 코너 직사각형(Corner Rectangle)을 선택합니다. 사각형의 한쪽 가장자리를 클릭하여 선택합니다. 매개변수 패널이 나타나면 길이를 100단위로 설정합니다.
   4. 이전 가장자리에 수직 인 가장자리에 대해 1.1.3 단계를 반복하십시오 : 길이를 50 단위로 설정합니다. 사각형을 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 드래그하여 선택합니다.
   5. 관계 추가(Add Relation) 메뉴에서 고정(Fix)을 선택하여 선 간의 관계식을 구속합니다.
   6. 스케치를 종료하고 1.1.3 - 1.1.5 단계를 반복하여 이전 스케치와 겹치는 새로운(더 작은) 직사각형을 만듭니다.
   7. 측면 패널에서 피처를 선택하고 돌출 보스/베이스를 선택합니다: 큰 사각형과 작은 사각형의 깊이를 각각 5 및 10 단위로 설정합니다.
   8. 파일 메뉴에서 파트를 STL 형식(즉, 표준 테셀레이션 언어)으로 저장합니다.
2. CAD 파일 처리
   1. STL 파일을 DeScribe 응용 프로그램 소프트웨어가 장착 된 개인용 컴퓨터로 전송합니다.
   2. Describe를 실행하고 파일 메뉴에서 STL 파일을 엽니다. 모델의 3D 표현이 나타납니다.
   3. 오른쪽 메뉴의 방향 섹션에서 모델을 회전하여 공간에서 적절하게 방향을 지정하고 평면의 가운데에 배치합니다.
   4. 오른쪽 메뉴의 Scaling 섹션을 선택하여 전체 배율을 조정합니다.
   5. 상단의 드롭다운 메뉴에서 IP-S 25x ITO Shell(3D MF) 레시피를 선택합니다. IP-S를 포토레지스트로, 대물렌즈의 배율 25x, 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 기판을 인쇄 기판으로, 쉘 및 스캐폴드 인쇄를 중간 크기 형상(MF)의 작동 모드로 지정합니다.
   6. 마법사를 탐색하여 쉘과 스캐폴드 모두에 대해 슬라이싱 거리를 1μm로, 해칭 거리를 0.5μm로 선택하고 설정합니다.
   7. 가져오기 마법사의 출력 단계에서 분할에서 블록 크기를 X = 200μm, Y = 200μm, Z = 265μm로 정의하고 블록 오프셋을 X = 133μm, Y = 133μm, Z = 0으로 정의하여 마이크로채널의 섬세한 구조가 스티칭 라인의 영향을 받지 않도록 합니다.
   8. 스캔 모드로 기본값인 X-Y 평면의 경우 Galvo, Z축의 경우 Piezo를 사용합니다.
   9. 저장을 누르고 다음 텍스트 메뉴에서 var $baseLaserPower = $shellLaserPower 줄을 var $baseLaserPower = 75로 바꾸어 인쇄물의 가장 낮은 레이어에서 레이저 출력을 75%로 줄입니다.
   10. 위의 단계를 통해 얻은 GWL 파일을 2PP 3D 프린팅 전용 워크스테이션으로 전송합니다.
3. 3D 프린팅 및 샘플 개발
   1. NanoWrite 응용 프로그램 소프트웨어를 시작합니다. 프린터 초기화 후 소프트웨어 인터페이스에서 Exchange Holder를 클릭하여 기판 홀더를 삽입하고 대물렌즈를 장착합니다.
   2. 25x 대물렌즈를 노즈피스의 적절한 위치에 장착합니다. 저항을 측정하기 위해 설정된 전자 멀티미터로 유리 기판의 어느 면이 ITO로 코팅되어 있는지 식별: 판독값은 100-300 Ω와 같이 낮은 값이어야 하지만 ITO 코팅된 면에만 해당됩니다.
   3. 유리 기판을 홀더에 놓고 ITO 코팅된 면이 위쪽을 향하도록 합니다. 테이프를 사용하여 제자리에 단단히 고정하십시오.
   4. 화학 흄 후드 아래에서 유리 기판 중앙에 IP-S 포토레지스트 한 방울을 떨어뜨립니다.
   5. 레진 드롭이 대물렌즈를 향하게(즉, 아래로) 홀더를 3D 프린터에 삽입합니다.
   6. 소프트웨어 파일 메뉴를 통해 GWL 파일을 로드합니다. Approach Sample을 선택하여 대물렌즈를 레진 방울 가까이로 이동합니다.
   7. 인터페이스 찾기(Find Interface)를 선택하면 두 재료의 굴절률 차이를 기반으로 ITO 포토레지스트 인쇄 인터페이스를 감지할 수 있습니다.
   8. 작업 시작(Start Job)을 선택하여 인쇄를 시작합니다. 인쇄가 완료되면 홀더 교환(Exchange Holder)을 눌러 홀더를 회수합니다.
   9. 홀더를 회수하고 인쇄된 부분이 있는 기판을 조심스럽게 제거합니다. 유리 기판을 흄 후드 아래에서 20분 동안 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트(PGMEA)에 담가 인쇄된 부품을 현상합니다.
   10. PGMEA에서 기질을 제거하고 이소프로판올에 5분 동안 담그십시오. 인쇄된 부품을 화학 흄 후드 아래에서 자연 건조시키십시오.
4. 인쇄 후 처리 및 금형 장착
   1. 5-20분 동안 충분한 전력으로 UV 광선(즉, 365-405nm)에 노출시켜 인쇄된 부품을 경화합니다(전력에 대한 자세한 내용은 설명 참조).
   2. 층류 후드 아래에서 유리 기판에서 인쇄된 부품을 조심스럽게 제거합니다. ~2μL의 수지를 35mm x 10mm 페트리 접시의 바닥에 떨어뜨립니다.
   3. 인쇄된 부품을 방울 위에 조심스럽게 놓고 수지가 부품 아래로 흐르도록 합니다. UV 광선에 노출시켜 인쇄된 부분을 5분 동안 추가로 경화시킵니다.
   4. 페트리 접시를 캡으로 덮고 80°C에서 30분 이상 가열 경화를 위해 오븐으로 옮깁니다. 인쇄된 부분의 변형이나 파손을 방지하기 위해 오븐을 예열하지 마십시오. 경화 후 인쇄된 부품은 페트리 접시 바닥에 영구적으로 부착됩니다. 이제부터 인쇄 및 장착 된 부분을 금형이라고합니다.

2. 금형 및 세포 배양 기판에서 PDMS 장치 제작

1. PDMS 장치 제작
   1. 중합되지 않은 PDMS의 염기와 경화제 의 10:1(중량비) 혼합물 20mL를 준비합니다. 각 장치에 대해 필요한 높이에 따라 1-2mL의 PDMS 혼합물이면 충분합니다. 여분의 중합되지 않은 PDMS는 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관하십시오.
   2. 층류 후드 아래에서 혼합물을 4분 동안 완전히 저어줍니다. 혼합물이 기포를 고르게 가두면 불투명해집니다.
   3. 혼합물을 50 μL μtube에 옮기고 168 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 혼합물에서 기포를 제거하고 선명한 외관을 얻습니다.
   4. 몰드를 10μL의 소수성제(즉, Repel-silane ES)로 처리하고 7분 동안 휴지시켜 나중에 중합된 PDMS를 몰드에서 부드럽게 분리합니다.
   5. 곰팡이를 70% 에탄올로 1번, 탈이온수(DI)로 2번 헹굽니다. 금형이 층류 후드 아래에서 공기 중에 건조되도록 합니다.
   6. 장치의 의도된 최종 높이에 도달할 때까지 PDMS 혼합물을 금형에 부드럽게 붓습니다. 기포 형성을 방지하려면 혼합물을 금형 표면에 가까운 거리에서 부드럽게 붓습니다.
   7. 금형을 덮고 경화를 위해 80°C로 예열되고 안정화된 오븐에 18분 동안 옮깁니다. 장치 높이가 5mm 이상 최대 1cm인 경우 경화 시간을 18분에서 25분으로 연장합니다.
   8. 층류 후드 아래에서 경화된 PDMS 블록을 금형에서 부드럽게 분리하고 유리 페트리 접시 안에 이소프로판올에 최소 10분 동안 담그십시오. 이소프로판올은 비가교결합 PDMS를 제거합니다. 항상 PDMS 블록을 덮어 두십시오.
   9. 이소프로판올을 다시 만들고 실체 현미경으로 장치의 중앙 사각형 부분(이 작업에서는 목표 영역으로 식별됨)을 안과용 칼로 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 가장자리를 따라 추가 절단을 진행하여 장치의 궁극적인 모양을 얻습니다.
   10. 이소프로판올에서 장치를 꺼내 에탄올에 30분 동안 담근 다음 멸균 DI 물로 3번 헹굽니다. 이 시점부터 무균 상태를 유지하십시오.
   11. 층류 후드 아래에서 장치를 새 페트리 접시로 옮기고 뚜껑을 약간 열어 둡니다. 공기 중에서 완전히 건조시키십시오.
2. 장치 장착 및 세포 배양 기질 준비.
   1. 70% 에탄올에 30분 동안 담가 각 미세전극 어레이(MEA)를 멸균한 다음 멸균 DI 물로 3번 헹굽니다.
   2. 멸균 미세 핀셋을 사용하여 층류 후드와 실체현미경 아래에서 PDMS 장치를 MEA의 내부 영역에 장착합니다. PDMS 장치의 한쪽을 기판 통합 미세 전극이 있는 내부 MEA 영역의 중앙에 정렬하여 소스 영역과 대상 영역 모두에서 미세 전극이 거의 드러나지 않도록 합니다( 그림 2 참조).
      참고: 이 작업에서는 MEA 미세전극을 PDMS 장치 마이크로채널에 정렬할 필요가 없습니다. PDMS 장치와 MEA 표면 사이를 단단히 밀봉하기 위해 장치를 부드럽게 눌러야 할 수 있습니다. 핀셋 끝으로 미세 전극을 만지지 마십시오.
   3. PDMS 장치가 있는 MEA를 플라즈마 클리너 챔버에 삽입하여 공기 플라즈마를 통한 표면 활성화를 활성화합니다. 챔버의 4분 진공 펌프 배출로 프로세스를 시작합니다. 그런 다음 공기 배출을 제어하기 위해 공기 밸브를 약간 엽니다. 공기 밸브를 닫고 플라즈마 유도기를 켜서 RF 전력 레벨을 10W에서 18W 사이로 조정합니다.
   4. 빛나는 표시등이 나타나면 프로세스를 80초 동안 실행합니다. 그런 다음 플라즈마 유도 장치를 끄고 진공 펌프 밸브를 닫은 다음 공기 밸브를 부드럽게 엽니다. 챔버를 열어 MEA를 회수합니다.
      알림: 플라즈마 처리에 MEA를 비멸균 환경에 노출시키는 것이 포함되는 경우 멸균을 보장하기 위해 각 MEA를 층류 후드의 UV 광선 아래에 30분 동안 두십시오.
   5. MEA에 폴리에틸렌이민(PEI) 0.1% wt/vol 용액 1mL를 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다. PEI 용액을 흡입하고 멸균 DI 물로 5번 헹굽니다. 세포 배양 배지 1mL를 MEA에 추가하고 세포 파종 전에 배양합니다.

3. 신경세포 배양 및 전기생리학

1. 해부 배지, 분해 용액 및 용액 1-3을 미리 준비합니다( 표 1 참조).
2. 해리된 신경 세포 배양.
   1. 생후 0-1일 된 신생아 Wistar 쥐 새끼의 주둥이를 부드럽게 잡고 날카로운 가위를 사용하여 신속하게 목을 베십시오.
   2. 두피 피부를 벗겨내고 가는 가위로 두개골의 시상 정중선을 따라 절개한 다음 소뇌 접합부에서 두개골을 관통하는 관상동맥을 만듭니다.
   3. 두개골을 제거하고 미세한 주걱으로 뇌를 퍼낸 다음 차가운(4°C) 해부 배지로 옮깁니다.
   4. 피질하 조직, 해마, 수막을 제거한다. 조직을 작은 조각(예: 1-2mm³)으로 다지고 15mL 튜브에 옮깁니다. 용액을 버리고 신선한 해부 배지를 사용하여 조직을 헹군 다음 소화 배지로 세척합니다.
   5. 분해 배지를 폐기한 다음 용액 1 mL 1을 추가합니다. 혼합물을 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 용액 1을 버리고 새 해부제로 조직을 헹굽니다. 그런 다음 용액 2 1mL를 추가하고 혼합물을 4°C에서 10분 동안 유지합니다.
   6. 용액 2를 버리고 신선한 해부 배지를 사용하여 조직을 헹굽니다. 그런 다음 용액 3 1mL를 추가합니다. 용액을 20-30회 위아래로 천천히 피펫팅하여 세포를 기계적으로 해리합니다. 해리된 세포의 균일한 탁한 혼합물이 나타나면 절개 배지를 추가하여 부피를 3mL로 높입니다.
   7. 혼합물을 100 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 1mL의 예열된 배양 배지에 재현탁시킵니다.
   8. 세포를 계수하고(즉, 세포 계수 챔버에 의해) 그에 따라 세포 파종 용액의 밀도를 조정합니다.
   9. 공칭 세포 밀도가 1.8 x 10⁶ (~ 6500 cells/mm²)인 1mL의 파종 용액으로 각 MEA를 파종합니다. 파종된 MEA를 37°C 및 5%_CO2의 습한 인큐베이터에서 배양합니다. 배지를 2일마다 신선한(즉, 매주 만든) 배양 배지로 교환하십시오.
3. 세포외 전기생리학
   참고: 해리된 신경 세포 배양은 시험관 내에서 2-3주 후에 완전히 성숙한 전기 표현형에 도달합니다. 다음 섹션에서는 상용 MEA 응용 소프트웨어(실험자)를 사용하여 모듈(예: Source 또는 Target)에서 배양된 신경 세포 집단 중 하나를 전기적으로 자극하는 동시에 성숙한 네트워크에서 두 집단의 활동을 기록하는 세포 외 자극 프로토콜에 대해 설명합니다.
   1. 하나의 MEA를 헤드 내부에 부드럽게 장착합니다.tage 의 다중 채널 전자 증폭기, 건식 인큐베이터(37°C, 5% CO₂) 내부에 10분 동안 수용합니다. 맞춤형 PDMS 캡은 별도로 제작할 수 있으며 수분 증발을 줄이고 멸균 상태를 유지하기 위해 각 MEA의 단단한 덮개로 사용할 수 있습니다.
   2. 실험자 소프트웨어를 시작합니다. 샘플링 속도를 25 kHz로 설정하고 DAQ 시작을 눌러 데이터 수집을 시작합니다. [데이터 디스플레이] 패널에는 각 채널에 대해 셀외에서 기록된 활동의 원시 트레이스가 나타납니다.
   3. 자발적 활동을 모니터링하고 소스 또는 타겟 측 미세전극에서 네트워크 전체의 자발적으로 동기화된 활동 버스트가 버스트하는 동안 활성화되는 3쌍의 인접 미세전극을 시각적으로 식별하고 선택합니다.
   4. 소프트웨어의 자극기 패널에서 바이폴라 구성의 각 자극 미세전극 쌍에 대한 파라미터를 구성합니다: 바이페이직 펄스 파형을 선택하고 피크 진폭을 ± 800mV로, 펄스 지속 시간을 200μs로 설정합니다.
   5. 레코더를 설정하고 자극 전 300ms에서 후 1000ms의 기간 동안 녹음합니다.
   6. 필요한 반복 횟수에 대해 소스 및 대상 측에 대해 3.3.3-3.5단계를 인터리브 방식으로 반복합니다.

2구획 고분자(뉴런) 세포 배양 장치의 제조가 여기에 보고되어 PDMS 장치의 신속한 프로토타이핑을 위한 2PP 3D 프린팅의 사용을 보여줍니다. 특히, 단방향 시냅스 연결성을 가진 모듈식 뉴런 네트워크를 위해 장치가 생산되며 그 기능적 특성은 다중 사이트 세포외 전기생리학 측면에서 제시됩니다. 간단히 말해서, 마이크로미터 규모의 금형은 상업적으로 이용 가능한 3D 프린터를 사용하여 직접 레이저 쓰기를 통해 구현되었습니다. 특히 프린터는 중심 파장이 780nm이고 지속 시간이 80-100fs인 레이저 펄스를 통해 50mW의 전력을 제공합니다. 제조 과정에서 레이저 빔은 프린터의 대물렌즈(25x, NA=0.8)를 통해 네거티브 톤 포토레지스트(IP-S)에 초점을 맞춰 x축과 y축의 경우 갈보 스캐너를 사용하고 z축의 경우 피에조 스테이지를 사용하여 인쇄량을 스캔합니다. 인쇄 부피는 200mm x 200mm x 265mm 블록으로 적절하게 분할되어 전체 크기가 6500mm x 6500mm x 545mm이고 공칭 부피가 12.423mL인 금형을 구현했습니다. 그림 2A 는 금형의 치수와 형상의 크기를 강조한 2D 스케치를 나타내는 반면, 그림 2B 는 MEA에 장착된 완성된 장치의 클로즈업 사진을 보여줍니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 준비된 금형은 내구성이 뛰어나 PDMS 장치를 제작하는 데 50회 이상 재사용할 수 있었습니다.

인쇄된 주형은 PDMS 장치를 주조하는 데 사용되었으며, 이 장치는 미세 전극 어레이(MEA)의 유리 기판 통합 어레이의 내부 영역에 장착되어 신경 전기 활동의 다중 사이트 세포 외 기록 및 원리 증명에 사용되었습니다. 상업용 기질 통합 MEA는 각 배양 구획에 위치한 마이크로엘레크로드의 하위 집합에 의해 세포 외로 전달되는 공간적으로 국소화된 전기 자극에 반응하여 모듈식 배양물의 활성을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 각 MEA에는 직경이 30μm이고 전극 간 피치가 100μm인 120개의 질산티타늄(TiN) 미세전극이 포함되어 있습니다. 그림 2C-D는 MEA 상단에 PDMS 장치를 배치한 것을 보여줍니다. 그림 2C에 표시된 챔버의 전체 설치 공간과 함께 장치의 개별 마이크로 채널의 기하학적 특징은 배양된 뉴런의 구획화로 이어집니다. 이들은 장치의 외부 영역(소스) 또는 장치의 내부 영역(대상)에 속한 구획에 따라 구별할 수 있습니다. Source에서 Target으로 제한되는 선호되는 축삭 유도는 마이크로 채널의 날카로운 각도의 가장자리에 의해 결정됩니다. 그림 2D는 MEA에 고분자 장치를 배치하고 소스 또는 타겟 구획 내에 위치한 기록 전극의 상대적 커버리지 영역을 보여줍니다. 장치의 마이크로 채널 내부를 하나 이상의 MEA 미세 전극 행에 정밀하게 정렬하는 것은 사례 연구에 필요하지도 않았고 추구하지도 않았습니다.

비대칭 신경돌기 성장의 대표적인 증거는 그림 3에 나와 있으며, 생체 외 개발 중 세포 도금 후 6일(그림 3A) 및 2일(그림 3B-D)의 실시간 이미징에서 형광 표지 신경돌기를 보여줍니다. 장치의 표적 쪽에 있는 신경돌기가 우주를 통과하는 진행을 방해하는 장애물로 인해 날카로운 각도 장벽에 부딪히는 동안, 근원 쪽에서 시작된 신경돌기는 방해받지 않고 성장하여 채널을 가로질렀습니다. 이 비대칭성은 설계에서 명시적으로 의도한 대로 Source에서 Target으로 투영되는 두 구획의 뉴런 간의 단방향 축삭 연결을 선호합니다. 이 결과는 두 구획 각각에서 번갈아 가며 전달되는 자극에 의해 유발된 전기 반응의 (기능적) 전기생리학적 평가에 의해 추가로 뒷받침됩니다.

시험관에서 3-4주 후, 뉴런 네트워크가 완전한 성숙기에 도달함에 따라29,30, 짧은 전기 자극을 전달하고 그들이 불러일으킨 뉴런 반응을 모니터링하여 두 구획의 기능적 연결성을 조사할 수 있었습니다31. 그런 다음 진폭이 800mV인 Biphasic 전기 임펄스를 소스에만 또는 타겟 모집단(N 반복 = 150, N 모듈식 배양 = 6)에만 대안적으로 적용했으며, 바이폴라 구성 및 인터리브 방식으로 3개의 병치된 평면 미세 전극 쌍에 의해 전달되었습니다. 따라서 3쌍의 전극은 MEA의 소스 영역 또는 MEA의 타겟 영역 내에 위치할 수 있습니다. 각 자극에 의해 유발된 전기 반응은 전파 지연 후 모든 MEA 미세 전극에 의해 감지될 수 있습니다. 녹음은 채널당 25kHz의 샘플링 속도로 수행되었으며, 그 결과 세포 외 원시 전기 신호는 16비트의 아날로그-디지털 변환 해상도로 디지털화되었습니다. 임계치 교차 피크-검출 알고리즘(32)을 오프라인으로 사용하여 임의의 스파이크 분류를 수행하지 않고 세포외 활동 전위의 발생 시간을 검출하였다. 그림 4A-B는 자극 전달의 위치에 따라 150회 반복되는 유발 반응의 강한 비대칭성을 명확하게 보여주며, 이는 기하학적 제약이 연결성의 선호 방향성에 상당한 기능적 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 실제로, 소스 측을 자극할 때, 소스 뉴런 집단의 발화율(자극 주위 스파이크-시간 히스토그램을 계산하여 추정됨)은 예상대로 증가하여 활동 전위(33,31,34)의 완전한 네트워크 버스트를 생성하고, 지연 후 표적 모집단의 발화율의 증가에 뒤따랐습니다. 그러나 자극이 표적 집단 내에서 전달됨에 따라 표적 집단의 발화율만 증가했으며 근원 집단은 대부분 침묵을 유지했습니다. 그림 4C-D는 고분자 장치가 존재하지 않는 대조군 배양(즉, 구조화되지 않은 신경 세포 배양)에서 동일한 자극/반응 패러다임을 반복하며, 세포 외 자극도 4회 반복에 걸쳐 전달되었습니다. 이러한 제어 조건의 경우, 두 자극 중 하나에 의해 유발된 반응에서 비대칭이 발생하지 않았습니다. 자극을 전달하는 데 사용되는 MEA 미세 전극의 하위 집합은 모듈식 네트워크에서 사용되는 것과 일치했지만 자극 전달의 위치는 전체 인구로부터 유사한 유발 반응을 유도했습니다. 이는 PDMS 장치가 두 구획에 걸쳐 단방향 시냅스 연결을 선호한다는 것을 확인합니다. 전반적으로, 모듈식 배양에서 유발된 비대칭 반응(N = 6)과 대조군 배양에서 유발된 대칭 반응(N = 4)은 구획화된 체외 시스템의 제한된 해부학적 연결성을 강하게 나타냅니다. 그림 4를 생성하는 데 사용된 전기생리학적 데이터 및 스크립트는 Zenodo(https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990)를 통해 사용할 수 있습니다.

그림 1: 2PP 마이크로 몰드 제조 및 PDMS 복제 몰딩의 스케치. (A) 3D 모델을 CAD로 설계하고 STL(Standard Tessellation Language) 형식 파일로 내보내고, (B) 수지(IP-S) 한 방울 내에서 레이저 유도 중합을 통해 2광자 3D 프린팅을 지시합니다. (C) 생성된 구조는 PDMS 복제본의 반복 제작을 위한 금형으로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 고분자(신경) 세포 배양 PDMS 장치의 자체 고속 프로토타이핑의 예. (A) 마이크로 스케일 적층 제조를 통해 24시간 이내에 CAD 모델에서 3D 프린팅 마스터로 전환할 수 있으며, PDMS와 같은 생체 적합성 엘라스토머가 있는 복제 금형으로 즉시 반복적으로 사용할 수 있습니다. (비씨) 생성된 PDMS 장치는 신경 세포 배양 평면 기질에 결합되며, 여기서는 미세 전극 어레이로 표시됩니다. (A)의 특정 시료 설계에 대해 두 개의 챔버가 정의되는데, 하나는 Source라고 하고 S로 표시하고, 다른 하나는 Target이라고 하며 T로 표시합니다. (D) 각 챔버에 도금된 뉴런은 일련의 마이크로채널을 통해서만 신경돌기를 성장시킬 수 있습니다. (C)의 실체 현미경 유도에 따라 적절하게 정렬되면 두 세트의 기판 통합 미세 전극이 노출된 상태로 남아 두 구획에 위치한 주변 뉴런의 생체 전기적 활성을 자극하고 기록할 수 있습니다. 개별 마이크로 채널 내에서 미세 전극을 정렬하는 것은 이 원리 증명의 우선 순위가 아니었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세포 불투과성 형광 리포터 분자의 실시간 이미징은 세포 도금 후 며칠 동안 뉴런에 의해 길쭉한 신경돌기를 식별합니다. (서기-인도) 도 1 및 도 2 로부터 제작된 소자의 모듈식 신경 배양에 대한 대표적인 컨포칼 형광 현미경 사진(N=4, 128개의 개별 마이크로채널)은 세포 도금 후 2일 및 6일 후에 획득되었습니다. (비-디) 가시성 향상을 위한 현미경 사진의 40배 배율과 반전된 그레이 스케일. Source 및 Target 구획의 마이크로 채널 끝은 각각 S와 T로 표시됩니다. (A) 는 도금 후 6일 후에 Source(즉, 내부 정사각형 영역)와 Target(즉, 외부 영역)이 세포로 가득 찬 배양물의 와이드 스캔 이미지를 보여줍니다. (B) 및 (C) 는 도금 후 2일 후의 더 이른 시점에 각각 마이크로채널의 Source 및 Target 측에서 신경돌기의 성장을 표시합니다. 작은 검은색 삼각형은 축삭돌기 다발 말단으로 추정되는 대표적인 예를 나타내며, 분명히 근원에서만 유래한 것으로 보인다. 화살표 모양의 마이크로 채널의 경계는 가장자리 (B)를 따라 신경돌기의 신장을 가리키며, 여기서 통과가 중단되지 않고 타겟을 향해 안내됩니다. 반대 방향으로, 마이크로채널 (C )의 타겟 엔딩 옆에서, 타겟에서 시작되어 소스 쪽으로 나아가는 신경돌기가 날카로운 모서리에 갇혀 있습니다. (D)는 마이크로채널 내부의 신경돌기 성장의 세부 사항을 추가로 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: PDMS 장치를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 신경 전기 반응의 기능적 특성 분석. MEA는 세포 배양 기질로 사용되었으며 양극성 구성으로 전달되는 매우 짧은(즉, 200μs, 0.8V) 바이페이직 전기 자극 펄스에 의해 유발되는 네트워크 전반의 스파이킹 반응을 측정하는 데 사용되었습니다. 그림 2의 PDMS 소자를 사용하면 소스(빨간색)와 타겟(파란색)에서 기록된 뉴런 스파이킹 반응이 자극이 전달되는 위치에 따라 다릅니다. 추정 축삭, 시냅스 및 통합 지연은 (A) 에서는 분명하지만 (B)에서는 분명하지 않으며, 이는 선호하는 시냅스 연결(즉, 소스에서 타겟까지)이 존재함을 시사합니다. (씨디) 제어 조건(즉, PDMS 장치가 없는 경우)에서 두 개의 서로 다른 MEA 미세 전극 세트에서 검출된 유발 반응은 자극 전달 위치에 의존하지 않습니다. 플롯의 선을 감싸는 옅은 색조의 음영은 평균의 순간 표준 오차를 나타냅니다(N 자극 = 150). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 솔루션 테이블. 제품 설명은 재료 표를 참조하십시오.

보충 코딩 파일 1: STL 설계 파일은 그림 2A에 표시된 구조에 해당합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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