방법 논문

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

DOI:

10.3791/66156

⸱

2023년 12월 22일

 ,  , 
1Department of Translational Neuroscience, College of Human Medicine, Michigan State University, 2Neuroscience Program, Michigan State University, 3Hauenstein Neuroscience Center, Mercy Health Saint Mary’s

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

초록

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축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 것은 기능적 시냅스, 신경 연결성 및 건강한 뉴런을 유지하는 데 중요합니다. 축삭 수송은 여러 신경 퇴행성 질환에서 방해를 받으며, 투영 뉴런은 세포 물질을 장거리로 운반하고 상당한 축삭 질량을 유지해야 하기 때문에 특히 취약합니다. 타우(tau), 아밀로이드-β, α-시누클레인(-synuclein), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase) 및 헌팅틴(huntingtin)을 포함한 여러 질병 관련 단백질의 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미치며, 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 잠재적인 공통 메커니즘을 제공합니다. 이러한 독성 메커니즘을 연구하는 방법은 신경 퇴행성 질환을 이해하고 잠재적인 치료 개입을 식별하는 데 필요합니다.

여기에서 배양된 1차 설치류 해마 뉴런을 여러 플라스미드와 함께 transfection하여 형광 태그가 부착된 화물 단백질의 생세포 공초점 이미징을 사용하여 병리학적 단백질이 빠른 축삭 수송에 미치는 영향을 연구합니다. 우리는 설치류에서 주요 해마 뉴런의 수확, 해리 및 배양으로 시작합니다. 그런 다음 뉴런을 플라스미드 DNA 구조와 함께 transfection하여 형광 태그가 지정된 화물 단백질과 야생형 또는 돌연변이 타우(병리학적 단백질의 예시로 사용됨)를 발현합니다. 축삭돌기는 축삭돌기 초기 분절 단백질인 neurofascin의 세포외 도메인과 결합하는 항체를 사용하여 살아있는 세포에서 식별되며, 축삭 관심 영역을 이미지화하여 형광 화물 수송을 측정합니다.

무료로 사용할 수 있는 ImageJ 매크로인 KymoAnalyzer를 사용하여 병리학적 단백질의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 축삭 이동의 속도, 일시 중지 빈도 및 방향성 화물 밀도를 광범위하게 특성화합니다. 이 방법을 통해 병리학적 타우 단백질의 발현과 관련된 화물 일시 중지 빈도 증가의 표현형을 식별합니다. 또한 유전자 침묵 shRNA 구조를 transfection mix에 추가하여 수송 중단을 매개하는 다른 단백질의 역할을 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 신경퇴행성 질환 관련 단백질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적용할 수 있으며 이러한 단백질이 축삭 수송을 방해하는 메커니즘을 연구하는 재현 가능한 방법입니다.

서론

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뉴런은 기능적 시냅스와 신경 연결성을 유지하기 위해 축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 데 의존합니다. 축삭 수송 결핍은 알츠하이머병(AD) 및 기타 타우병증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및 헌팅턴병을 포함한 여러 신경퇴행성 질환의 발병에 중요한 기여를 하는 것으로 생각됩니다 1,2,3. 실제로, 여러 질병 관련 단백질에 대한 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미친다(4에서 검토). 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 메커니즘을 조사하는 방법을 개발하는 것은 신경퇴행성 질환을 이해하고 치료적 개입을 위한 잠재적 표적을 식별하는 데 필요합니다.

기존의 키네신(kinesin), 운동 단백질을 조절하는 키나아제(kinase) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 의존 경로, 병리학적 단백질이 축삭 이동의 조절을 방해하는 메커니즘의 발견을 포함하여 축삭 수송에 대한 몇 가지 중요한 통찰력은 분리된 오징어 축삭질 모델....

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프로토콜

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이 프로토콜은 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 배경의 Tau Knockout 마우스와 야생형 Sprague Dawley 마우스에 성공적으로 적용되었습니다. 다른 균주도 허용되어야 합니다.

1. 1차 해마 뉴런 수확

  1. 붕산염 완충액(12.5mM 붕산나트륨 데카하이드레이트 및 50mM 붕산)에 여과된 0.5mg/mL 폴리-d-라이신(PDL)으로 4웰 유리 하단 챔버 슬라이드를 코팅합니다. 750 μL/웰을 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 챔버 슬라이드를 멸균 탈이온수로 4번 세척합니다. 마지막 세탁 후 자연 건조하고 단기 보관(<1주)을 위해 4°C에서 보관하십시오.
    알림: PDL은 배양에 유독하므로 세척 전과 세척 사이에 슬라이드에서 건조되지 않도록 하십시오. PDL 코팅 슬라이드를 장기간 보관하면 신경 건강에 영향을 미칠 수 있으며, 코팅과 도금 사이의 간격을 일정하게 유지하면 배양 생존율의 실행 간 변동성이 줄어든다는 사실을 발견했습니다.
  3. 임....

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결과

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이러한 방법을 사용하여 질병12,13에서 병리학적 타우 유발 신경독성의 잠재적 메커니즘을 조사하기 위해 야생형 또는 질병 관련 형태의 타우 단백질이 있는 상태에서 축삭 수송을 특성화했습니다. KymoAnalyzer 소프트웨어는 주어진 폴더 내의 모든 카이모그래프에서 다양한 파라미터를 계산하고 풀링합니다. 운송 요금은 화물이 이동 중일 때(세그먼트 속도)와 일시 중지(순 속도)를 포함한 전체 속도만 계산됩니다. 화물의 양은 총밀도(#tracks/μm) 또는 플럭스(#tracks∙μm-1∙s-1)로 계산됩니다. 런 길이는 개별적으로 계산되거나 결합되어 일시 정지 사이에 이동한 평균 거리를 결정합니다. 화물 일시 중지는 화물이 움직이지 않는 시간(즉, 0.1mm/s< 이동)뿐만 아니라 지속 시간과 빈도로 특징지어집니다. 대부분의 측정값은 전방 및 역행 방향과 합계(양방향 결합)로 계산됩.......

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토론

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다양한 신경 퇴행성 질환과 관련된 여러 병리학적 단백질이 뉴런의 빠른 축삭 수송을 방해한다는 증거가 증가하고 있습니다. 이는 이러한 질병 전반에 걸쳐 신경독성의 잠재적인 공통 메커니즘을 나타냅니다. 이러한 단백질이 수송을 방해하는 과정을 더 잘 이해하려면 특정 질문을 해결할 수 있는 도구와 모델이 필요합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 설치류의 일차 해마 뉴런에서 화물 운송에 부정적인 영향을 미치기 위해 병리학적 단백질에 의해 관여하는 메커니즘을 검사할 수 있습니다.

일차 뉴런은 빠르게 축삭 수송 조절의 모든 기능적 측면을 유지하면서 쉽게 조작할 수 있는 시스템을 제공합니다. 뉴런의 리포솜 기반 transfection은 특별히 효율적이지 않지만(일반적으로 5-15개의 transfection된 뉴런/웰을 관찰함) 다른 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 상대적으로 낮은 효율성으로 인해 사용자는 고립된 뉴런.......

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이러한 프로토콜의 여러 측면을 개발하고 최적화하기 위해 노력한 Chelsea Tiernan과 Kyle Christensen에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금 R01 NS082730(N.M.K.), R01 AG044372(N.M.K.), R01 AG067762(N.M.K.) 및 F31 AG074521(R.L.M.)의 지원을 받았습니다. NIH/National Institute on Aging, Michigan Alzheimer's Disease Research Center Grant 5P30AG053760(NMK 및 BC); Peer Reviewed Alzheimer's Research Program Award W81XWH-20-1-0174 (BC)를 통한 국방부 보건 담당 차관보실; 알츠하이머 협회 연구 보조금 20-682085(BC); 그리고 Secchia Family Foundation (NMK).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4% Trypan blueGibco15250-061
1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브DOTRN1700-GMT
2.5% 트립신Gibco15090-046
3mL 주사기(21G 바늘 포함) Fisher14-826-84
10mL 플라스틱 주사기Fisher14-823-2A
14G 니들Fisher14-817-203
15G 바늘MedlineSWD200029Z
16G 바늘Fisher14-817-104
18G 바늘Fisher14-840-97
22G 바늘Fisher14-840-90
32% 파라포름알데히드Fisher50-980-495
AlexaFluor 647 염소 안티 토끼 IgG (H+L)InvitrogenA21244RRID:AB_2535813
Amphotericin BGibco15290-026
Arruga 마이크로 배아 캡슐 포셉스, 곡선형; 4" RobozRS-5163오토클레이브
B-27 보충제 (50개), 무혈청GibcoA3582801
BioCoat 24-웰 폴리 D 라이신 플레이트 Fisher08-774-124
붕산SigmaB6768-1KG
염화칼슘SigmaC7902
Castroviejo 3 1/2" 길이 8 x 0.15mm 각도 날카로운 가위RobozRS-5658오토클레이브
세포 계수 장치자동 또는 수동
라이브 셀 챔버 부착이 있는 컨포칼 현미경
컨 포칼 이미징 소프트웨어
D - (+) - 포도시그마G7528
DNase I (Worthington)피셔NC9185812
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco14200-075
EGTA피셔O2783-100
치명적 플러스 솔루션Vortech Pharmaceuticals, LTDNDC 0298-9373-68소듐 펜토바르비탈; 다른 승인된 안락사 방법을 사용할 수 있습니다 
소 태아 혈청Invitrogen16000044
Gentamicin 시약 용액Gibco15710-072
GlutaMAXGibco35050-061글루타민 대체체
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco24020-117
ImageJ 버전 1.51nImageJLife-Line 버전 2017 5월 30일:
https://imagej.net/software/fiji/downloads KymoAnalyzer (버전 1.01)Encalada LabPackage에는 6가지 매크로가 모두 포함되어 있습니다: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000Invitrogen100022050P3000 transfection enhancer 시약과 함께 사용
염화마그네슘Fisher AC223211000
MES 수화물SigmaM8250
마이크로 해부 가위 3.5" 스트레이트 샤프/샤프RobozRS-5910오토클레이브
Neurobasal Plus 매체GibcoA3582901
Neurofascin (A12/18) 마우스 IgG2aUC Davis/NIH NeuroMab75-172RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; 쥐 뉴런이 아닌 쥐 뉴런에서 작용
Neurofascin 186 (D6G60) 토끼 IgG세포 신호15034RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; 마우스 뉴런에서 작동, 우리는 쥐 뉴런에서 테스트하지 않았습니다
신생아 송아지 혈청Gibco16010-167
Opti-MEMGibco31985-062
P3000Invitrogen100022057
페트리 접시, 100 x 10 mm 유리Fisher08-748B해부용; 오토클레이브
페트리 접시, 100 x 20 mm 유리Fisher08-748D자궁 뿔을 넣기 위해; 오토클레이
Poly-D-lysineSigmaP7886-100MG
폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브(15mL)Fisher14-955-238
폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브(50mL)Fisher14-955-238
염화칼FisherP217-500
아세트산나트륨SigmaS5636
나트륨 붕산염 10 수화물VWRMK745706
직선 블레이드 작동 가위 무딘 / 날카로운Fisher13-810-2오토 클레이브
주사기 필터, 0.22 µ mVWR514-1263
엄지 드레싱 펜치, 톱니, 4.5"RobozRS-8100오토클레이브
&마이크로; 슬라이드 4 웰 유리 바닥Ibidi80427
당 . 브 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms. Front Neurosci. 11, 572(2017).
  2. Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. Tau and axonal transport m....

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1KymoAnalyzer

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