방법 논문

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

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DOI:

10.3791/66164

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2024년 7월 12일

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

이 논문에서

요약

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

초록

종양 행동에 대한 생체 내 연구는 암 연구의 필수 요소입니다. 그러나 마우스의 사용은 비용과 시간면에서 상당한 문제를 야기합니다. 여기에서는 애벌레 제브라피시를 쥐 모델에 비해 취급 용이성, 저렴한 비용, 짧은 실험 기간 등 많은 장점이 있는 이식 모델로 제시합니다. 더욱이, 유충 단계에서 적응 면역 체계가 없기 때문에 면역 결핍 균주를 생성하고 사용할 필요가 없습니다. 제브라피시 배아에서 이종 이식을 위한 확립된 프로토콜이 존재하지만, 여기서는 더 빠른 전달을 위한 배아 병기 결정, 생존 분석 및 질병 부담을 평가하기 위한 유세포 분석의 사용과 관련된 개선된 방법을 제시합니다. 배아는 유충의 난황에 빠른 세포 주입을 용이하게 하고 주입된 세포 볼루스의 일관성을 모니터링하기 위해 세포 마킹을 촉진하기 위해 병기를 결정합니다. 주입 후, 배아 생존 분석은 주입 후 최대 7일(dpi)까지 평가됩니다. 마지막으로, 형광 단백질로 전달된 세포를 마킹하고 유세포 분석으로 분석하여 질병 부담을 평가합니다. 유세포 분석은 제브라피시 배아에서 세포 현탁액을 준비하는 표준화된 방법을 통해 가능하며, 이는 제브라피시 세포의 1차 배양을 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 절차를 사용하면 연구 군당 더 많은 수의 동물을 대상으로 생체 내 종양 세포의 거동을 보다 신속하게 평가할 수 있으며 보다 비용 효율적인 방식으로 수행할 수 있습니다.

서론

생체 내에서 유전자 변형 또는 약물 치료에 반응하는 종양의 거동 분석은 암 연구의 필수 요소입니다 1,2,3,4. 이러한 연구는 대부분 면역력이 저하된 마우스(Mus musculus) 모델5의 사용을 포함한다. 그러나 마우스에 대한 이종 이식 연구는 제한된 용량, 연장된 기간, 상당한 비용 및 내부 종양의 진행을 모니터링하기 위한 정교한 이미징 장비의 요구 사항을 포함하여 여러 측면에서 제한적입니다 6,7. 이와는 대조적으로, 제브라피시 모델(Danio rerio)은 더 큰 용량, 더 짧은 기간, 더 낮은 비용, 그리고 투명성으로 인해 질병 진행에 대한 간단한 모니터링을 가능하게 한다 8,9.

제브라피쉬는 자궁 외에서 발달하고 번식력이 높은 잘 발달된 척추동물 모델 시스템으로, 개별 암컷은 100개 이상의 배아를 생산한다10. 또한 제브라피시 배아는 투명하여 리포터와 같은 형광 관련 기술을 사용하여 발달 과정을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, 중요한 발달 과정의 보존은 이식된 악성 세포의 행동을 포함한 많은 유형의 연구에 이상적인 모델이 됩니다11,12. 야생형 제브라피시 배아는 멜라닌 세포를 발달시켜 생후 2주가 되면 광학적으로 불투명하게 만들지만, 이는 캐스퍼 배아의 생성에 의해 극복되었습니다(RoyA9; MITFAW2), 평생 동안 투명하게 유지됩니다13. 그들의 광학적 특성 때문에, 캐스퍼 제브라피쉬는 이식된 종양 세포의 이상적인 수용체이다 14,15,16. 종양 세포를 제브라피쉬에 이종이식하는 것은 지난 2년 동안 중요성을 얻었습니다 17,18,19,20,21. 제브라피시 배아는 선천성 면역을 가지고 있습니다. 그러나 유충 단계에서는 적응 면역이 부족하여 기능적으로 면역력이 저하되어 이식된 종양 이종이식의 효과적인 숙주 역할을 할 수 있습니다22.

제브라피시 배아뿐만 아니라 성체의 종양 생착을 위한 프로토콜이 개발되었으며, 여러 가지 다른 변수를 고려했습니다 23,24,25,26,27. 이들은 제브라피쉬의 수많은 종양 침착 부위를 조사했으며, 여기에는 난황, 유리관 주위 공간 및 심장에 주입하는 것과 다양한 발달 단계가 포함된다16,28. 제브라피시 이종이식의 경우 제브라피시 사육은 일반적으로 28°C에서 이루어지는 반면 포유류 세포는 37°C에서 성장하기 때문에 양식의 주변 온도도 중요합니다. 결과적으로, 어류가 견딜 수 있으면서도 종양 성장을 지원하는 절충 온도를 사용해야 하며, 34°C는 두 가지 목표를 모두 달성하는 것으로 보인다29. 이종 이식 후 종양의 행동 및 진행을 분석하는 것은 또 다른 주요 초점 영역이며, 여기에는 생존 분석뿐만 아니라 다양한 이미징 양식의 사용이 포함됩니다30. 제브라피시 모델의 주요 장점 중 하나는 종양 행동에 대한 생체 내 연구에 엄청난 통계적 힘을 제공하기 위해 많은 수의 연구 동물을 사용할 수 있다는 것입니다. 그러나 이전 접근 방식은 주입을 위한 지루한 장착 절차가 필요하기 때문에 이러한 잠재력을 심각하게 제한했습니다.

여기에서는 투명한 캐스퍼 제브라피시 라인을 사용하여 높은 처리량과 주입 품질을 모니터링할 수 있는 간단하고 빠른 배아 선별 방법의 개발을 통해 이러한 한계를 해결합니다. 이것은 수정 후 2일(dpf)에 캐스퍼 제브라피시 배아의 난황낭에 이종이식편을 주입하는 것을 수반합니다. 우리는 종양 행동 분석의 일환으로 이종 이식 후 배아의 생존을 관찰합니다. 또한 이종 이식 후 단일 세포 현탁액을 만들고 유세포 분석법으로 분석하여 질병 부담을 평가하는 방법을 보여줍니다(그림 1).

프로토콜

제브라피시의 유지, 먹이 및 사육은 기술된 바와 같이 28.5°C의 표준 양식 조건 하에서 이루어졌다31. 모든 제브라피시 관련 실험은 이 온도에서 수행되었습니다. 그러나, 이종 이식 후, 동물은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 절차에 따라 실험 기간 동안 34°C에서 배양했습니다.

1. 사육 (주입 3 일 전)

  1. 번식 일주일 전에 물고기 쌍에게 건조 사료(추가 사료, 물고기 한 마리당 5-6개의 과립)를 제공하여 동물의 건강을 극대화하고 번식 쌍에 의해 생산되는 배아의 수를 늘리십시오.
  2. 배아 채취 전날 저녁, 수컷과 암컷 물고기를 분리하는 칸막이가 있는 사육 탱크에 번식 동물을 설치하고 각 수컷당 2마리의 암컷의 하렘 짝짓기를 사용합니다.
    참고: 팔당 100마리의 동물로 구성된 4개 팔로 실험하는 경우 실험당 20쌍의 번식 쌍을 사용합니다. 필요한 번식 쌍의 수를 결정하기 위해 좋은 추정치는 캐스퍼 번식 쌍당 50개의 배아입니다. 또 다른 옵션은 보다 강력하고 색소가 있는 제브라피시 균주를 사용하고 색소 침착을 방지하기 위해 1-페닐 2-티오우레아(PTU)로 처리하는 것이다31. 실제로, 주입 후 1일(dpi)에 원하는 수의 두 배를 주입할 수 있는 충분한 배아를 갖도록 실험을 확장해야 합니다.

2. 배아 채취 (주사 2일 전)

  1. 다음날 아침에 칸막이를 제거하여 물고기가 번식할 수 있도록 합니다.
  2. 칸막이를 제거한 후 20분(분) 후에 탱크의 배아를 시각화합니다.
  3. The Zebrafish Book31에 설명된 대로 만든 배아 물이 들어 있는 90mm 페트리 접시에 체를 사용하여 배아를 수집합니다.
    1. 배아수를 만들려면 증류수 1L에 원염 1.5mL를 넣고 메틸렌 블루를 0.1% 최종 첨가합니다. 증류수 40L에 바다 소금(재료 표) 1g을 녹여 원액을 만듭니다. 배아수의 이온 조성은 K+ (0.68mg/L), Cl- (31.86mg/L), Na+ (17.77mg/L), SO4− (4.47mg/L), Mg2+ (2.14mg/L) 및 Ca2+ (0.68mg/L)입니다.
  4. 제브라피시가 한 시간 더 번식하도록 하고 결과 배아를 수집합니다.
  5. 실험을 위해 배아를 풀링합니다.
  6. 저녁에는 비정상적인 형태로 인식할 수 있는 수정되지 않았거나 죽은 배아를 모두 제거하고 신선한 배아 물을 제공합니다.

3. 주입을 위한 배아 유지 및 도구 준비(주입 1일 전)

  1. 다음 날 아침, 죽은 배아를 추가로 제거하고 신선한 배아 물을 제공합니다.
  2. 배아수에서 1.5% 아가로스를 가열하여 아가로스 플레이트를 준비하고 가열된 혼합물을 90mm 페트리 플레이트에 붓습니다. 90mm 접시 하나에는 30-35mL의 혼합물이 필요합니다.
  3. 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관(붕규산염)에서 필라멘트가 아닌 바늘을 잡아당깁니다. 바늘은 (열 압력 하에서) 당겨져 닫힌 끝을 생성합니다. 최적의 구멍을 생성하기 위해 집게로 클립하십시오. 단위 시간당 변위된 유체의 부피를 결정하여 바늘 오리피스의 적합성을 평가합니다(아래 섹션 6.3 참조).
    알림: 유리 모세관은 중앙 필라멘트의 유무에 관계없이 구입할 수 있습니다. 중앙 필라멘트가 없는 모세관은 세포 주입에 선호됩니다.
  4. 사용할 때까지 점토(어린이 모델링 점토)를 사용하여 만든 홈의 덮인 90mm 페트리 판에 바늘을 놓습니다(그림 2A).

4. CM-Dil을 이용한 백혈병 세포의 준비 및 표지 (주사 당일)

  1. 이식할 세포를 성장에 최적의 조건에서 유지합니다. 여기에 사용된 쥐 백혈병 세포는 충분하거나 둘 중 하나였다(M82; Rpl22+/+) 또는 결핍(M109; Rpl22-/-)는 종양 억제인자(32)로 기능하는 리보솜 단백질 Rpl22에 대한 것이다.
  2. 50mL 원뿔형 튜브의 펠릿 세포. 계수한 다음 실온(RT)에서 300 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
    참고: 필요한 셀의 수는 실험 범위와 조건에 따라 결정되지만 1 x 106 셀이 좋은 시작점입니다.
  3. CM-Dil 염색 수행
    참고: CM-Dil 염색을 통해 주입 볼루스를 모니터링할 수 있습니다.
    1. 50 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO; 1 mg/mL 또는 ~1 mM final)에 50 μg의 CM-Dil 바이알을 재현탁하여 CM-Dil의 원액을 만듭니다.
    2. 사용할 세포에 필요한 보조 보충제가 포함된 1% 소 태아 혈청(FBS)/행크 균형 소금 용액(HBSS)에 스톡(염색액/mL 4.8μL)을 희석하여 작동하는 용액을 생성합니다.
  4. 염색제의 작업 용액에서 1 x 106/100 μL의 세포를 재현탁시킵니다.
  5. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 염색 조건은 사용된 세포(시간 등)에 맞게 최적화되어야 합니다. 여기에 사용된 세포는 최적의 염색을 달성하기 위해 서로 다른 온도에서 10분 동안 두 번의 뚜렷한 배양이 필요했습니다.
  6. 실온(RT)에서 1x HBSS 10mL로 세척합니다.
  7. 펠릿 셀(RT에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리), 상층액을 디캔팅한 다음 10mL의 HBSS로 재현탁하고 두 번째 세척을 위해 동일한 과정을 반복합니다.
  8. 염색된 종양 세포를 1% FBS/PBS 및 필요한 보조 보충제에서 40,000 cells/μL로 재현탁하고 주입할 때까지 세포 현탁액을 34°C로 유지합니다.
    참고: 이 연구에 사용된 세포주(예: 1% FBS 및 사이토카인)의 유지를 위해 보조 보충제가 필요했습니다. 보충제 및 이종 이식은 연구 중인 특정 세포주에 맞게 조정해야 할 수 있습니다. 노른자의 잠재적인 독성을 피하기 위해 매체 대신 PBS를 선택했습니다.

5. 탈색(聖化)

  1. 광학 현미경에서 2배 확대하여 인슐린 주입 주사기를 사용하여 2dpf에서 캐스퍼 제브라피시 배아를 수동으로 분리합니다. 한쪽 바늘로 융모막을 뚫고 다른 바늘을 사용하여 융모막을 고정합니다.
    참고: 탈막화를 위해 프로나스를 사용하는 것은 때때로 배아 건강을 감소시키기 때문에 권장되지 않습니다. 2 dpf에서 배아를 탈립하는 것이 더 쉽고, 배아가 이전 시기(1 dpf)보다 덜 취약하기 때문에 선호됩니다.
  2. 탈막염하는 동안 바늘로 배아를 만지지 않도록 주의하십시오. 부주의로 바늘에 닿아 배아의 노른자를 만지거나 손상시키면 사망에 이를 수 있습니다.
  3. 배아 수분을 교체하여 벗겨진 융모를 제거합니다.

6. 마이크로인젝터와 니들 설정

  1. 마이크로인젝터와 펌프를 켜고 세포의 미세인젝션에 적합한 조건을 설정합니다. 9-11psi의 사출 압력과 0.5초(초)의 주입 시간은 바늘을 자르고 오리피스를 설정하기 위한 좋은 시작점입니다.
  2. 종양 세포주 현탁액(~5 μL)을 한 번에 마이크로니들에 조심스럽게 로드하여 바늘 내부의 세포 흐름을 방해하는 기포가 형성되지 않도록 합니다.
  3. 집게(Dumont 번호 5)로 바늘 끝을 잘라 0.2-0.3초당 10-15나노리터(nL)의 세포 현탁액을 배출할 수 있는 오리피스를 생성합니다.
    참고: 위의 nL 부피 계산은 1mm = 30nL인 보정 모세관을 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해서 시간을 0.5초로 설정하고 바늘을 자를 때마다 주입을 누르고 보정 모세관의 부피를 수집합니다. 그런 다음 현미경으로 눈금을 사용하여 수집 된 부피의 길이를 측정하고 0.5 초에 30nL를 주입하면 바늘 자르기를 중지합니다. 그런 다음 주입 시간을 0.2-0.3초로 설정합니다(~10-15nL의 세포 주입).

7. 주사를 위한 배아 준비

  1. 현미경으로 건강한 배아를 선택하고 심장 부종이나 짧거나 구부러진 몸통과 같은 발달 이상이 있는 배아를 추려냅니다.
  2. Tricaine methanesulfonate(MS-222, 배아 물 0.16g/L)를 90mm 페트리 플레이트에서 1분 동안 사용하여 배아를 마취합니다.
  3. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 집습니다. 10-15개의 배아를 1.5% 아가로스 플레이트의 측면 위치에 배열합니다(그림 2B-D).
  4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 과도한 물을 제거하고 배아를 살아 있게 유지하는 데 필요한 최소한의 배아 수분을 남겨 둡니다.

8. 주입 절차

  1. 광학 현미경으로 관찰하여 바늘 끝에 세포가 축적되었는지 확인합니다.
  2. 보정된 바늘을 사용하여 배아의 노른자에 0.2-0.3초(10-15nL는 400-600개 세포에 해당) 동안 배아를 주입합니다.
  3. 모든 배아에 대해 주입을 반복한 다음 신선한 배아 물에 채취합니다.
    참고: 세포가 바늘 끝에 축적되는 경향이 있기 때문에 15-20회 주입할 때마다 바늘 끝을 약간 잘라야 합니다. 또한 유사한 부피가 주입되도록 각 클리핑할 때마다 압력과 시간을 재설정해야 합니다.
  4. 두 개의 서로 다른 전달된 세포 세트의 거동 비교가 유효한지 확인하려면 전달된 세포의 볼루스를 모니터링하십시오. 주입 후 1시간(hpi)에 CM-Dil 염색(RFP 채널에서)을 기반으로 배아를 분류하여 최적의 염색("양호한 볼루스")을 가진 배아와 열등한 염색("하급 볼루스")을 가진 배아를 분리하여 이를 수행합니다. 그림 3, 노란색 화살표).
  5. 열등한 볼루스가 있는 배아를 폐기하거나 질병 진행에 대한 다른 세포 용량의 영향을 평가하는 데 사용합니다.
  6. 하루가 끝날 때까지 죽은 배아를 제거해야 하는데, 그 이유는 배아의 죽음이 종양 성장보다는 주사 외상과 관련이 있기 때문입니다. 세포가 주입 부위 밖으로 누출되었을 가능성이 있으므로 세포가 유지되지 않는 배아를 분석에서 제거합니다.
  7. 주입된 배아를 플레이트당 ~60개의 배아가 있는 90mm 접시에서 실험 기간 동안 34°C에서 유지합니다.
    참고: 5 dpf 후에는 성장하는 배아가 노른자를 소모하므로 실험 기간 동안 배아에 파라메슘 식품을 제공해야 합니다. 적절한 영양 공급을 위해 파라메시아는 매일 6dpf(4dpi)에서 9dpf(7dpi)까지 배아에 투여해야 합니다. Paramecia는 기술된 바와 같이 최적의 영양 및 온도 조건 하에서 플라스크에서 배양하여 증식된다31.

9. 생존 분석

  1. 다음 7dpi 동안 배아를 모니터링하여 매일 배아 물을 교체합니다. 연구에 약물 치료가 포함된 경우 편의를 위해 물 교체를 격일로 줄일 수 있습니다.
  2. 배아의 건강 상태를 확인하고 분석 기간 동안 사망을 점수화합니다.
    참고: 이 실험의 실험 기간은 7일이었지만 이종 이식된 종양의 공격성에 따라 더 짧거나 더 길어질 수 있습니다.
  3. CM-Dil 형광을 사용하여 질병 부담을 평가하고(그림 4A) Kaplan Meier 분석을 사용하여 유전자 변형 또는 약물 치료가 생존에 미치는 영향을 측정하고 그래픽으로 묘사합니다(예: GraphPad Prism; 그림 4B) 33.

10. 유세포 분석을 위한 배아의 단세포 현탁액

참고: 질병 부담은 이종 이식 후 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 그러나 그렇게 하려면 종양 세포에 지울 수 없는 표시가 필요합니다. 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 적색 형광 단백질(RFP) 또는 mCherry는 녹색 형광 단백질의 신호를 가리는 제브라피시 세포의 자가형광에 대해 좋은 신호를 제공하기 때문에 효과적입니다.

  1. 선택한 dpi 단계에서 배아를 분리합니다. 여기에 5dpi가 표시됩니다(그림 5).
  2. 조건당 30-40개의 배아를 시작점으로 채취하지만, 이식된 세포의 병기와 공격성에 따라 배아 수가 다를 수 있습니다. 위에서 설명한 대로 배아를 마취합니다.
    참고: 배아는 여기에 표시된 것처럼 통계적 유의성을 제공하기 위해 복제로 세분화될 수 있습니다(그림 5B).
  3. 배아를 1.5mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
  4. 검체당 100μL의 무칼슘 링거 용액(레시피31)을 사용하여 노른자를 녹입니다. 칼슘이 낮으면 배아 조직이 부드러워져 보다 효과적인 조직 해리가 가능하기 때문입니다.
  5. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 노른자를 제거하기 위해 5분 동안 간헐적으로 위아래로 피펫팅합니다.
  6. 0.05% 트립신/PBS(페놀 빨간색 지시약 제외)를 29°C로 예열하고 트립신 용액 mL당 27μL의 콜라겐분해효소 IV(100mg/mL)를 보충합니다. 배아의 각 샘플에 대해 1mL의 용액이 필요합니다.
  7. 디올렉된 배아의 각 샘플에 트립신/콜라겐분해효소 용액 1mL를 추가하고 29°C에서 30-35분 동안 배양합니다.
  8. 배아(골격)의 구조가 더 이상 보이지 않을 때까지 5분마다 5mL 피펫 팁을 사용하여 이 용액에서 배아를 위아래로 피펫팅합니다.
  9. 200 μL의 FBS를 사용하여 반응을 중지합니다.
  10. 잘 섞고 29°C에서 추가로 5분 동안 배양하여 트립신이 완전히 비활성화되도록 합니다.
    참고: 37°C에서 발생하는 열 충격으로 인한 제브라피시 세포의 사멸을 방지하기 위해 조직 해리 프로토콜에 29°C의 온도가 사용됩니다. 그러나 제브라피시 세포의 보존이 필요하지 않은 경우 37°C에서 분해를 수행할 수 있습니다.
  11. 세포 현탁액을 300 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛하고 상층액을 버립니다.
  12. 세포 펠릿을 4 °C PBS에 재현탁시키고 위와 같이 펠릿을 재현탁시킵니다.
  13. 세척을 반복한 다음 70μm 세포 여과기를 통해 세포를 변형시킵니다.
  14. 펠렛을 만들고 유세포 분석을 위한 염색을 진행합니다.
    참고: 1차 제브라피시 세포의 배양이 필요한 경우 4°C PBS로 두 번 더 세척하고 L15 배지(항생제 및 10% FBS 포함)에 재현탁시킵니다.

11. 형광 활성화 세포 분류(FACS): 이종 이식 세포의 염색 및 분류

  1. 염색 배지(1% FBS가 포함된 HBSS)와 펠릿에 세포 현탁액을 재현탁시키고 300 x g 에서 5분 동안 재현탁합니다.
  2. 이식된 세포와 반응하는 항체로 염색 배지에 세포 펠릿을 재현탁시켜 이식된 세포를 제브라피시 세포와 구별할 수 있는 두 번째 마커(RFP 또는 mCherry 외에)를 제공합니다. 여기서 샘플당 50μL의 항마우스 CD45(APC-CD45)를 1:50 희석하여 사용했습니다(그림 5).
  3. 4 °C에서 20 분 동안 배양한 후 위와 같이 염색 배지 1 mL로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
  4. 상층액을 버린 후 세포 펠릿을 필수 염료 Helix NP Blue(1μM)가 포함된 200μL의 염색 매체에 재현탁시키면 생사를 구별할 수 있습니다.
  5. 유세포 분석을 위해 세포 혼합물을 5mL의 둥근 바닥 폴리카보네이트 튜브로 옮깁니다.
    참고: 종양 세포 대조군을 병렬로 염색하면 유세포 분석 중에 게이트를 명확하게 그릴 수 있습니다.

12. 유세포 분석

  1. 낮은 유속(초당 500 이벤트 이하)을 사용하여 사용할 수 있는 유세포 분석기를 켜서 파라미터를 설정합니다.
  2. 종양 세포 제어(이종 이식에 사용되는 것과 동일한 세포)를 사용하여 FSC(순방향 산란), SSC(측면 산란), BV421/CasB(생존도), CE-594(mCherry) 및 APC(CD45.2) 채널에 대한 전압을 설정합니다.
    참고: 단일 염색된 샘플은 별개의 염색 간에 형광 색소 중복을 제거하는 보정 설정을 설정하는 데 필요합니다.
  3. 주입되지 않은 배아 샘플을 사용하여 이식된 세포와 제브라피시 세포를 모두 수용할 수 있는 설정을 설정합니다.
  4. 유속을 초당 8,000개 이벤트로 늘리고 각 샘플에 대해 1백만개 이벤트를 기록합니다.
  5. 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 결과 데이터를 분석하고, 먼저 FSC-H v/s FSC-A(높이 v/s 면적)를 플로팅하여 단일항을 선택한 다음 생존 가능한 세포를 선택하기 위한 플롯을 선택합니다. FlowJo 소프트웨어는 이러한 분석에 널리 사용됩니다.
  6. 종양 세포 대조군을 사용하여 FSC-A v/s SSC-A로 이식된 세포 주위에 게이트를 그린 다음 지시자 염색(이 경우 CD45 및 mCherry)을 사용합니다(그림 5B).
    참고: 종양에 대해 선택된 크기 게이트에는 질병 부담의 정상화 및 결정을 위한 기초를 제공하는 제브라피시 세포도 포함됩니다.
  7. 위와 동일한 게이트 설정을 사용하여 배아 샘플을 분석합니다. 종양 염색 및 형광 단백질 지시약의 최종 플롯은 질병 부담의 척도를 제공합니다(그림 5C).
    참고: 여기에서, 질병 부담의 차이는 양호한 주입 세포 덩어리를 받은 배아와 열등한 덩어리를 받은 배아에 대해 표시되었습니다.
  8. 필요한 경우 다운스트림 분자 분석을 위해 유세포 분석으로 배아의 종양 세포를 분류합니다.

결과

이종장기이식
그림 1에는 배아 생산부터 유세포 분석을 통한 생존 및 질병 부담 분석을 통한 질병 진행 평가에 이르기까지 전체 실험 및 분석에 대한 포괄적인 관점이 나와 있습니다. 이 접근법은 이종 이식의 재현성과 확장성을 향상시킬 뿐만 아니라 질병 부담을 평가하는 새로운 방법을 추가하는 몇 가지 개선 사항을 제공합니다. 이러한 실험의 성공 여부는 이식된 세포의 건강 상태에 크게 좌우되는데, 건강하지 않고 로그 단계에 있는 세포는 이식 시 증식에 실패하기 때문입니다. 주입 세션의 지속 시간도 중요한 매개 변수입니다. 종양 세포를 준비한 후에는 3-4시간 이내에 제브라피시에 주입을 완료하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 사용된 접근 방식은 아가로스 플레이트에서 직접 옆으로 병기를 결정하고 난황에 주입하는 간단한 수정을 통해 이 기간 동안 더 많은 수의 배아를 주입할 수 있습니다(그림 2C, D). 더욱이, 충분한 세포(400-600개의 세포)가 주입될 수 있도록 최적의 바늘 오리피스를 선택하는 것이 필수적이지만, 오리피스가 배아가 손상될 정도로 크지 않아야 합니다. 또 다른 고려 사항은 사출 압력입니다. 우리는 12-13psi보다 큰 압력이 배아의 난황을 파괴하여 죽음을 유발한다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 이 절차에 내재된 또 다른 변동성은 주입의 일관성입니다. 주입할 세포가 주사 바늘 끝에 가라앉기 때문에 주입 볼루스를 정밀하게 제어하기가 어렵습니다. 세포가 이종 이식되면 모든 배아가 동일한 주입 볼루스를 받을 수 있지만 실제로는 그렇지 않습니다(그림 3). 전달되는 세포의 수는 종양 세포의 행동(예: 응집)과 작업자의 기술 수준에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 당사는 CM-Dil 염색/mCherry 라벨링을 통해 이러한 불확실성을 해결했으며, 이를 통해 적절하고 일관된 세포 볼루스를 받은 동물과 열등한 볼루스를 투여받은 동물의 주입 후 분류를 할 수 있습니다. CM-Dil 염색은 형광 단백질로 더 효과적으로 마킹할 수 있으며, 현미경 또는 유세포 분석을 통해 질병 진행을 쉽게 모니터링할 수 있는 추가적인 이점이 있습니다(그림 4 및 그림 5).

종양 거동 분석
RFP에 초점을 맞춘 간단한 형광 현미경 검사를 사용하여 종양 진행을 쉽게 모니터링할 수 있습니다(그림 4A). 마찬가지로, 전통적인 생존 모니터링은 Kaplan-Meier 분석(Log-rank 및 Wilcoxon test)으로 수행할 수 있습니다(그림 4B). 인상적이게도, 일반적으로 연구 군 당 8-10마리의 동물이 있는 마우스 기반 이종 이식 연구와 달리, 여기에 설명된 제브라피시 방법을 사용하면 각각 60마리 이상의 동물로 연구 군을 달성하는 것이 어렵지 않습니다(그림 4B). 이는 in vivo 연구의 분해능을 현저하게 향상시킵니다. 마지막으로, 유세포 분석을 사용하여 질병 부담 분석을 위한 또 다른 접근법을 구현했습니다. 이는 동일한 수의 배아를 파괴하고 유세포 분석을 통해 결과적으로 발생하는 단일 세포 현탁액의 종양 세포 함량을 분석하는 것을 수반합니다. 종양 특이적 세포 표면 마커와 형광 단백질 지시약을 결합함으로써 이종 이식된 마우스/인간 세포는 질병 부담을 평가하기 위한 접근 방식으로 유세포 분석으로 자신 있게 식별할 수 있습니다(그림 5). 이를 위해 적색 형광 단백질이 우수한데, 이는 녹색 형광 단백질이 숙주 제브라피시 세포의 자가형광에 대한 신호를 제공하지 못했기 때문입니다. 여기에서 mCherry는 CD45와 함께 FACS 분석을 위한 이종 이식 과정을 통해 세포 라벨링 및 모니터링에 사용되었습니다. 이중 표지를 통해 양호한 볼루스 접종과 열등한 볼루스 접종 간의 종양 부담 차이를 측정할 수 있었습니다(그림 5B,C).

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그림 1: 전체 이종 이식 및 주입 후 분석 절차의 개략도. (A) 번식 설정, 배아 수집 및 수정 후 2일(DPF) 형태가 도식화됩니다. (B) 제브라피시 배아의 노른자에 이종 이식을 위한 백혈병 세포의 준비, 염색 및 주입. (C) 생존 및 유세포 분석을 포함한 이종 이식 후 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 주입에 사용된 도구의 대표 이미지. (A) 페트리 플레이트에서 당겨진 바늘. (B) 배아 병기를 위한 아가로스 플레이트. (씨,디) 배아 로딩 플레이트에 주입하기 위해 스테이징된 배아(패널 C의 대표 다이어그램과 패널 D의 실제 배아(빨간색으로 표시))를 보여주는 플레이트. 패널 D의 오른쪽 하단 모서리에 있는 삽입은 스테이지된 배아의 더 높은 배율 보기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 이종 이식 배아의 대표 이미지. 명시야 및 면역 형광 이미지는 1dpi에서 캐스퍼 배아의 노른자에 있는 CM-Dil 염색(빨간색) 양성 세포를 보여줍니다(클러치 이미지). 하부 볼루스가 있는 배아는 노란색 화살표로 표시되고 형태가 불안정한 배아는 별표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 형광 이미징 및 생존 분석을 통한 질병 진행 평가. (A) 4 dpi 및 7 dpi에서 이종 이식 배아의 대표 이미지. (B) 유전적으로 구별되는 두 개의 백혈병 계통을 가진 배아의 생존 분석을 보여주는 Kaplan Meier 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 이종 이식된 제브라피쉬의 질병 부담에 대한 유세포 분석. (A) 세포 현탁액 및 유세포 분석 준비의 개략도. 간단히 말해서, 4dpi의 배아는 트립신과 콜라겐분해효소를 사용하여 단세포 현탁액으로 분해된 후 유세포 분석이 수행됩니다. (B) 각 패널의 왼쪽 이미지는 FSC-A v/s SSC-A 플롯이고 오른쪽 이미지는 CD45 v/s mCherry 신호인 유세포 분석을 위한 대표 플롯입니다. (C) 주입되지 않은 배아, 양호한 배아 및 열등한 배아에 대한 CD45 v/s mCherry plot에서 얻은 이종 이식 세포에 대한 세포 통계를 보여주는 막대 그래프(각 복제에 대해 n = 45, 40 및 40; p 값 * ≤ 0.05, GraphPad Prism 9에서 Welch의 보정과 함께 unpaired t-test를 사용하여 계산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제브라피시 이종 이식은 마우스 연구에 대한 빠르고 강력하며 비용 효율적인 대안으로 부상했습니다12. 제브라피시 이종 이식에 대한 몇 가지 접근 방식이 보고되었지만, 우리의 적응은 상당한 개선을 가져왔습니다. 절차와 관련된 매개변수를 표준화하는 것 외에도 이러한 개선은 특히 종양 주입을 수행할 수 있는 속도를 가속화하는 데 중점을 두어 연구 그룹당 동물 수를 늘리고 종양 라벨링을 사용하여 주사 품질 및 주사 후 행동을 모니터링할 수 있습니다.

여기에 설명된 이 방법의 개선은 큰 잠재력을 가지고 있지만 이 전략을 성공적으로 실행하려면 숙련된 실무자와 특정 응용 프로그램에 대한 최적화가 필요합니다. 우리는 백혈병 세포를 사용했습니다. 결과적으로, 고형 암의 사용은 추가적인 문제를 가져올 수 있습니다. 이러한 종양은 응집되기 쉬울 수 있으며, 이는 세포 볼루스의 전달에 변동성을 일으킬 수 있습니다; 그러나 이러한 상황에서도 RFP 라벨링은 bolus의 적절한 주입 후 품질 관리를 가능하게 해야 합니다. 이것은 자가형광에 의해 가려지는 GFP 라벨링 또는 녹색 염료보다 우수합니다. 마지막으로, 성공에 영향을 미치는 대부분의 매개변수(배아 건강, 양식 온도, 바늘 오리피스, 주입 압력 등)에 대한 표준화는 이 프로세스의 변동성을 최소화합니다.

제브라피쉬의 이종 이식 실험에서 주요 고려 사항은 주입 부위입니다. 여기에서 우리는 난황에 주입하는 것이 periiviteline space34, Duct of Cuvier35 및 intracardial injection (heart ventricle) 36과 같이 기술적으로 더 어려운 다른 부위에 비해 매우 쉽다는 것을 보여주었습니다. 난황 주입의 단점은 배아가 성장하는 데 필수적인 장기이기 때문에 주사 외상으로 배아가 죽지 않도록 바늘 직경과 압력을 신중하게 제어하는 데 주의를 기울여야 합니다. 여기에 설명된 접근법은 부상을 최소화하고 명백한 부상이나 사망을 1dpi만큼 버림으로써 이러한 문제를 완화합니다. 이러한 문제는 종양 성장과 관련이 없기 때문입니다. 주사 부위에 대한 마지막 고려 사항은 뚜렷한 미세환경이 이종 이식된 종양의 증식을 지원하는 능력이 더 크거나 적을 수 있다는 것입니다. 결과적으로, 더 까다로운 orthotopic 주사를 진행하기 전에 난황 주사를 먼저 수행할 수 있습니다. 난황 주입의 가장 큰 장점은 정밀한 배아 병기가 필요하지 않아 더 많은 수의 배아를 더 빠르게 주입할 수 있어 건강을 더 잘 보존하고 이식된 종양 세포의 행동 차이를 해결하는 통계적 검정력을 높인다는 것입니다.

질병 진행에 대한 주사 후 모니터링은 일반적으로 Kaplan-Meier 분석을 사용하여 생존에 미치는 영향을 통해 평가됩니다37; 그러나 질병 부담 검사도 상당한 정보를 제공할 수 있습니다. 주입 부위에 남아 있는 이식된 세포의 경우, 종양 세포에 대한 표지 방법이 자가형광에 의해 가려지지 않는 한, 종양 부담을 다양한 현미경 방법을 사용하여 정량화할 수 있다29. CM-Dil 염색은 쉽게 분리되고 자가형광의 영향을 받지 않으므로 국소 세포의 종양 부담을 정량화하는 데 효과적입니다. 문제는 종양 세포가 주사 부위에 남아 증혈하지 않을 때 발생합니다. 이러한 경우, 적색 형광 단백질을 사용한 지울 수 없는 유전자 표시와 결합된 유세포 분석은 제브라피시 세포와 다른 종 특이적 염색을 사용하여 표지된 종양을 분석할 수 있기 때문에 표준화된 배아의 질병 부담을 모니터링하는 매우 효과적인 방법입니다. CM-Dil의 한 가지 단점은 세포 분열38에 의해 희석된다는 것입니다. 따라서 RFP 또는 mCherry를 사용하여 종양의 유전자 표시를 사용한 적응은 상당한 이점을 제공합니다. 종양 특이적 항체와 결합된 mCherry 발현을 통해 숙주 제브라피시 세포가 제공하는 복잡한 배경 신호 패턴 중에서 이식된 세포를 확실하게 식별할 수 있습니다.

종합하면, 이 연구에 사용된 최적화된 제브라피시 이종 이식 접근법 및 분석 방법은 이미 강력한 실험 플랫폼에 상당한 개선을 제공합니다.

공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 NIH 보조금 R37AI110985 및 P30CA006927, Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society 및 Bishop Fund의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 세포 배양, 유세포 분석 및 실험실 동물 시설을 포함한 Fox Chase의 핵심 시설의 지원을 받았습니다. FCCC에서 제브라피시 및 미세주사 시설을 유지해 주신 Jennifer Rhodes 박사님께 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-페닐 2-티오우레아(PTU)SigmaP7629
70미크론 셀 스트레이너Corning CLS431751-50EA
90 mm 페트리 디쉬Thermo Fisher ScientificS43565
AgaroseApex bioresearch20-102GP
APC APC 안티-마우스 CD45.2 항체Biolegend109814
BD FACSymphony A5 세포 분석기BD BiosciencesBD FACSymphony A5
캘리브레이션 모세관Sigma P1424-1PAK
세포 추적기 CM-dil 염료InvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Dumont 펜치 번호 55미세 과학 도구11255-20
FBSCorning 35-015-CV
형광 현미경Nikon모델 SMZ1500
유리 모세관 (보로실리케이트)세계 정밀 기기1B100-4
HBSSCorning 21-023-CV
Helix NP BlueBiolegend425305
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
광학 현미경Nikon모델 SMZ1000
메틸렌 블루SigmaM9140-100G
Microloader (laoding cells용 긴 팁)eppendorf930001007
P1000 마이크로피펫 풀러Sutter Instruments모델 P-97
PM 1000 세포 마이크로인젝터MicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
트리카인 메탄설페이트(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설페이트)SigmaE10521-10G
트립신-EDTA(0.5%), 페놀 레드없음 Gibco15400054
제브라피시 성인 방사선 조사 다이어트(건조 사료)Zeigler388763

참고문헌

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