Method Article

Generation and Downstream Analysis of single-cell and single-nuclei transcriptomes in brain organoids(뇌 오가노이드에서 단세포 및 단핵체 전사체의 생성 및 다운스트림 분석)

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 single-cell 및 single-nucleus RNA sequencing을 사용하여 인간 뇌 오가노이드의 생성 및 다운스트림 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다.

Abstract

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지난 10년 동안 단세포 전사체학은 크게 발전하여 개별 세포의 유전자 발현 프로파일을 동시에 분석하기 위한 표준 실험실 방법이 되어 세포 다양성을 포착할 수 있게 되었습니다. 분리하기 어려운 세포 유형으로 인한 한계를 극복하기 위해 온전한 세포 대신 단일 핵을 회수하는 것을 목표로 하는 대체 접근 방식을 염기서열 분석에 활용하여 개별 세포의 전사체 프로파일링을 보편적으로 적용할 수 있습니다. 이러한 기술은 뇌 오가노이드 연구의 초석이 되었으며, 발달 중인 인간 뇌의 모델로 자리 잡았습니다. 뇌 오가노이드 연구에서 단세포 및 단핵 전사체학의 잠재력을 활용하는 이 프로토콜은 오가노이드 해리, 단세포 또는 핵 분리, 라이브러리 준비 및 염기서열분석과 같은 주요 절차를 포괄하는 단계별 가이드를 제공합니다. 이러한 대체 접근법을 구현함으로써 연구자들은 고품질 데이터 세트를 얻을 수 있으며, 이를 통해 신경 세포 및 비신경 세포 유형, 유전자 발현 프로필 및 세포 계통 궤적을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 뇌 발달을 형성하는 세포 과정과 분자 메커니즘에 대한 포괄적인 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

Introduction

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지난 몇 년 동안 오가노이드 기술은 장기 유사 조직 1,2,3을 배양하는 유망한 도구로 부상했습니다. 특히 인간의 뇌와 같이 쉽게 접근할 수 없는 장기의 경우, 오가노이드는 발병 및 질병 발현에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 기회를 제공합니다4. 따라서 뇌 오가노이드는 발달, 정신 질환 또는 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 인간 뇌 질환을 조사하기 위한 실험 모델로 널리 사용되어 왔습니다 4,5,6.

단세포 전사체 프로파일링 기술의 출현으로 1차 인체 조직 및 복잡한 in vitro 모델을 전례 없는 수준의 세밀성으로 연구할 수 있게 되었으며, 건강 및 질병의 세포 하위 집단 수준에서 유전자 발현 변화에 대한 기계론적 통찰력을 제공하고 새로운 추정 치료 표적에 대한 정보를 제공할 수 있었습니다 7,8,9. 오가노이드 분야는 세포 구성, 재현성 및 뇌 오가노이드 기술의 충실도를 평가하기 위해 단일 세포 전사체 프로파일링을 활용하여 발전해 왔습니다 10,11,12. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 분류 및 병든 오가노이드에서 유전적 조절 장애를 식별할 수 있게 했습니다13,14. 중요한 것은 오가노이드 조직의 복잡성으로 인해 개별 세포의 프로파일링을 가능하게 하는 기술의 구현이 필요하다는 것입니다. 벌크 전사체 프로파일링(벌크 RNA 염기서열분석)과 같은 방법을 사용한 오가노이드의 특성 분석은 복잡한 조직 내의 모든 유형의 세포에서 평균화된 마스킹된 세포 이질성 및 유전자 발현 프로파일로 이어지며, 궁극적으로 건강 및 질병에서 오가노이드 발달 중 진행 과정에 대한 이해를 제한합니다 15,16,17 . scRNA-seq 방법이 계속 발전함에 따라 Allen Brain Atlas 또는 Uzquiano et al.18의 인간 뇌 오가노이드 단세포 아틀라스와 같은 리소스에서 볼 수 있는 아틀라스가 점점 더 많이 생성되고 있습니다.

뇌 오가노이드에서 성공적인 scRNA-seq 달성은 온전한 세포의 효과적인 분리 및 캡처에 달려 있습니다. 개별 세포를 얻기 위한 뇌 오가노이드의 해리는 효소 소화를 기반으로 하기 때문에 스트레스와 세포 손상을 유발하여 유전자 발현 패턴에 영향을 미칠 수 있습니다19,20. 따라서 조직을 개별 세포로 해리하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 대안적인 접근법은 단일핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq)으로, 신선 및 냉동 조직21,22 모두에서 핵을 효소 없이 추출할 수 있습니다. 그러나 조직에서 핵을 분리하는 것은 관심 세포 유형의 농축 및 세포에 비해 핵의 낮은 RNA 함량과 같은 다른 문제를 제기합니다.

뇌 오가노이드의 전사체 연구는 일반적으로 scRNA-seq10,18,23을 사용하여 수행됩니다. 그러나 단일 핵의 분리는 오가노이드의 전사체 프로필을 조사하기 위한 직교 및 보충 방법을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 뇌 오가노이드에 대한 scRNA 및 snRNA-seq 도구 상자를 소개하고 최고 품질의 염기서열 분석 데이터를 얻기 위한 중요한 사항에 대해 논의합니다.

Protocol

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설명된 프로토콜은 Max Delbrück Center for Molecular Medicine(승인 번호: 138/08)의 생물안전 레벨 1 실험실에서 요구 사항에 따라 연구 윤리에 대한 EU 및 국가 규칙에 따라 수행됩니다.

1. 유도만능줄기세포(iPSC)에서 전뇌 오가노이드 유도

참고: 이 프로토콜은 여러 회사의 다양한 줄기 세포 배지에서 배양된 여러 iPSC 라인에 대해 테스트되었습니다(표 1). 전뇌 오가노이드의 생성은 프로토콜 시작 전에 고품질 iPSC와 60%-70%의 합류점에 크게 의존합니다. 여기서는 시판되는 세포주를 사용했습니다( 재료 표 참조).

  1. 0일차: 배아체 형성
    1. 플루로닉 용액으로 96웰 플레이트를 처리하려면 96웰 U-바닥 플레이트의 웰당 80μL의 멸균 여과된 2% 플루로닉 용액을 추가합니다. 실온(RT) 또는 37°C에서 최소 15분 동안 배양합니다.
      알림: 플루로닉 처리된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있으며 배아체 형성을 위한 세척 단계 없이 직접 사용할 수 있습니다.
    2. 세포를 파종하기 전에 흡입기 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 플루로닉 용액을 제거합니다.
    3. 시작하기 전에 96웰 플레이트 1개에 대해 다음 시약을 준비합니다: 5mL의 예열된 DMEM이 있는 15mL 원심분리 튜브: F12 배지; 50 μM Y-27632, 플루로닉 처리 플레이트가 보충된 11mL의 줄기 세포 배지(위에서 설명한 대로).
    4. 60-70% confluent iPSC로 구성된 6-well 플레이트의 한 웰에서 매체를 흡입합니다. PBS로 세포를 한 번 씻으십시오. 500 μL의 트립신 기반 시약을 넣고 37°C에서 2-6분 동안 배양합니다.
      참고: 트립신 기반 시약으로 세포를 적절하게 분리하기 위한 배양 시간은 세포 밀도와 각 iPSC 라인의 세포 매트릭스 접착 특성에 따라 다릅니다. 과도한 분해를 피하려면 트립신 기반 시약으로 배양 2분 후 명시야 현미경을 사용하여 세포 형태를 검사하는 것이 좋습니다.
    5. 1000 μL 피펫을 사용하여 세포를 분리하고 DMEM:F12 배지와 함께 미리 준비된 15 mL 원심분리기 튜브로 옮겨 해리를 중지합니다.
    6. 300 x g에서 3분 동안 원심분리기 셀 현탁액. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 유지합니다. 50 μM Y-27632가 보충된 1 mL의 줄기 세포 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
    7. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 세고 50μM Y-27632가 보충된 줄기 세포 배지에 원하는 수의 세포를 추가합니다. 단일 배아체의 생성에는 세포주에 따라 3,000-12,000개의 세포가 필요합니다.
    8. 10mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 다채널 시약 저장소로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액의 100μL/웰을 이전에 플루로닉 처리된 96웰 플레이트에 플레이트합니다.
    9. 96-well plate를 37 ° C, 5 % O2 및 5 % CO2 의 인큐베이터에 놓습니다. 배아체 형성 중 방해를 피하기 위해 플레이트를 움직이지 마십시오.
  2. 2일차: 배아체 형성 검사
    1. 명시야 현미경의 10x 대물렌즈를 사용하여 배아체 형성을 검사합니다. 배아체는 가장자리가 선명하고 세포 사멸을 최소화해야 합니다.
    2. 가능한 한 많은 배지를 흡입하고 100 μL/웰의 줄기세포 배지로 교체합니다. (위험) 배아체는 배지 교환 중에 우물에서 쉽게 제거됩니다. 제거하지 않도록 주의하십시오., 따라서 흡인 후 매체를 모니터링하십시오.
  3. 3일차: 신경외배엽 유도
    1. 가능한 한 많은 매체를 흡입하고 120 μL/웰의 유도 매체로 교체하고 37 °C, 20% O2 및 5% CO2 에서 플레이트를 놓습니다.
  4. 6일차: 임베딩
    1. iPSC 라인에 따라 신경 외배엽 출현을 유도하는 데 3일 또는 4일이 필요합니다. 배아체를 정기적으로 모니터링하십시오. 가장자리가 밝아지면 배아체를 포함할 준비가 된 것입니다. 아래24에 설명된 대로 배아체 임베딩에 사용할 수 있는 두 가지 다른 방법 중 하나를 사용합니다.
    2. 임베딩 방법 1: 쿠키 임베딩
      1. 희석되지 않은 세포외 기질 겔의 부분 표본을 얼음 위에서 1-2시간 동안 해동합니다. (위험) 세포외 기질 겔이 응고되는 것을 방지하기 위해 항상 얼음 위에 보관하십시오. 해동 시간과 반복되는 해동 주기를 최소화하기 위해 분취액을 미리 준비하십시오.
      2. 클로 니퍼를 사용하여 200μL 피펫의 끝을 자르고 하나의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 16-32개의 배아체를 수집합니다.
      3. 67μL의 배지에 있는 배아체를 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 절단된 200μL 피펫 팁을 사용하여 100μL의 세포외 기질 젤을 추가하고 부드럽게 혼합합니다.
      4. 배아체를 6cm 접시에 고르게 분포시키고 세포외 기질 겔이 응고될 수 있도록 플레이트를 5-10분 동안 놓습니다.
      5. 약 4mL의 분화 배지를 추가하고 37 °C, 20 % O2 및 5 % CO2 에서 배양합니다. 다음 날, 접시를 오비탈 셰이커(84rpm)에 놓습니다. 모든 배아체가 바닥에서 분리되는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 절단된 피펫 팁과 매체를 사용하여 부드럽게 분리하십시오.
    3. 임베딩 방법 2: 액체 임베딩
      1. 희석되지 않은 세포외 기질 겔의 부분 표본을 얼음에서 1-2시간 동안 해동하고 분화 배지를 얼음 위에 놓습니다. (위험) 배지는 세포외 기질 겔을 추가할 때 얼음처럼 차가워야 합니다.
      2. 배지가 차가워지면 세포외 기질 겔을 최종 농도 2%까지 추가합니다. 클로 니퍼를 사용하여 200μL 피펫의 끝을 절단하고 최대 24개의 배아체를 6웰 플레이트의 하나의 웰로 옮깁니다.
      3. 여분의 배지를 모두 제거하고 약 4mL의 2% 세포외 기질 겔/분화 배지를 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 추가합니다. 즉시 플레이트를 오비탈 셰이커(84rpm)에 놓습니다.
  5. 9-20일차: 3-4일마다 분화 배지를 사용하여 전체 배지 교환을 수행합니다.
  6. 21-30일차: 오가노이드를 성숙 배지로 옮기고 3-4일마다 전체 배지 교환을 수행합니다.
  7. 오가노이드의 해리: 단일 핵 및 세포 분리를 위해서는 고품질의 오가노이드를 사용하십시오. 과도한 양의 세포 사멸을 방지하려면 오가노이드를 정기적으로 절단하여 괴사성 코어가 축적되는 것을 방지하고 추가 분석을 위해 해리하기 전에 2주 동안 회복되도록 합니다.

2. 오가노이드에서 단일세포 유도

참고: 단일 세포 분리는 기계적 및 효소적 분리를 사용하는 Neural Tissue Dissociation Kit(표 2)를 사용하여 수행됩니다. 여기에서는 수동 기계적 분리에 대해 설명합니다. 대안으로 해리 기계를 사용할 수 있습니다.

  1. 얼음에 STOP 용액과 0.04% BSA를 준비합니다. PBS에 효소 믹스 1과 2 및 0.04% BSA를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
  2. 6-웰 플레이트의 웰 하나에 최대 5개의 오가노이드를 수집하고 과도한 배지를 흡입하고 PBS로 한 번 세척하여 배양 배지를 제거합니다. 웰 중앙에 오가노이드를 놓고 메스를 사용하여 오가노이드를 철저히 다집니다.
  3. 효소 믹스 1을 넣고 37 ° C, 20 % O2 및 5 % CO2 에 넣고 90rpm에서 10-15 분 동안 흔듭니다.
  4. 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 최대 10배까지 피펫팅하여 오가노이드를 재현탁합니다. 효소 믹스 2를 추가하고 1000μL 피펫 팁을 사용하여 피펫팅하여 잘 섞습니다. 37 ° C, 20 % O2 및 5 % CO2 에서 90-10 분 동안 15 rpm으로 흔듭니다.
  5. 세포 용액을 10mL의 cold STOP 용액에 다시 현탁시켜 해리 과정을 중지합니다. 70μM 셀 스트레이너를 사용한 필터 셀 용액. 여과된 세포 용액을 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다.
  6. 배지를 흡인하여 세포 펠릿을 남기고 4mL의 차가운 0.04% BSA에 세포를 재현탁시킵니다. 40μM 세포 여과기를 사용하여 세포 용액을 여과하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
  7. 세포 용액을 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. BSA 용액을 흡인하여 세포 펠릿을 남깁니다. NSB+ 배지에서 microfluidics-based-snRNA-seq kit 매뉴얼에 따라 세포를 재현탁시킵니다.

3. 오가노이드에서 단일 핵의 분리

  1. 오가노이드를 냉각된 PBS로 옮기고 각 오가노이드를 4조각으로 자릅니다. 냉장 PBS로 오가노이드를 2회 세척합니다.
  2. 1000 μL 피펫의 피펫 팁을 가위로 자르고 오가노이드 조각을 2 mL douncer에 옮깁니다. PBS를 완전히 흡입하고 NP40 용해 완충액 1mL를 추가합니다.
  3. Dounce 유봉 A로 3x, dounce 유봉 B로 3x 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 추가 1mL의 NP40 용해 완충액으로 douncer를 세척하고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 배양한 후 원심분리기 현탁액을 500 x g에서 5분 동안 배양합니다 .
  4. 50μL의 상층액을 남기고 상층액을 흡인합니다. 펠릿을 방해하지 않고 NSB+ 1mL를 추가합니다. 배양 5분 후 재현탁하십시오.
  5. Percoll 그래디언트 상부의 층 현탁액(하단 층: NSB + 1mL 및 Percoll 250μL, 중간 층: NSB+ 1mL 및 Percoll 188μL, 상층: NSB+ 1mL 및 Percoll 125μL). (위험) 레이어 혼합을 피하기 위해 매우 조심스럽게 레이어링을 수행합니다.
  6. 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입하고 NSB+에 재현탁시킵니다. 40μM 세포 여과기를 사용하여 핵 용액을 여과합니다.
  7. DAPI와 Neubauer Chamber를 사용하여 핵을 염색하고 계수합니다. 미세유체역학 기반 scRNA-seq 키트 매뉴얼에 따라 핵을 재현탁시킵니다.

4. 라이브러리 준비 및 시퀀싱

  1. 10,000개의 세포와 핵을 미세유체 시스템에 로드하고 미세유체역학 기반 scRNA-seq 키트(Table of Materials)의 매뉴얼에 따라 라이브러리를 생성합니다.
  2. snRNA-seq 라이브러리당 약 6 x 108 read 및 scRNA-seq 라이브러리당 1.6 x 108 read로 라이브러리를 염기서열분석하여 snRNA-seq 데이터 세트의 염기서열 분석 포화도가 87%, scRNA-seq 데이터 세트의 경우 36%의 염기서열 분석 포화도를 얻습니다.

5. 분석

  1. scRNA-seq 및 snRNA-seq에 대한 데이터 분석 파이프라인을 사용하여 염기서열분석 분석을 수행하고 인간 GRCh38 게놈과 대조합니다. 이 파이프라인에 의해 생성된 카운트 매트릭스는 R-package Seurat(버전 4.1.1)25를 사용하여 추가 분석을 수행합니다.
  2. 5개 이상의 세포에 대표된 유전자를 고려하고 300개 이상의 유전자를 포함하는 세포를 통합하여 Seurat 객체를 만듭니다. scRNA-seq 데이터 세트의 경우 1000개 이상의 유전자를 포함하지만 4000개 미만의 유전자를 포함하는 세포와 snRNA-seq 데이터 세트의 경우 핵당 800개 이상 4000개 미만의 유전자를 보유하여 추가 품질 관리 필터링을 수행합니다. 미토콘드리아 판독률이 5%를 초과하는 데이터 세트, 세포 및 핵은 제외합니다.
  3. 두 방법 간의 배치 효과를 완화하려면 필터링된 두 데이터 세트를 모두 통합하고 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 통해 정규화 및 시각화합니다. 낮은 고유 분자 식별자(UMI) 및 유전자 수를 표시하는 클러스터 1을 생략합니다. 그 후, 클러스터에 대해 알려진 마커 유전자와 Ana Uzquiano 등의 30일 된 오가노이드 데이터 세트를 기반으로 세포 정체성을 할당합니다. al. (보충 코딩 파일 1)18.

Results

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scRNA-seq 및 snRNA-seq를 사용하여 뇌 오가노이드의 세포 유형 구성을 조사하기 위해 이 단계의 오가노이드는 이미 중간 전구세포와 초기 단계 뉴런으로 둘러싸인 전구세포로 구성된 신경상피 루프를 나타내기 때문에 배양 30일 후 뇌 오가노이드를 수확했습니다 4,18. 성장 및 배양 전반에 걸쳐 오가노이드의 품질을 모니터링하는 것은 신뢰할 수 있는 단세포 및 단핵핵 데이터를 얻는 데 필수적입니다.

오가노이드는 iPSC가 배아체로 응집되어 형성됩니다(그림 1B,C). 조립 시, 이러한 배아체는 최소한의 세포 파편과 함께 명확한 가장자리를 나타낼 것으로 예상됩니다(그림 1C). 신경 외배엽의 유도 후, 배아체는 상대적으로 어두운 내부 영역과 함께 표면 주변에서 관찰 가능한 밝아짐을 나타내며, 이는 성공적인 신경 유도를 나타냅니다(그림 1D). 다음 몇 주 동안 오가노이드는 주로 신경 상피 세포로 구성된 신경 세포 로제트와 같은 구조인 루프(loops)를 발달시킵니다(그림 1E,F). 이러한 오가노이드는 수개월에 걸쳐 배양에서 유지될 수 있지만, 크기가 커짐에 따라 영양소와 산소 가용성이 부족하여 오가노이드 내부의 세포 사멸이 증가하여 결국 괴사성 코어가 발생한다는 점에 유의해야 합니다.

염기서열분석 분석을 통해 대뇌피질 오가노이드 내의 세포 다양성을 탐구하기 위해 오가노이드에서 단세포와 핵을 모두 분리했습니다. 뇌 오가노이드의 단일 배치 내에 내재된 이질성의 균형을 맞추기 위해 한 배치에서 4개의 풀링된 오가노이드에 대한 염기서열 분석을 수행했습니다. 또한, 분리 공정 간의 비교를 위해 그리고 snRNA-seq와 scRNA-seq 라이브러리 사이의 배치 효과를 제거하기 위해 이러한 오가노이드를 반쪽(총 8개의 반쪽; 그림 2). 개별 세포의 효소 분리 후에는 세포 생존율이 80% 이상으로 유지되도록 하는 동시에 세포가 둥근 형태를 유지하는지 관찰하는 것이 중요합니다(그림 3A, B). 마찬가지로, 개별 핵의 기계적 분리는 검출 가능한 파편이 최소화되거나 전혀 없는 다양한 크기의 온전한 핵을 생성해야 합니다(그림 3C,D).

염기서열분석 결과 핵보다 더 많은 세포가 포획되고 염기서열분석된 것으로 나타났습니다. 두 데이터 세트 모두 세포와 핵당 높은 유전자 및 UMI 수와 낮은 미토콘드리아 판독 비율로 평가된 우수한 품질을 보여주었습니다(그림 4A-C). 예상대로 미토콘드리아 및 리보솜 판독은 snRNA-seq 데이터 세트에 비해 scRNA-seq 데이터 세트에서 회수된 총 판독 중 더 높은 비율을 차지합니다. scRNA-seq 데이터 세트에서 대부분의 세포는 30% 미만의 리보솜 판독을 포함하는 반면, snRNA-seq 데이터 세트에서는 대부분의 핵이 5% 미만의 리보솜 판독을 포함했습니다. 또한 scRNA-seq 데이터 세트 내에서 캡처된 대부분의 세포는 5% 미만의 미토콘드리아 판독을 포함합니다. 미토콘드리아 판독을 필터링한 후 약 10,000개의 세포와 3,000개의 핵이 품질 임계값을 통과했습니다.

두 데이터 세트에 대한 통합 분석 결과 모든 클러스터가 두 데이터 세트에 모두 표시되는 것으로 나타났으며, 이는 두 방법 모두 동일한 셀 유형을 복구한다는 것을 나타냅니다(그림 5A, C). 데이터 세트의 주석은 주요 세포 집단이 요골 아교세포, 중간 전구 세포, 피질 밑 전구 세포 및 뉴런뿐만 아니라 신생아 심층부 투영 뉴런 및 Cajal-Retzius, 피질 밑단 및 맥락막 신경총 세포와 같은 덜 대표된 세포 유형으로 구성되어 있음을 보여줍니다(그림 5B). 전반적으로 scRNA-seq 및 snRNA-seq는 30일 된 뇌 오가노이드20에 존재할 것으로 예상되는 모든 세포 유형을 복구할 수 있습니다.

배아체 형성에서 성숙 타임라인까지; 현미경 이미지; 세포 분화 단계.
그림 1: iPSC의 뇌 오가노이드 생성. 뇌 오가노이드 생성의 시간 경과(A). 배아체를 형성하고(파종 후 72시간) (C) 배양 7일 후 성공적인 신경 유도를 보여주는 iPSC(B)와의 성공적인 피질 분화에 대한 예시 이미지(D). 오가노이드는 15일째(E)와 30일(F)에 뚜렷한 루프를 나타냅니다. 눈금: B-D 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단일 세포 및 핵 RNA 시퀀싱 다이어그램; 효소 해리, Percoll 구배 방법.
그림 2: 뇌 오가노이드에서 단일 세포와 단일 핵을 얻기 위한 워크플로우. 오가노이드를 단일 세포로 분리하는 것은 메스로 오가노이드를 다진 후 효소 분해(상단)를 수행하여 수행됩니다. 핵의 분리는 기계적 해리에 의해 수행된 후 Percoll 그래디언트(하단)를 통한 정제로 수행됩니다. single cell 및 nuclei suspension은 library generation 및 sequencing을 위해 여과되고 microfluidics 시스템에 로드됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다양한 세포 밀도 및 염색 패턴을 보여주는 세포 현미경 이미지; 방법에는 염색이 포함됩니다.
그림 3: 30일 된 오가노이드에서 분리된 세포와 핵의 대표적인 결과. (A) 세포 계수기를 사용하여 촬영한 트리판 블루 염색 세포의 예시 사진 및 (B) 해당 클로즈업. (C) DAPI 염색된 핵의 명시야 및 형광 사진의 오버레이 및 (D) 해당 클로즈업. 스케일 바: 100 μM 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

정체성에 따른 데이터 변동성을 보여주는 바이올린 플롯; 통계 분석 결과.
그림 4: scRNA 및 snRNA-seq의 품질 관리. 바이올린 플롯은 세포(파란색)와 핵(분홍색-보라색)의 절대 UMI 수(A), 유전자 수(B), 미토콘드리아(C) 및 리보솜 판독(D)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

scRNAseq 및 snRNAseq 클러스터, 신경 세포의 유전자 발현 분석을 보여주는 UMAP 다이어그램.
그림 5: scRNA-seq 및 snRNA-seq는 30일 된 오가노이드에서 유사한 세포 집단을 검색합니다. scRNA-seq (파란색) 및 snRNA-seq 결과 (분홍색-보라색) (A), scRNA-seq 및 snRNA-seq (B, C)의 통합 및 주석 및 개별 프로필을 보여주는 30일 된 오가노이드의 통합 임베디드 UMAP. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 세포 배양 배지 및 코팅 성분 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: scRNA 및 snRNA-seq에 대한 해리 완충액. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: scRNA-seq 및 snRNA-seq 데이터를 분석하는 데 사용되는 코딩 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

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단일 세포 및 단일 핵의 전사체 분석은 복잡한 조직 내의 유전자 조절 메커니즘을 이해하기 위한 중추적인 도구로 부상했습니다. 두 방법 모두 뇌 오가노이드의 전사체 연구를 가능하게 합니다. 전반적으로 성공적인 실험을 보장하기 위해서는 출발 물질의 품질이 높은 관련성을 가져야 합니다. 따라서, 괴사성 코어(necrotic core)(26)의 형성을 방지하기 위해 오가노이드를 정기적으로 절단할 필요가 있다. 또한 Air-Liquid Interface culture(27)를 이용하여 이 문제를 제거할 수 있다. 오가노이드 이질성으로 인한 배치 효과를 줄이려면 추출당 최소 4개의 오가노이드를 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 개별 오가노이드에 대한 다중 시퀀싱 실행을 수행할 수 있으며, 이는 추가적으로 동일한 배치(17) 내의 변동성을 검사할 수 있게 합니다. scRNA-seq와 snRNA-seq 두 가지 방법을 동시에 사용하는 경우 오가노이드를 2개로 절단하고 각 방법별로 나누면 오가노이드 이질성으로 인한 차이를 더욱 줄일 수 있습니다.

개별 세포 또는 핵의 우수한 품질의 전사체 프로필을 얻으려면 전체 절차 동안 세포 또는 핵막이 손상되지 않은 상태로 유지되는 것이 중요합니다. 따라서 효소 농도와 효소 분해 시기를 모두 최적화하는 것이 중요하며, 이는 오가노이드의 나이와 크기에 맞게 조정해야 합니다. 또한 올바른 온도와 원심분리 속도를 사용하고 강한 피펫팅을 피하는 것이 중요합니다. 생존율이 낮은 경우, 오가노이드를 단일 세포로 해리한 후 데드 셀 제거 키트를 사용할 수 있습니다. 보완적으로, 핵의 분리를 위해 PBS로 오가노이드를 조심스럽게 세척하고 douncer로 스트로크 수를 오가노이드 크기에 맞게 조정하는 것이 중요합니다. 레이어링의 방해를 피하기 위해 Percoll 그래디언트를 조심스럽게 레이어링하는 것도 중요합니다. 분리 후에도 손상된 핵이 남아 있으면 형광 활성화 세포 분류22를 통해 분류 단계를 구현하는 것이 좋습니다. 전반적으로 RNAse 억제제의 사용은 각 세포 또는 핵의 고품질 RNA를 보존하기 위해 시료 해리에서 라이브러리 생성에 이르기까지 모든 단계에서 매우 중요합니다.

이 연구에서 scRNA-seq는 더 많은 세포를 생성하여 세포 집단에 대한 더 넓은 개요를 가능하게 했습니다. 또한 세포는 더 많은 RNA를 함유하고 있으며 핵에 비해 표면 마커를 통해 특정 세포 유형에 대해 더 쉽게 농축할 수 있습니다. 그러나, 단일 세포 해리는 스트레스 관련 RNAs19,28의 전사를 유도할 수 있는 효소 과정에 의존한다. 특히 스트레스 반응의 증가와 관련된 질병에서, 이는 해리-유발 인공물(dissociation-induced artifacts)을 초래할 수 있다20. 더욱이, 단일 세포 분리는 민감한 세포 집단의 손실을 초래하는 것으로 나타났습니다 3,29. 이 연구에서는 이것이 분명하지 않을 수 있지만, 더 높은 세포 다양성을 특징으로 하는 오래된 뇌 오가노이드를 사용할 때 가능한 결과입니다.

두 데이터 세트 모두 동일한 세포 집단을 검색하기 때문에 분리 방법의 선택은 연구 질문, 조직 획득 및 시간 관리에 따라 크게 달라집니다. 해리 후 메탄올에서 뇌 오가노이드의 단일 세포의 고정 및 저장은 잘 확립되어 있지만(30), 동결된 뇌 오가노이드에서 단일 핵을 분리하는 것은 여전히 최적화가 필요합니다.

전반적으로, 당사의 프로토콜은 뇌 오가노이드에서 개별 세포 및 핵의 전사체 프로필을 조사할 수 있는 다재다능하고 적응 가능한 플랫폼을 제공하여 체외 인간 뇌 모델에서 발달 및 질병 관련 질문에 대한 심층적인 조사를 위한 길을 닦습니다.

Disclosures

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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Miltenyi 신경 해리 키트에 대한 원본 지침에 대해 Valeria Fernandez-Vallone에게 감사드립니다. 또한 NP40 용해 완충액에 대한 레시피와 이 프로토콜을 설정하는 데 귀중한 조언을 제공한 Max Delbrueck Centrum의 유전체학 기술 플랫폼에도 감사드립니다. 또한 실험실 조직의 지원을 아끼지 않은 Margareta Herzog와 Alexandra Tschernycheff에게도 감사의 뜻을 전합니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., FD MOL.-BIOL., ~1 M H2O (DTT)시그마  43816-10ML
1.5 ml DNA 저결합 튜브 VWR525-0130마이크로 원심분리기 튜브
10x Cellranger 파이프라인 분석 파이라인
15 ml FalconFalcon원심분리기 튜브
2-메르캅토에탄올(BME)Life Technologies21985023
50 ml Falcon원심분리기 튜브
A83-01Bio Technologies379762
항생제/항진균 용액 (100X)Life Technologies15240062
B-27 플러스 보충제Life Technologies17504044
B-27 보충제 비타민 A없음 Life Technologies12587010
소 세럼 알부민, 지방산 무료 (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µ mNeolab352340
세포 여과기 70 &마이크로; m (화이트) 나일론시그마CLS431751-50EA
크롬 컨트롤러 & 다음 GEM 액세서리 키트10X 게놈1000204
크롬 다음 GEM 칩 G 단일 세포 키트, 16 rxns10X 유전체학1000127
크롬 다음 GEM 단일 세포 3' 키트 v3.110X 게놈1000268
완성,  EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일로슈11873580001
DAPIMERCK 화학 물질0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce 조직 분쇄기 세트 2mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE 세포 계수 슬라이드VWREVS-050 ( 734-2676)
태아 소 혈청 테트라사이클린 프리 (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (코팅)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotec해리 매신
GlutaMAX 보충제Life Technologies35050038
헤파린 나트륨 세포 배양 테스트SigmaH3149-10KU
인간 재조합 BDNFStemCell Technologies78005.3
인간 재조합 GDNFStemCell Technologies78058.3
인슐린 솔루션 HumanSigma AldrichI2643-25MG
녹아웃 세럼 대체품Life Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM 비필수 아미노산(100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 염화마그네슘(1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276줄기세포 매체
mTeSR1StemCell Technologies85850줄기세포 매체
N2 보충제;StemCell Technologies17502048
신경 조직 해리 키트Miltenyi Biotec BV & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 시스템IlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps 세제 솔루션Life Technologies28324
PBS 둘베코' sInvitrogen14190169
PenStrep (페니실린 - 스트렙토마이신)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
록 억제제 (Y-27632 디하이드로클로라이드) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
염화나트륨 NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex 배지Thermo ScientificA3349401줄기세포 배지
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368줄기세포 배지
TC-Platte 96 Well, 둥근 바닥Sarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, 페놀 레드 없음Life Technologies12604013Trypsin 기반 시약
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

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