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방법 논문

신경섬유종증 1형에서 영양 및 신경 발달에 대한 산모의 식단의 효과를 평가하기 위한 태아 쥐 뇌 및 혈청의 동시 수집

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66226

⸱

2024년 5월 17일

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 동일한 마우스 배아에서 태아의 뇌 조직과 고품질의 비용혈 혈청을 동시에 수집하는 방법을 설명합니다. 우리는 이 기술을 활용하여 산모의 식이 노출이 Nf1 (신경섬유종증 1형)에 대한 이형접합 마우스의 다량 영양소 프로필과 태아 신경 발달에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다.

초록

산모의 식단으로 인한 비만은 자손의 신경 발달을 변화시키는 것으로 입증되었으며, 이는 인지 능력 감소, 과잉 행동 및 사회적 행동 장애로 이어질 수 있습니다. 임상적으로 이질적인 유전 질환인 신경섬유종증 1형(NF1)을 앓고 있는 환자도 유사한 결핍을 보일 수 있지만, 산모의 식단과 같은 환경적 요인이 이러한 표현형의 발달에 영향을 미치는지, 영향을 미친다면 그러한 효과가 발생하는 메커니즘은 현재로서는 불분명합니다. 산모의 난생성 식단 노출이 NF1의 신경 발달과 관련된 전신 요인에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있도록 우리는 대조군 식단과 고지방, 고자당 식단을 먹인 쥐댐의 태아 자손으로부터 비용혈 혈청과 전체 또는 국소적으로 미세 절개된 뇌를 동시에 수집하는 방법을 개발했습니다. 뇌는 냉동 절개 또는 급속 냉동을 위해 처리되어 후속 RNA 또는 단백질 분리에 사용되었습니다. 수집된 조직의 품질은 면역염색을 통해 검증하였다. 혈청의 품질은 다량 영양소 프로필을 분석하여 검증되었습니다. 이 기술을 사용하여 우리는 모계의 난소 형성 식단이 WT와 Nf1-이형접합 새끼 사이에서 유사하게 태아 혈청 콜레스테롤을 증가시킨다는 것을 확인했습니다.

서론

신경섬유종증 1형(NF1)은 생식세포 유전자 돌연변이로 인해 RAS/MAPK(RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase) 신호 전달 경로가 활성화되는 질환 그룹인 RASopathy로 간주됩니다. NF1 RASopathy 환자는 중심 신경계(시신경 경로 신경교종 1,2, 고급 신경교종 3,4) 및 말초(망상신경섬유종 5,6, 악성 말초 신경초 종양 7,8) 신경계의 양성 및 악성 종양, 뼈 이형성증9 및 피부 색소 이상10을 포함한 다양한 증상이 나타날 위험이 있다 (겨드랑이 주근깨, Café-au-Lait Macules). 이 장애가 인지 및 신경 발달에 미치는 영향은 점점 더 많이 인식되고 있으며, NF1 환자는 학습 결손, 과잉 행동 및 자폐 스펙트럼 장애의 발병률이 증가합니다 11,12,13. 그러나, 환자 13,14,15,16,17 사이에서 이러한 표현형의 발달에는 상당한 이질성이 존재하며, 일부 환자는 심각한 인지 장애를 보이는 반면 다른 환자는 영향을 받지 않는 이유는 불분명합니다. 산모의 식단으로 인한 비만은 일반 인구의 학습과 행동에 유사한 영향을 미치는 것으로 나타났다 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28이는 NF1에서 차별적인 산모의 식이 노출이 이러한 임상적 이질성의 한 원인일 수 있음을 시사합니다. 특히, 비만인 산모의 자녀는 과잉 행동 18,19,20,23,25,26, 자 폐증 19,24,27, 실행 기능 결핍21,23, 전체 IQ 점수 22,28 발병 위험이 증가합니다. 그러나 NF1 환자는 비만 및 당뇨병 발병률 감소를 포함하여 일반인에 비해 대사 표현형이 변경되어 29,30,31 식이 자극에 유사하게 반응하는지 여부가 불분명합니다.

이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 Nf1 을 가진 태아의 다량 영양소 프로필에 대한 난생적 식단으로 인한 변화가 신경 발달 변화에 기여하는지 여부를 확인하고자 했습니다. 우리는 이전에 태아의 뇌32에서 신경 발달 응용 분야에 적합한 고품질의 전체 및 국소적으로 미세 절개 된 조직을 수집했습니다. 그러나 태아의 혈액 채취는 작은 체구와 낮은 혈액량 때문에 까다롭다33. 참수 후 중력 보조 배액을 통한 혈액 수집은 샘플에서 낮은 수집 양과 심각한 용혈을 초래했으며, 이는 다운스트림 애플리케이션 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 이전에보고된 바와 같이 태아의 심장 또는 흉부에서 흡인을 통한 채취는 기술적으로 어려웠고 빈번한 용혈을 초래했다. 따라서 우리는 심각한 전단 응력 없이 더 많은 양의 수집을 가능하게 하기 위해 특수 모세관을 사용하는 태아 혈청 수집 방법을 개발했습니다.

여기에서는 자궁 내 고지방, 고설탕 식단과 대조 식단에 노출된 Nf1-이형접합 새끼로부터 배아 뇌와 태아 혈청을 동시에 수집하는 이 방법을 제시합니다(그림 1 및 보충 표 S1). 뇌는 면역형광에 의한 후속 분석을 위해 냉동 매립되거나 분자 생물학 응용 분야에서 후속 사용을 위해 국소적으로 미세 절개 및 급속 냉동되었습니다. 다량 영양소 프로파일링과 같은 다운스트림 응용 분야에 적합한 고품질 혈청을 얻었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 모계의 고지방, 고자당 식단 노출이 WT 및 Nf1-이형접합 새끼 모두의 혈청 콜레스테롤 수치 상승으로 이어진다는 것을 확인했습니다.

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프로토콜

이 연구의 모든 동물 시술은 NIH 지침을 따랐으며 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 동물들은 표준 12 시간 빛 : 어두운 사이클링과 음식과 물에 대한 무료 접근으로 수용되었습니다.

1. 산모의 식단

  1. 생후 4주에 암컷 쥐를 대조군 차우(CD) 또는 난소 유발 식단(Ob)에 놓습니다.
  2. 생후 8-12주가 되면 정확한 수집 연령을 결정하기 위해 이른 아침에 댐의 점액 플러그를 모니터링하여 시간 교미를 설정합니다. 다이어트로 인한 비만을 확인하려면 짝짓기 시 암컷의 체중을 측정합니다.
    참고 : 초기 짝짓기 설정에는 8-12 주 범위가 사용되어 난소 유발 식단을 먹인 암컷이 다른 암컷에 비해 과체중임을 확인했으며, 이는 생후 8 주까지 항상 발생하지 않았습니다. 플러그가 있는 날은 배아 1일(E1)로 간주되며 이 연구에 사용된 모든 동물은 E19에 수집되었습니다. 후기 태아 시점은 이전에 이 시기에 난생 식단에 노출된 동물에서 관찰된 신경 발달 변화로 인해 선택되었습니다(데이터는 표시되지 않음).

2. 댐에서 태아 제거

  1. 먼저 댐이 중력적으로 보이는지 확인합니다(복부 모양 및 충만감, 복부 촉진 또는 태아 움직임). 의심스러우면 암컷의 체중을 다시 측정하여 체중 증가를 측정하십시오.
    참고: 만삭 임신 쥐는 최소 3-4g의 체중 증가를 보여야 합니다. 원하는 기간 내에 수태될 가능성을 높이기 위해, 수컷의 케이지에서 나온 더러운(소변과 페로몬이 함유된) 톱밥을 짝짓기 전 3일 동안 매일 암컷의 케이지에 넣어 발정을 유도할 수 있다34.
  2. 댐을 이소플루란 3mL가 들어 있는 종이 타월이 있는 챔버에 넣고 댐과 마취제에 적신 종이 타월 사이의 직접적인 접촉을 피하도록 주의하여 안락사시킵니다. 동물을 진정시킨 후 종이 타월에 올려 놓고 꼬리를 잡고 목에 해부 가위를 놓고 가위를 머리 쪽으로 위로 밀어 자궁 경부 탈구를 수행합니다. 또는 이소플루란 진정 후 참수를 수행합니다.
    참고: 이 단계에서 댐에서 혈청을 채취할 수 있으며, 아래에 설명된 것과 유사한 방법을 사용하지만 더 큰 모세관을 사용할 수 있습니다. 이것이 필요한 경우, 자궁 경부 탈구보다는 참수를 시행해야 합니다. 안락사 직전에 이소플루란의 투여에 의해 관심의 표현형이 변경되지 않도록 주의해야 합니다.
  3. 댐 복부 쪽을 위로 향하게 하여 100mm 접시에 놓습니다. 복부를 덮고 있는 피부를 끼우고 해부 가위로 정중선을 절개합니다. 정중선 절개 부위에 수직으로 추가 절개를 하여 피부 플랩을 만들어 배아가 들어 있는 자궁을 노출시킵니다.
  4. 자궁을 복강 밖으로 빼냅니다. 가위를 사용하여 자궁을 댐에서 분리하십시오. 배아가 들어 있는 온전한 배아 주머니("끈에 달린 진주")를 차가운 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 있는 접시에 넣습니다. 태아의 접시를 얼음 위에 놓습니다.
    알림: 각 깔짚에는 일반적으로 뇌와 혈청을 위해 수확될 6-10마리의 새끼가 포함되어 있기 때문에 태아는 조직 분해를 피하기 위해 얼음 위에 보관됩니다. 새끼를 얼음 위에 올려놓는 것은 또한 산모의 안락사만으로는 항상 충분하지 않을 수 있기 때문에 새끼의 적절한 안락사를 보장합니다. 혈청 채취만 원하는 경우 실온 채취가 선호될 수 있습니다.

3. 태아 혈청 수집

  1. #5 집게로 조심스럽게 해부하여 배아 주머니에서 태아를 제거합니다. 신선하고 차가운 멸균 1x PBS가 있는 곡선형 겸자를 사용하여 배아를 접시에 옮깁니다.
  2. 종이 타월로 동물을 부드럽게 닦아 표본에서 잔류 양수와 PBS를 제거합니다.
  3. 동물의 복부를 잡습니다. 복부 목을 절개하여 마이크로 가위로 동물의 목을 부분적으로 절단합니다. 혈관이 절단되었지만 머리를 지탱하는 피부는 여전히 붙어 있는지 확인하십시오.
    알림: 몸과 머리에서 동시에 혈액을 수집할 수 있도록 머리가 붙어 있어야 합니다.
  4. 절개 부위가 아래를 향하도록 45° 각도로 몸을 잡습니다. 50μL 미니벳(모세관)을 혈액이 비말을 형성하는 댐의 절개 부위와 평행하게 잡습니다. 50μL 모세관에 혈액이 채워지도록 조심스럽게 합니다.
    참고: 모세관 x2 또는 100 μL 모세관은 최대 ~75 μL의 혈액을 수집하는 데 사용할 수 있습니다.
  5. 추가 조직 수집을 위해 차갑고 멸균된 60x PBS가 들어 있는 신선한 1mm 접시에 머리를 놓습니다(섹션 4).
  6. 혈액이 모세관 내에 들어오면 플런저를 1.5mL 튜브에 빠르게 밀어 넣습니다. 튜브를 튕기거나 빠르게 돌려 혈액이 튜브 바닥에 있는지 확인합니다.
  7. 나머지 깔짚에 대해 반복합니다.
    알림: 새끼를 얼음 위에 유지하고 빠르게 이동하는 것은 수집량을 제한하는 사후 응고의 위험을 줄이는 데 필수적입니다.
  8. 실온에서 30분 동안 혈액을 응고시킵니다.
  9. 혈액 샘플을 4°C, 16,000× g에서 20분 동안 원심분리합니다.
  10. 튜브 바닥의 혈액 세포 펠릿을 방해하지 않고 200μL 피펫을 사용하여 혈청을 새 500μL 튜브로 옮깁니다.
    참고: 세럼은 붉은 부스러기가 없는 밀짚 색이어야 합니다. 각 태아는 15-30 μL의 혈청을 생산해야 합니다.
  11. 수집된 혈청을 -80°C에서 보관합니다.

4. 태아 뇌 채취

  1. 해부 현미경을 통해 구부러진 집게를 사용하여 주둥이를 잡고 #5 집게를 사용하여 두개골 캡에서 피부를 조심스럽게 벗겨내고 주둥이에 부착하여 쉽게 잡을 수 있도록 합니다. 각도 #5 겸자를 두개골에 대해 45°로 하고, 발달 중인 두개골인 투명한 막을 조심스럽게 뚫고, 겸자를 두개골과 평행하게 이동하고, 두개골 뚜껑 아래에 삽입한 다음 한쪽으로 꼬집고 벗겨냅니다. 한쪽 면을 제거한 후 나머지 면을 #5 집게로 잡고 반대쪽으로 벗겨냅니다.
  2. 마이크로 스푼을 사용하여 두개골에서 뇌를 부드럽게 퍼내고 차가운 1x PBS가 들어있는 신선한 60mm 접시에 뇌를 옮깁니다.
    참고: 이 시점에서, 면역염색을 위해 뇌 전체를 고정하고 내장할 수 있습니다. 이전에 발표된 방법론32 참조.
  3. 다른 분자 응용 분야를 위해 조직을 스냅 동결해야 하는 경우 관심 영역을 하위 절개합니다. 외측, 제3, 제4 뇌실 주위의 뇌실 주위 조직의 격리는 아래에 설명되어 있습니다.
    1. 구부러진 집게를 사용하여 주로 사용하지 않는 손으로 뇌를 뒷뇌와 전뇌의 접합부에 잡습니다. 주로 사용하는 손으로 칼날이 뇌 표면과 평행하게 메스를 잡습니다. 중간 피질 부위를 꾹꾹 누릅니다(그림 1).
    2. 여전히 뒷뇌를 잡고 있다가 뒷뇌 앞쪽을 두 번째 절개하여 전뇌와 분리합니다(그림 1). 가장 앞쪽 부분에서 수평면 내에 위치한 두 개의 작은 반원형 공간, 즉 외측 심실을 찾으십시오. 각 심실 중앙에 배치된 구부러진 겸자를 사용하여 뇌를 제자리에 고정하고 #5 겸자를 사용하여 내막을 조심스럽게 절개한 다음 깨끗한 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 제거합니다.
    3. 중간 부분에서, 세 번째 뇌실인 복부 표면에 작은 선형 공간을 찾으십시오. #5 겸자를 사용하여 심실 표면 양쪽의 내벽을 조심스럽게 집어낸 다음 깨끗하고 깨끗한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 제거합니다.
    4. 가장 뒤쪽 부분에서, 네 번째 뇌실인 후뇌 중앙에 있는 작은 선형 공간을 찾으십시오. #5 겸자를 사용하여 양쪽의 안감을 절개한 다음 깨끗하고 깨끗한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 제거합니다.
      참고: 뒷뇌를 자르는 것이 깨끗한 절단이 아닌 경우 제4뇌실 조직이 가려지거나 파괴될 수 있습니다.
    5. 4.3.2-4.3.4 단계의 경우 조직을 미세 원심 분리 튜브에 넣은 직후 튜브를 액체 질소가 들어있는 극저온 안전 용기에 빠르게 넣습니다.
      알림: 튜브는 나머지 샘플이 해부될 때까지 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 주의 : 액체 질소는 심각한 동상을 유발할 수 있습니다. 액체 질소에 직접 손을 집어넣지 말고 튀지 않도록 하십시오.
    6. 냉동 튜브를 드라이 아이스에 놓고 사용할 때까지 냉동 티슈를 -80 °C 냉동고에 옮깁니다.

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결과

이 기법을 통해 수득된 뇌 조직의 품질을 설명하기 위해, 우리는 이전에 보고된 기법32에 따라 GFAP에 대해 면역염색된 Nestin-CFPnuc 마우스(35)로부터의 샘플 태아 뇌를 보여준다. Nestin+ 세포는 외측 심실을 감싸고 있으며(그림 2A), GFAP+ 필라멘트가 표면에서 뻗어 있습니다. CD의 외측 심실에서 Nestin 또는 GFAP 발현과 WT 또는 Nf1-이형접합 균주에서 Ob-노출된 마우스의 차이는 관찰되지 않았습니다(그림 2A, B). 다음으로 미세절개된 조직의 품질을 평가했습니다. 우리는 먼저 CD의 외측 심실에서 분리된 미세절개 조직에서 Ob에 노출된 마우스에 대해 하우스키핑 단백질 β-actin에 대해 웨스턴 블로팅

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토론

생쥐로부터 혈액을 채취하는 전통적인 방법에는 후불, 꼬리 정맥, 복재정맥, 안면 정맥 및 경정맥 출혈이 포함된다 40,41,42. 불행히도, 이러한 방법은 동물의 크기와 작고 섬세한 혈관 구조로 인해 배아 혈액 수집에 이상적이지 않습니다. 참수 후 중력 보조 배액을 통한 혈액 수집은 샘플에서 낮은 수집량과 심각한 용혈을 초래했습니다. 이전 프로토콜은 흉부 혈관에서 혈액을 배출하기 위해 변형된 20G 바늘을 사용함으로써 부피가 개선되었다고 보고하였다33; 그러나 우리는 이 기술이 기술적으로 어렵다는 것을 알았고 용혈률이 높기 때문에 많은 다운스트림 응용 분야에 적합하지 않았습니다. 우리의 방법은 수동적 혈류를 통해 채취하는 장점이 있어 흡인으로 인한 순전한 스트레...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

N Brossier는 Neurofibromatosis Therapeutic Acceleration Program(NTAP, Grant # 210112)에서 자금을 지원하는 신경섬유종증 임상 및 중개 연구의 Francis S. Collins 장학생 프로그램의 지원을 받습니다. 이 출판물은 존스 홉킨스 의과대학(Johns Hopkins University School of Medicine)의 NTAP의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 존스 홉킨스 대학교 의과 대학의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 세인트루이스 아동병원(FDN-2022-1082 to NMB) 및 세인트루이스 당뇨병 연구 핵심(NIH P30 DK020579)의 워싱턴 대학교의 추가 지원. 현미경 검사는 Washington University School of Medicine, The Children's Discovery Institute of Washington University, St. Louis Children's Hospital(CDI-CORE-2015-505 및 CDI-CORE-2019-813) 및 Foundation for Barnes-Jewish Hospital(3770 및 4642)의 지원을 받는 Washington University Center for Cellular Imaging(WUCCI)을 사용하여 수행되었습니다. Nestin-CFPnuc35 마우스는 Grigori Enikolopov (Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, NY)에 의해 아낌없이 제공되었고, R681X 또는 C383X 생식세포 돌연변이 32,38,39에 대한 Nf1 마우스는 David Gutmann (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO)에 의해 아낌없이 제공되었다. 그림 1은 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#5/45 펜치뒤몽 11251-35팁 모양: 각도 45°C;
4200 TapestationAgilentG2991BARNA 무결성 및 품질 확인, RIN 값 측정
벤치탑 액체 질소 용기Thermo Fisher2122또는 기타 극저온 안전 용기
Control ChowPicoLab5053Research diets D12328(저지방, 저당)도 사용할 수 있습니다.
곡선형 펜치콜 파머UX-10818-25팁 모양: 곡선형 90도;
해부 블레이드 핸들Cole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, #10 to #15 블레이드
EMS SuperCut 해부 가위전자 현미경 과학72996-015½ " (139.7 mm), 스트레이트
GFAP 항체Abcamab7260희석 1:350. 0.3M 글리신을 함유한 10% 혈청으로 차단합니다.
Glassvan 탄소강 수술용 칼날, 크기 11MYCO 의료2001T-11#11 칼날은 직선적이고 평평한 절단을 허용합니다
마이크로 랩 스푼Az ScilabA2Z-VL001스테인리스 스틸, 오토클레이브
가능한 마이크로 가위Rubis78180-1C3모델 1C300
Minivette  POCT 중립Sarstedt17.2111.050공칭 부피: 50 &마이크로; L, 준비없이
NanoropThermo Fisher13-400-519RNA 농도 측정, 260/280 비율
비만 다이어트Researchdiets.comD12331고지방, 고 자당
총 콜레스테롤 시약Thermo FisherTR13421비색 검출
및 베타; -액틴 항체세포 신호8457묽게 1 : 1,000.
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참고문헌

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