수경 재배 조건에서 Arabidopsis thaliana 뿌리에 대한 박테리아 집락 측정

단일 박테리아 균주에 의한 rhizosphere colonization을 감지하기 위한 정량적 및 정성적 방법이 있습니다. 정성적 방법의 경우 형광을 구성적으로 표현하는 균주를 사용해야 하며 형광 분포 및 강도는 형광 현미경 또는 레이저 공초점 기기 ^1,2에서 검사해야 합니다. 이러한 전략은 현장 박테리아 집락화(bacterial colonization in situ³)를 잘 반영할 수 있지만, 정량화에서 기존의 플레이트 계수 방법만큼 정확하지는 않습니다. 게다가, 현미경으로 부분적인 뿌리 영역만 표시하는 제한으로 인해 때때로 주관적인 편향의 영향을 받을 수 있습니다.

여기에서는 집락화된 박테리아 세포를 수집하고 플레이트의 박테리아 CFU를 계수하는 것을 포함하는 정량적 방법을 설명합니다. 이 방법은 식물 뿌리에서 제거 된 집락화 된 균주를 계산할 수있는 희석 및 도금을 기반으로하며 뿌리의 총 집락화 된 박테리아 수를 계산할 수 있습니다 ^4,5.

먼저, A. thaliana 를 수경 재배 조건에서 배양 한 다음 박테리아 세포를 0.01 OD₆₀₀의 최종 농도로 rhizosphere에 접종했습니다. 감염된 뿌리 조직을 접종 2일 후에 채취하고 멸균수로 세척하여 집락화되지 않은 박테리아 세포를 제거했습니다. 또한, 뿌리에 집락화된 박테리아 세포를 수집하여 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 희석하고, Luria-Bertani(LB) 한천 배지에 도약했습니다. 37°C에서 10시간 동안 배양한 후, LB 플레이트의 단일 콜로니를 계수하고 정규화하여 뿌리에 콜로니화된 박테리아 세포를 결정했습니다.

이 방법은 적용 가능성이 높고 반복성이 우수하며 정확한 rhizosphere 박테리아 집락화 측정에 더 적합합니다.

1. 멸균 수경 A. thaliana 재배

1. A. thaliana 묘목을 준비합니다.
   1. 1/2 MS 배지(Murashige 및 Skoog)와 2%(wt/vol) 자당 및 0.9%(wt/vol) 한천으로 구성된 배양 A. thaliana 묘목 배지를 준비합니다.
   2. 응고하기 전에 준비된 멸균 매체를 멸균 사각형 페트리 접시(13cm x 13cm)에 붓습니다. 습도를 유지하기 위해 공기 건조를 피하십시오.
   3. A. thaliana 씨앗을 4°C에서 1mL의 멸균수로 채워진 2mL 미세 원심분리기 튜브에 12시간 이상 담근 다음 씨앗을 2%(vol/vol) NaClO 1mL로 2분 동안 멸균합니다.
   4. 멸균수로 씨앗을 6번 철저히 씻어 NaClO 용액을 제거합니다. 멸균 1mL 팁이 있는 MS 한천 배지를 사용하여 페트리 접시에 씨앗을 뿌립니다.
   5. 통기성 있는 의료용 테이프로 페트리 접시를 밀봉하고 가벼운 인큐베이터에 수직으로 넣어 1주일 동안 자랍니다. 광 인큐베이터 주야간 비율을 16시간/8시간으로 설정하고 온도를 23°C, 습도를 40%-60%로 유지합니다.
2. 이식 A. thaliana.
   1. 40μm 공극 크기의 세포 염색기에 5mm 구멍을 뚫고 멸균합니다.
   2. 세포 여과기의 구멍을 통해 7일 된 A. thaliana 식물 3개를 이식하고 0.5% 자당이 있는 멸균 액체 1/2MS 배지 3mL가 들어 있는 6웰 플레이트에 넣습니다.
   3. 6웰 플레이트를 광 인큐베이터(그림 1A)에 놓고 10일 동안 배양합니다.

2. 세균 배양 및 접종

1. 접종을 위해 세균 현탁액을 준비합니다.
   1. Bacillus velezensis의 경우 박테리아 세포를 멸균 LB 배지에 접종하고 37°C에서 170rpm에서 진탕하여 0.8-1.2의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 배양합니다.
   2. 6000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수집하고 세포를 PBS 완충액(2mM KH_,2PO4, 8mM_Na2HPO4, 136mM NaCl, 2.6mM KCl)에 재현탁시킵니다. 원심분리 및 재현탁 단계를 3회 반복하여 LB 배지와 박테리아 대사 산물을 제거합니다.
   3. 박테리아 세포를 OD₆₀₀ 0.01의 최종 농도에서 새로운 1/2 MS 배지에 현탁시킵니다. A. thaliana 묘목을 자라는 6-well plate에 박테리아 현탁액을 접종하고 6-well plates를 light incubator에 넣고 2일 동안 배양합니다.

3. 뿌리에 서식하는 박테리아 측정

1. 뿌리 조직을 수확하고 집락화된 세포를 도금합니다.
   참고: 모든 단계는 gnotobiotic 조건에서 수행해야 합니다.
   1. 2mL 튜브의 무게를 측정하고 무게를 W₀으로 기록합니다.
   2. 공동 배양된 A. thaliana 뿌리 조직을 수확하고 멸균수로 3회 세척합니다. 여과지에 뿌리를 올려 여분의 물을 제거합니다.
   3. 무게를 잰 마이크로 원심분리기 튜브에 뿌리를 넣고 튜브와 함께 뿌리의 무게를 잰 다음 W₁로 기록합니다.
   4. 각 튜브에 1mL의 PBS를 추가하고 최대 속도로 8분 동안 튜브를 소용돌이칩니다.
   5. 수집된 뿌리 집락화된 박테리아 세포로 현탁액을 1 x ^10-1-1 x ^10-4(박테리아 집락화 능력에 따라)로 희석합니다. LB 한천 배지가 포함된 플레이트에 희석된 박테리아 현탁액을 펴고 37°C에서 10시간 동안 배양합니다.
2. 콜론의 개수를 세고 데이터를 정규화합니다.
   1. LB 플레이트의 박테리아 군집을 계산합니다.
   2. 해당 희석에 따라 CFU를 계산하고 루트 프레시 웨이트(W_{1-W 0})로 데이터를 정규화합니다. 최종 결과는 접종 후 2일 시점에 뿌리 그램당 집락화된 박테리아 세포의 수를 나타냅니다(그림 1B).

A. thaliana rhizosphere에서 이 방법으로 검출된 박테리아 집락 형성 능력의 정확도를 테스트하기 위해 Bacillus velezensis SQR9 WT와 파생 돌연변이 Δ8mcp를 A. thaliana rhizosphere에 별도로 접종했습니다. Δ8mcp는 모든 화학수용체 인코딩 유전자가 결여된 돌연변이이며, 집락화가 현저히 감소했다6. 우리는 현재의 뿌리 집락화 분석으로 접종 후 2일에 그들의 집락을 측정했습니다. 그 결과 Δ8mcp의 뿌리 집락화가 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 이는 이 조건과 방법이 박테리아 집락을 효과적으로 측정한다는 것을 나타냅니다(그림 1C).

그림 1: A. thaliana 의 성장과 Bacillus velezensis SQR9 및 Δ8mcp의 뿌리 집락화. (A) 생후 7일 된 A. thaliana가 수경 재배 상태의 세포 염색기가 있는 6웰 플레이트에서 자라는 모습. (B) 생후 7일 된 A. thaliana의 측면 모습은 6개의 우물 판에서 자라고 있으며, 각 우물에는 3개의 묘목이 있습니다. (C) 제시된 분석을 사용하여 측정한 B. velezensis 야생형 SQR9 및 Δ8mcp 의 집락화. 6번의 반복실험이 포함되었으며 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이 기사의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.