RNA 간섭(RNAi)의 조작은 Trichogramma 말벌과 같이 크기가 작은 많은 기생충 종에서 만만치 않은 도전을 제시합니다. 이 연구는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 설명했습니다. 본 방법론은 Trichogramma 말벌의 유전자 조절을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
알 기생충인 Trichogramma spp는 농업과 산림에서 다양한 나비목 해충에 대한 효율적인 생물학적 방제제로 인정받고 있습니다. Trichogramma 자손의 미성숙 단계는 숙주 난자 내에서 발달하여 현저한 작음(성인 길이 약 0.5mm)을 나타냅니다. RNA 간섭(RNAi) 방법론은 수많은 유기체의 유전자 기능을 규명하기 위한 중요한 도구로 부상했습니다. 그러나 Trichogramma와 같은 특정 작은 기생충 종에서 RNAi를 조작하는 것은 일반적으로 상당한 도전을 제기했습니다. 이 연구에서는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 제시합니다. 간략하게 설명된 절차에는 숙주 난자에서 개별 T. dendrolimi 검체의 획득 및 분리, 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 설계 및 합성, T. dendrolimi 번데기의 체외 이식 및 배양, dsRNA의 미세 주입 및 RT-qPCR 분석을 통한 표적 유전자 녹다운의 후속 평가가 포함됩니다. 이 연구는 T. dendrolimi에서 RNAi 실험을 수행하기 위한 포괄적이고 시각적으로 상세한 절차를 제공하여 연구원이 이 종의 유전자 조절을 조사할 수 있도록 합니다. 또한 이 방법론은 약간의 조정으로 다른 Trichogramma 종의 RNAi 연구 또는 미세 주입에 적용할 수 있으므로 다른 기생충 종에서 RNAi 실험을 수행하는 데 귀중한 참고 자료가 됩니다.
서론
Trichogramma spp.는 전 세계 농업 및 산림 생태계에서 광범위한 나비목 해충에 대한 고효율 생물학적 방제제로 광범위하게 활용된 계란 기생충 그룹입니다 1,2,3,4. 대량 사육 Trichogramma의 적용은 해충의 지속 가능한 관리를위한 환경 친화적 인 접근 방식을 제공합니다 5,6,7. Trichogramma 말벌의 분자 생물학을 이해하면 유전자 조절 및 게놈 편집 방법론을 조사하여 이러한 생물학적 방제제 8,9의 대량 사육 효율성과 현장 성능을 향상시키는 데 귀중한 통찰력을 제공합니다10.
1998년 예쁜꼬마선충(Caenorhabdi....
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프로토콜
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기, 소프트웨어 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 곤충 배양의 수집 및 유지
- 아라비아 고무 분말과 물 5,000 : 9의 1 : 5 (v / v) 용액을 사용하여 Corcyra cephalonica (Stainton)의 ~ 16 개 알을25,26cm 카드에 부착합니다.
알림: 과밀로 인해 후속 이송 및 해부 절차가 불가능하므로 카드에 너무 많은 숙주 알을 부착하지 마십시오. - 숙주 알의 부화를 방지하려면 숙주 알 카드를 30분 동안 자외선(UV) 조사에 노출시킵니다(그림 1-i). 그런 다음 비활성화 계란이 있는 종이를 두께 1cm, 직경 8cm의 계란 카드로 자르고 각각 약 300-500개의 계란을 포함합니다(그림 1-ii)25,26,27.
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결과
dsFerhch를 주입한 번데기(T. denrolimi 번데기)의 출현율은 dsGFP를 주입한 번데기 또는 주입하지 않은 번데기의 출현률보다 현저히 낮았다(표 1). 출현한 말벌 중 dsFerhch를 투여받은 T. denrolimi 말벌의 51.85%가 변형된 작은 날개를 발달시켰다. 변형된 말벌은 dsGFP를 주입하거나 주입하지 않은 말벌에서 관찰되지 않았다(표 1). 또한, dsFerhch를 주입한 T. denrolimi 번데기의 복부는 비정상적인 철 대사의 표현형인 흑색증을 나타냈다23. 멜라니즘은 dsGFP를 주입한 T. denrolimi 번데기 또는 주사하지 않은 번데기에서는 관찰되지 않았습니다(그림 4)........
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토론
Trichogramma 말벌은 특히 농업 및 임업에서 다양한 나비목 해충을 표적으로 하는 효과적인 생물학적 방제제로 인식되고있습니다 1. 이 작은 말벌은 숙주 알 내에서 미성숙 단계를 거치는데, 이는 RNAi 실험 5,18을 수행하는 데 어려움을 주는 특성입니다. 이 연구는 T. denrolimi에서 RNAi 실험을 수행하기 위한 포괄적인 시각적 가이드를 제공합니다. Trichogramma 종 간의 생물학적 특성을 공유한다는 점을 감안할 때, 이 절차는 약간의 조정을 통해 다른 Trichogramma 종 및 내생충 종의 RNAi 연구 또는 미세 주입에 쉽게 적용할 수 있습니다.
이 시술은 dsRNA 함량의 효율적인 마이크로 주입을 촉진하고, T. denrolimi.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32172476, 32102275)의 프로젝트, 농업 과학 및 기술 혁신 프로그램 (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) 및 지역 과학 및 기술 개발을 이끄는 중앙 기금 (XZ202301YD0042C)의 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | dsRNA 서열을 증폭하기 위해 |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, China | n/a | 배양 배지를 만들기 위해 |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | 만들기 위해 배양 배지 |
| Bioer 항온 금속 수조 | BIOER, 중국 | MB-102 | dsRNA |
| 붕규산 유리 모세관을 합성하려면 | WPI, 미국 | 1B100-4 | 모세관 유리 바늘을 당기기 위해 |
| 벤치를 청소하십시오 | Airtech, 중국 | SW-CJ-1FD | RNA |
| 이중 증류수를 | Sangon Biotech, 중국 | A500197-0500 | 를 희석하기 위해 |
| 일본 파나소닉 | MLR-352H-PC | T. denrolimi | |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, 독일 | 5418R | RNA 함량 저장 |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, 독일 | FemtoJet 4i | T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge를 주입하기 위해 | Eppendrof, 독일 | 5810R | 원심 분리기 |
| 에탄올 용액 (75 %, RNase-free) | 알라딘, 중국 | M052131-500ml | RNA |
| 젤 추출 키트 | 오메가, 미국 | D25000-02 | cDNA |
| 껌 아랍어 | Solarbio, 중국 | CG5991-500g | 계란 카드 |
| 이소 프로필 알콜 | 알라딘, 중국 | 80109218 | RNA를 추출하기 위해 |
| 레이저 기반 마이크로피펫 풀러 | SUTTER, 미국 | P-2000 | 모세관 유리 바늘을 당기기 |
| 위해 마이크로로더 | Eppendrof, 독일 | 20 &마이크로; L | dsRNA |
| 다중 샘플 조직 분쇄기를 로드하려면 | 중국 이끼 | LC-TG-24 | T. denrolimi |
| 니들 그라인더 | SUTTER, USA | BV-10-E | 모세관 유리 바늘을 분쇄하기 |
| 위해 Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, 중국 | RNA를 희석하기 위해 | |
| OLYMPUS 현미경 | OLYMPUS, 일본 | XZX16 | T. denrolimi PCR 기계를 관찰하기 위해 |
| Bio-rad, USA | S-1000 | DNA 증폭용 | |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | dsRNA의 품질을 감지하기 위해 |
| dsGFP 입문서 (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
| dsGFP 입문서 (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
| 입문서 Ferhch qPCR용 (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| 입문서 Ferhch qPCR용 ( Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Ferhch RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
| Ferhch RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
| FoxO 의 입문서 qPCR(Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| qPCR용 FoxO 프라이머(역) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT 시약 키트와 gDNA 지우개(Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하려면 |
| Real-time PCR(TaqMan) 프라이머 및 프로브 설계 도구 | |||
| https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ T7 RiBoMAX Express RNAi 시스템 | Promega, USA | P1700 | dsRNA 합성 in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) | TaKaRa, Japan | RR820A | RT-qPCR |
| 수행 트리클로로메탄 | KESHI, 중국 | GB/T682-2002 | RNA |
| TRIzol 시약 | Ambion, 미국 | 15596018 | 샘플에서 총 RNA 함량을 추출하기 위해 |
| 초저온 냉동고 | 써모, 미국 | Forma 911 |
참고문헌
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al.
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