FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정

Summary

내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.

Abstract

내재적 무질서 영역(IDR)은 중요한 세포 과정에 관여하는 단백질 영역입니다. 스트레스 조건 동안 세포 환경의 물리화학적 특성이 변하여 IDR의 구조적 앙상블에 직접적인 영향을 미칩니다. IDR은 본질적으로 환경 섭동에 민감합니다. 세포의 물리화학적 특성이 IDR의 구조적 앙상블을 어떻게 조절하는지 연구하는 것은 IDR 기능의 환경적 제어를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 고삼투압 스트레스 조건에 반응하여 살아있는 맥주효모균 세포 에서 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 단계별 방법을 설명합니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 삼투질이 있는 세포에 가해지는 고삼투압 스트레스가 점진적으로 증가하는 동안 IDR의 전체 치수가 어떻게 변하는지 추정합니다. 또한 형광 측정을 처리하고 다양한 IDR에 대한 구조적 감도를 비교하기 위한 스크립트를 제공합니다. 이 방법을 따름으로써 연구자들은 환경 변화에 따라 복잡한 세포 내 환경에서 IDR이 겪는 구조적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Introduction

본질적으로 무질서한 영역(Intrinsically disordered regions, IDR)은 세포 과정의 중요한 구성 요소입니다¹. 구조화된 도메인과 함께 IDR은 단백질 기능에 필수적입니다. IDR의 아미노산 조성은 편향되어 있으며, 주로 하전, 친수성 및 작은 잔류물로 대표됩니다. 이 속성 때문에 IDR은 복잡성이 낮은 도메인 ^2,3으로 간주됩니다. 수많은 IDR이 주목을 받고 있는데, 이는 주로 이 부위가 병리학적 상태, 특히 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 하기 때문입니다. 이러한 질환은 뉴런에서 IDR의 자가 조립(self-assembly)과 그에 따른 세포외 또는 세포내 침착(extracellular 또는 intracellular deposition)을 특징으로 한다⁴. 이러한 IDR의 예로는 알츠하이머병의 아밀로이드-β(Aβ), 헌팅턴병의 헌팅틴(HTT), 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 치매의 육종(FUS)에서 융합된 TAR DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 및 융합 등이 있다⁴. 질병의 맥락에서 IDR의 구조적 재배열에 대한 연구는 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 포함한 분광법에 의해 크게 향상되었습니다.

IDR의 친수성 및 확장 특성으로 인해 용액 환경의 물리화학적 특성 변화에 매우 민감합니다⁵. IDR의 구조적 앙상블이 환경에 의해 변형되는 정도를 구조적 민감도 ^5,6,7이라고 합니다. 원형 이색법(CD) 및 소각 X선 산란(SAXS^)8,9을 포함하여 IDR의 형태와 역학을 연구하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 안타깝게도 CD와 SAXS는 정제된 단백질을 대량으로 필요로 하기 때문에 세포 연구에는 적합하지 않습니다. 대조적으로, FRET는 하나의 IDR을 특이적으로 표지하는 두 형광 분자의 형광 강도를 측정하는 기술이며, 이는 살아있는 세포⁽¹⁰)와 같은 복잡한 혼합물에서 모니터링할 수 있음을 의미합니다. 살아있는 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 동적으로 측정하는 것은 환경이 무질서한 단백질체의 형태와 기능을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 필요합니다.

FRET는 살아있는 세포의 구형 및 다영역 단백질뿐만 아니라 IDR의 구조적 민감도를 정량화하는 강력한 방법입니다. 이 방법에는 FRET 쌍으로 알려진 두 개의 형광 단백질(FP) 사이에 끼워진 관심 IDR로 구성된 구성이 필요합니다. 이 프로토콜의 경우, IDR 민감도에 대한 이전 연구에서 보고된 다른 FP와 비교하여 동적 범위가 넓기 때문에 mCerulean3를 공여체 FP로, 황수정을 수용체 FP로 사용할 것을 제안합니다⁶. FRET는 이전에 다양한 세포 환경에서 식물 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 데 활용되었습니다⁶. 또한, 이 기술은 in vitro 및 in vivo ^5,11 모두에서 다양한 연구 그룹에 의해 IDR의 전체 단백질 치수를 특성화하는 데 사용되었습니다.

여기에서는 살아있는 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 연구하기 위한 앙상블 FRET 방법을 설명합니다. AtLEA4-5라는 플랜트 IDR을 기반으로 하는 대표적인 결과를 보여줍니다. AtLEA4-5는 용액에서 무질서하지만, 시험관 내에서 고분자 군집이 유도되면 α나선으로 접힌다 ¹². AtLEA4-5는 상대적으로 작고(158개 잔기), 무질서하며 in silico 및 in vitro ^6,12에서 보고된 바와 같이 환경 섭동에 민감하기 때문에 이 방법에 대한 좋은 참조 모델입니다. 여기에 제시된 방법은 효모 세포가 성장하기 쉽고 처리가 소량으로 적용되기 때문에 고처리량 접근법에 맞게 확장할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에 대한 작은 변형은 박테리아 및 식물 세포와 같은 다른 세포 시스템에 적용될 수 있다⁶. 이 프로토콜은 대부분의 연구 기관에서 사용할 수 있는 장비인 형광 모드가 있는 마이크로플레이트 리더에 액세스할 수 있는 모든 분자 생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

Protocol

1. 플라스미드 구성

1. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 원하는 IDR을 코딩하는 개방형 판독 프레임(ORF)을 증폭합니다. ORF는 형광 단백질을 암호화하는 유전자 옆에 있기 때문에 정지 코돈을 포함하지 마십시오. 증폭을 위해 SacI(5') 및 BglII(3') 제한 부위를 사용하여 프라이머를 설계합니다.
   참고: 대표 결과 섹션의 경우 AtLEA4-5를 선택한 IDR로 사용했습니다. pTrc99A-AtLEA4-5 플라스미드¹²에서 AtLEA4-5의 ORF를 증폭했습니다.
2. ORFPCR 산물을 Sac I 및 BglII 효소¹³으로 연속 제한하여 절단한다.
3. Addgene(https://www.addgene.org/178189/)에서 상용 플라스미드 pDRFLIP38-AtLEA4-5(#178189)를 얻습니다.
4. Sac I 및 BglII 효소를 사용하여 pDRFLIP38-AtLEA4-5 플라스미드에서 AtLEA4-5 ORF를 제거하고, FRET 쌍¹³을 포함하는 개방 플라스미드를 남깁니다.
5. 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로부터 겔 회수를 이용하여 분해된 DNA 단편을 정제한다¹⁴. DNA 리가아제¹⁵를 사용하여 제한된 단편을 결찰합니다.
6. 클로닝 반응을 유능한 대장균 세포(DH5α 또는 관련 균주)로 형질전환하고 50μg/mL 암피실린¹⁶을 함유하는 Luria-Bertani(LB) 플레이트에서 선택합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안(ON) 성장합니다.
7. PCR¹⁷에 의해 새로운 플레이트 및 유전자형에서 최소 5개의 형질전환된 콜로니를 분리하고 성장시킵니다. 표준 miniprep 방법¹⁸을 사용하여 양성 형질전환된 콜로니에서 플라스미드 DNA를 정제합니다.
8. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 플라스미드 DNA의 추출 및 무결성을 검증합니다¹⁹. Sanger 염기서열분석²⁰을 사용하여 작제물의 올바른 클로닝을 검증합니다.

2. 효모 세포의 플라스미드 발현

알림: 표준 무균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 배양 층류 후드 또는 라이터를 사용하십시오.

1. S. cerevisiae BJ5465(ATCC: 208289) 균주 줄무늬를 3mL의 YPD(Yeast Peptone Dextrose) 배지에 접종하고 30°C 및 200rpm에서 ON으로 성장시킵니다.
   참고: BJ5465는 IDR 작업에 권장되는 프로테아제 결핍(CH1) 균주입니다. 다른 S. cerevisiae 균주를 테스트하고 사용할 수 있습니다.
2. 하룻밤 포화(OD₆₀₀ ~ 3-4) 효모 배양 1mL를 14,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 튜브를 부드럽게 튕겨 펠릿을 Tris-EDTA(TE) 완충액(pH 7.5) 1mL에 재현탁시킵니다. 14,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
4. 피펫팅을 통해 펠릿을 500μL의 Lazy Bones 완충액(40% w/v PEG 3,350, 100mM 리튬 아세테이트, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시킵니다. 끓인 연어 정자 DNA(100°C에서 5분 동안 5분 동안 냉각한 후 얼음에서 5분 동안 냉각) 25μL를 재현탁 효모 세포에 추가합니다.
5. 혼합물에 100ng의 플라스미드 DNA를 첨가하고 혼합물이 완전히 섞이도록 1분 동안 혼합물을 소용돌이칩니다. 혼합물을 실온에서 1-2시간 동안 그대로 두십시오.
6. 효모 혼합물을 42°C에서 12분 동안 열충격한 다음 얼음에서 12분 더 식힙니다. 튜브를 14,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
7. 펠릿을 1mL의 TE 완충액(pH 7.5)에 재현탁시킵니다. 형질전환된 세포 100μL를 우라실(SD-ura) 플레이트가 없는 효모 합성 드롭아웃 배지에 15g/L 한천으로 플레이트합니다.
8. 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 배양합니다(그림 1). 새 플레이트에 최소 5개의 효모 형질전환체를 줄무늬로 만들고 계속 성장시킵니다.

3. 효모 형질전환체의 검증

1. 5μL의 20mM NaOH를 개별 PCR 튜브에 부드럽게 긁어내고 재현탁하여 각 형질전환 후보 물질의 작은 부분을 선택합니다.
2. 샘플을 99°C에서 열 순환기에서 10분 동안 가열하여 세포를 용해하고 DNA를 용액으로 방출합니다. 이 단계는 PCR을 위한 DNA 템플렛을 준비하기를 위해 결정적이다.
3. 끓인 샘플 1μL를 유전형 분석을 위한 적절한 프라이머와 PCR 시약이 포함된 별도의 PCR 반응 혼합물로 옮깁니다. 우리는 다음 프라이머를 사용했습니다 : 포워드 프라이머 : 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. 리버스 프라이머: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
4. PCR 반응을 설정하고 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 올바른 플라스미드의 존재를 검증합니다. 추가 실험을 위해 하나의 형질전환체를 선택합니다.

4. FRET 분석을 위한 효모 세포 배양 준비

1. 선택한 효모 형질전환체의 줄무늬를 액체 1x SD-Ura 배지 3mL에 접종합니다.
   알림: 이 절차는 층류 후드와 멸균 재료에서 수행하십시오.
2. 포화 상태에 도달하기 위해 30°C, 200rpm에서 최소 12시간 동안 성장합니다. OD₆₀₀을 측정합니다. 성장은 OD₆₀₀ = 1.0-2.0 사이여야 합니다.
   알림: OD₆₀₀ 이 1.0보다 낮으면 세포가 자랄 수 있도록 더 많은 배양 시간을 주십시오. OD₆₀₀ 이 2.0을 초과하면 진행하지 말고 4.1단계부터 다시 시작하십시오.

5. FRET 분석을 위한 효모 세포 준비

1. 하룻밤 동안 효모 배양액 2mL를 수집하고 실온에서 14,000 x g 으로 원심분리합니다. 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
2. 펠릿을 1mL의 50mM 2-(N-Morpholino) 에탄술폰산(MES) 완충액(pH 6)에 재현탁시킵니다.
3. 실온에서 14,000 x g 의 원심분리기. 상층액을 제거합니다.
4. 5.2단계와 5.3단계를 반복합니다. 효모 세포를 2mL의 MES 완충액(pH 6)에 재현탁시키고 부피를 시약 저장소에 붓습니다.

6. 형광 측정 설정

참고: 현재 스캐닝은 형광 모드가 있는 마이크로플레이트 리더에서 수행된 것으로 간주됩니다.

1. 기본 설정의 경우 기기를 다음과 같이 설정하십시오. 측정 유형: 형광 강도(FI) 스펙트럼; 마이크로플레이트 이름: Greiner 96 F-bottom.
2. 광학 설정의 경우 기기를 다음과 같이 설정하십시오. 파장 스캔 포인트 수: 91; 여기 파장: 433nm; 여기 대역폭: 10nm; 방출 파장: 460 - 550; 스텝 폭: 1nm; 방출 대역폭: 10nm; 자동 초점으로 얻은 초점 높이; 초점 거리: 5mm; 이득에 사용되는 파장 : 490nm.
3. 일반 설정의 경우 계측기를 다음과 같이 설정하십시오. 안정화 시간: 0.1초; 읽기 방향: 단방향, 수평 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로.
   알림: 수동으로 입력된 게인은 파장 스캔 전체에서 가장 높은 형광 강도 수준을 표시할 것으로 예상되는 웰을 사용하여 모든 측정에 대해 조정해야 합니다.

7. 고긴장성 용액 및 형광 측정의 준비

1. 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1 M, 1.5 M 및 2 M NaCl의 용액을 96웰 투명 바닥 흑색 플레이트에 준비합니다. 각 웰의 최종 부피는 200μL(삼투압 용액 150μL + 효모 세포 현탁액 50μL)입니다.
   알림: 다른 삼투압은 고삼투압 스트레스를 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 용액은 50mM MES 완충액 pH 6에서 준비해야 합니다.
2. 150μL의 50mM MES 완충액, pH 6을 행 A(A1, A2, A3)의 처음 3개 웰에 로드하고 후속 웰에 해당 용액 150μL를 왼쪽에서 오른쪽으로 증가시키는 순서로 추가합니다(그림 2). 제안된 모든 농도를 테스트하려면 B 행에서 로딩을 계속합니다.
   참고: 이 설정은 각 농도에 대한 3회의 기술 반복실험 측정값을 고려합니다.
3. 12채널 마이크로피펫을 사용하여 50μL의 세척된 효모 세포를 각 웰로 옮깁니다. 효모 세포는 저수지 바닥에 침전되는 경향이 있습니다. 세포를 옮기기 전에 위아래로 피펫팅하여 효모 현탁액을 완전히 재현탁하십시오.
4. 다양한 용액이 들어 있는 96웰 플레이트에 셀을 로드하고 위아래로 최소 4회 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
5. 6단계의 사양 설정으로 마이크로플레이트 리더에서 원하는 웰에 대한 형광 강도 방출 스펙트럼을 즉시 측정합니다. FRET 분석에서 테스트할 모든 IDR에 대해 절차를 반복합니다.
6. 선택적 단계입니다. 가능한 경우 여기에 설명된 단계에 따라 기증자 전용 구성물(pDRFLIP38-mCerulean3)을 측정합니다.
   참고: 이 단계를 수행하여 각 조건의 FRET 효율성을 계산하는 것이 좋습니다. 판독기가 이 단계를 수행할 수 없는 경우 FRET 비율 방법을 사용하여 FRET를 계산할 수 있습니다. FRET 계산을 위한 두 가지 방법 모두 8단계와 9단계에서 설명합니다.
7. 모든 구성에 대해 3일 동안 최소 3번의 반복실험을 수행합니다.

8. FRET 효율 방법을 이용한 데이터 처리

참고: R 프로그래밍 언어에 대한 지식이 있는 독자를 위해 이 섹션에 설명된 데이터 처리를 수행하기 위한 R 스크립트 집합을 제공합니다. 스크립트는 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 에서 찾을 수 있습니다. README 파일의 지침을 따릅니다.

1. 마이크로플레이트 리더에서 .xlsx 파일로 데이터를 내보냅니다.
2. 모든 스캔 파장에서 형광 강도 값을 사용된 FRET 쌍의 등면점으로 정규화합니다.
   알림: 이 단계는 테스트된 모든 조건의 스펙트럼을 비교하는 데 필요합니다. mCerulean3 및 Citrine FRET 쌍의 동석점은 515nm입니다. 예를 들어, 460nm/515nm, 461nm/515nm, 462nm/515nm 등의 형광 강도 값의 비율을 구합니다.
3. 형광 값이 정규화되면 모든 기술 반복실험에 대한 평균을 계산합니다. 전체적으로 고삼투압 스트레스의 모든 조건에 대한 열이 있어야 합니다.
4. 동일한 플롯에서 모든 형광 강도 스펙트럼을 시각화합니다(그림 3). 각 스펙트럼은 개별 mCerulean3 및 Citrine의 형광 방출 스펙트럼의 조합을 표시해야 합니다. 드문 경우지만 FRET 효율이 0인 경우 donor 형광 방출 스펙트럼만 관찰되거나 FRET 효율이 1인 경우 acceptor 형광만 관찰됩니다. mCerulean3(donor)의 형광 방출 피크는 475nm이고 황수정(수용체)의 형광 방출 피크는 525nm입니다.
5. 형광 측정이 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 일반적인 FRET 변화를 표시하는지 확인합니다. IDR의 형태가 처리에 민감한 경우 이는 FRET 효율의 변화로 반영됩니다. FRET 효율의 일반적인 변화는 공여체의 형광 강도 감소와 수용체의 형광 강도 증가를 결합하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
6. FRET 효율(E_FRET)을 정량화합니다. IDR 구조에 대한 공여체(mCerulean3) 정규화된 피크 값(475nm/515nm)과 모든 고삼투압 스트레스 조건에 대한 공여체 전용 구성물을 얻습니다. 기술 반복실험의 평균 정규화 피크 값을 사용합니다. 세 개의 독립 반복실험 각각에 대해 이 작업을 수행합니다. 다음 공식으로 E_FRET 를 계산합니다.
   
   여기서,_{I DA} 는 IDR 작제물로부터의 비율 475 nm/515 nm (FRET 쌍 작제물)이고,_ID 는 공여-단독 작제물로부터의 비율 475 nm/515 nm이다.
7. FRET 효율성을 비교합니다. 모든 고삼투압 스트레스 조건의 E_FRET 값을 비스트레스 조건의 E_FRET 로 정규화합니다(예: 0M NaCl). 상자 그림 또는 평활 곡선 그림을 사용하여 비교합니다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 수행한 후 사후 Tukey 통계 검정(p-값: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)을 수행합니다.

9. FRET 비율 방법을 사용한 데이터 처리

알림: 기증자 전용 측정값을 얻을 수 없는 경우 FRET 비율 방법을 수행하십시오. 이 방법은 서로 다른 고삼투압 스트레스 조건에서 FRET 비율을 비교합니다. 7.1-7.5단계는 일반적인 FRET 동작의 유효성을 검사하기 위해 이 섹션의 단계 전에 수행해야 합니다. R 프로그래밍 언어에 대한 지식이 있는 독자를 위해 이 섹션에 설명된 데이터 처리를 수행하기 위한 R 스크립트 집합을 제공합니다. 스크립트는 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 에서 찾을 수 있습니다. README 파일의 지침을 따릅니다.

1. 475nm 및 525nm의 데이터를 이전에 마이크로플레이트 리더에서 내보낸 xlsx 파일에서 추출합니다. 이 값은 mCerulean3(donor, DxDm)의 형광 방출 피크와 donor 형광단이 여기될 때(433nm)의 황수정(수용체, DxAm)의 형광 방출 피크에 해당합니다.
2. 475nm 및 525nm에서 형광 강도 값을 사용된 FRET 쌍의 동면점으로 정규화합니다. mCerulean3 및 Citrine FRET 쌍의 동석점은 515nm입니다. FRET 비율(DxAm/DxDm)을 구합니다.
3. FRET 비율을 비교합니다. 모든 고삼투압 스트레스 조건의 DxAm/DxDm 값을 비스트레스 조건의 평균 DxAm/DxDm(예: 0M NaCl)으로 정규화합니다. 상자 그림 또는 평활 곡선 그림을 사용하여 비교합니다(그림 4 및 그림 5). 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 수행한 후 사후 Tukey 통계 검정(p-값: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)을 수행합니다.

Results

pDRFLIP38-AtLEA4-5 플라스미드로 효모 세포를 형질전환한 후, 청색광 transilluminator와 필터로 positive transformants의 형광을 관찰하였다(그림 1). 고삼투압 스트레스를 유발하기 위해 다양한 용액을 준비하는 것은 시간이 많이 걸리므로 그림 2의 96웰 템플릿을 따르는 것이 좋습니다. 다양한 농도의 염화나트륨으로 고삼투압 스트레스 처리 직후, 형광 방출 스펙트럼을 획득했습니다(그림 3). 모든 조건의 형광 방출 스펙트럼을 얻어 일반적인 FRET 변화 거동을 검증했습니다. 형광 강도 값을 등수면점으로 정규화하는 것은 실험 오류를 수정하는 데 필요합니다. 이러한 대표적인 결과를 위해 이전에 보고된 AtLEA4-5를 테스트했는데, 이는 매우 민감한 식물 IDR⁶입니다. 참고로, 약간 둔감한 ABP 구형 단백질도 테스트했습니다(그림 3). 두 조성물 모두 mCerulean3 및 Citrine 방출 스펙트럼(공여체 및 수용체 FP에 대한 피크)의 조합을 나타내며, 이는 표준 조건(0M NaCl)에서 어느 정도의 기초 FRET 효율을 나타냅니다. AtLEA4-5의 경우, 고삼투압 스트레스로 인해 공여체의 형광 강도가 감소하고 수용체의 형광 강도가 증가하여 IDR의 고삼투압 스트레스로 인한 압축이 발생했습니다(그림 3A). 이러한 경향은 ABP에서는 관찰되지 않았습니다(그림 3B). 다양한 고삼투압 스트레스 치료에 따른 구조적 민감도의 차이를 정량화하기 위해 각 조건에 대한 FRET 비율(DxAm/DxDm)을 표시하고 일원 분산 분석 통계 검정을 수행했습니다(그림 4). 마지막으로 AtLE4-5와 ABP의 구조적 민감도를 비교했다. AtLEA4-5가 ABP보다 훨씬 더 높은 민감도를 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 5).

그림 1: S. cerevisiae 형질전환체의 형광 방출. pDRFLIP38-AtLEA4-5 플라스미드로 형질전환된 S. cerevisiae 로 도금된 SD-ura Petri 접시. 형광은 청색광 투과자와 주황색 필터를 사용하여 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: FRET 시스템을 위한 96웰 플레이트 템플릿. 각 고삼투압 스트레스 조건에 대한 세 개의 기술적 반복실험이 연속적인 웰에 배치됩니다. 처음 두 행(A와 B)은 하나의 구문(IDR1)에 대해 8개의 조건을 충족합니다. 다음 행은 새 구성(IDR2, IDR3 등)을 수용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다양한 고삼투압 스트레스 조건에서의 정규화된 형광 방출 스펙트럼. Spectra는 고삼투압 스트레스(NaCl) 처리에 대한 반응으로 일반적인 FRET 거동을 검증했습니다. (A) AtLEA4-5, 고감도 IDR. 수용체의 형광 강도의 증가는 공여체의 형광 강도의 감소와 결합됩니다. (B) ABP, 약간 둔감한 구형 단백질. 피크는 FRET 쌍 mCerulean3 및 Citrine에 따라 475nm 및 525nm에서 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 다양한 고삼투압 스트레스 조건에 대한 구조적 민감도의 정량화. 다양한 농도의 NaCl로 처리된 살아있는 효모 세포의 정규화된 FRET 비율(DxAm/DxDm). (A) AtLEA4-5입니다. (B) 아라비노스 결합 단백질(ABP). n = 9개의 독립적인 측정. 일원 분산 분석. NS: 중요하지 않습니다. p-값: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001. 상자는 25-75번째 백분위수(중앙값의 선)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: AtLEA4-5와 ABP의 구조적 민감도 비교. (A) AtLEA4-5 및 ABP에 대한 다양한 고삼투압 스트레스 조건에서의 정규화된 FRET 비율(DxAm/DxDm). n = 3개의 독립적인 측정. (B) AtLEA4-5 및 ABP에 대한 델타 FRET 값(1.5M - 0M NaCl). 변화는 1.5M NaCl에서 FRET 시스템에서 측정된 구조물의 구조적 민감도로 보고됩니다. n = 3개의 독립적인 측정. 평균 ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001 p-값을 사용한 이원 분산 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 제시된 방법은 IDR 앙상블의 전역 차원이 환경 섭동을 감지하고 반응하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 유전적으로 인코딩된 구조에 의존하며 효모 세포에서 플라스미드 안정 발현 이외의 추가 구성 요소가 필요하지 않으므로 다른 세포 유형의 잠재적 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 또한, 진핵 세포가 수명주기 동안 경험하는 다른 물리 화학적 섭동을 탐색하는 데 다재다능합니다²¹. FRET의 분해능은 주목할 만하며, 에너지 전달은 도너와 수용체 FP 사이의 10nm 미만 근접 내에서만 발생합니다. 그러나 가장 큰 한계는 앙상블 FRET 방법에 따라 얻을 수 없는 정확한 구조 정보가 없다는 것입니다.

IDR의 고유한 이질성과 유연성은 세포 맥락에서 앙상블을 연구할 때 문제를 제기하여 X선 결정학과 같은 기술을 비실용적으로 만듭니다. NMR은 세포의 무질서한 단백질을 연구하기 위해 고려되어 왔지만, 신호 간섭²² 때문에 조건을 바꾸는 것이 문제가 될 수 있다. IDR 구조적 앙상블을 연구하기 위한 FRET 기법을 구현하면 살아있는 세포 내의 집단 분포를 매핑할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다. 또한 단일 분자 FRET(smFRET)와 같은 시험관 내 방법으로 보완할 수 있어 다양한 접근 방식 및 실험 조건에 대한 적응성을 보여줍니다²³. 이 프로토콜은 mCerulean3를 공여체 FP로, 황수정을 수용체 FP로 사용하여 간단하고 추적하기 쉬운 시스템을 제공합니다. FRET 쌍을 선택하는 것은 신호^24,25 사이의 누화를 완화하기 위해 스펙트럼 중첩을 신중하게 고려해야 합니다. 이 방법을 사용하여 구조적 민감도의 변화를 보고할 때 FRET 효율(E_FRET)과 같은 적절한 FRET 메트릭을 선택하는 것은 신뢰할 수 있는 신호 해석을 위해 매우 중요합니다. 대안적으로, FRET 비율(DxAm/DxDm)을 사용하여 구조적 민감도를 분석하고 비교할 수 있지만, 이는 donor-acceptor fluorescence cross-talk²⁵에 대한 신중한 보정을 필요로 한다. 마이크로플레이트 리더로부터 얻은 형광 데이터를 해석하는 것은 형광단의 특성, 쌍극자 배향, 분자간-FRET 대 분자내-FRET 시스템, 시료 전처리 및 데이터 분석을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다²⁵.

Intermolecular-FRET는 데이터의 초기 분석에서 폐기할 수 없기 때문에 앙상블 FRET 방법의 주요 한계입니다. 이것은 일부 IDR이 생체 분자 응축물^26,27로 모집하는 것으로 알려져 있기 때문에 독자에게 중요한 고려 사항을 제기합니다. 생체 분자 응축물에서 거대분자의 국소 농도가 높아 분자 간 상호 작용을 유도하여 FRET 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. AtLEA4-5의 경우, 효모 세포의 고삼투압 스트레스에 따라 개별 반점 구조로 자체 조립되는 것으로 나타났습니다⁶. 분자간 FRET의 효과를 배제하기 위해 저자는 생체 분자 응축물을 파괴하는 분자인 1,6-헥산디올(1,6-HD)로 세포를 배양했습니다. 1,6-HD 처리는 AtLEA4-5 응축물을 용해시켰지만, FRET 수준은 감소하지 않았으며, 이는 단백질 응축이 원치 않는 분자간 FRET를 유발하지 않음을 나타냅니다. 이 효과는 각 IDR에 따라 달라지기 때문에 판독기는 수용체 광표백 또는 기증자 전용 및 수용체 전용 구성물의 동시 발현과 같은 추가 접근 방식을 수행해야 합니다⁶. 그러나 살아있는 세포의 앙상블 FRET에서 얻은 정보는 IDR의 구조적 민감도를 특성화하는 데 중요한 관련성이 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜의 복잡한 측면은 고삼투압 스트레스에 반응하는 행동을 보이는 유기체를 활용한다는 것입니다. 염화나트륨의 외부 농도가 높으면 물이 세포를 떠나 총 단백질 농도가 증가하고 밀집된 환경이 조성됩니다²⁸. IDR은 고분자 군집 ^5,6,11,12의 변화에 민감합니다. 특히, 이 프로토콜에서 모델로 사용된 단백질인 AtLEA4-5는 다양한 분자량 크라우더에 민감했지만 고농도의 염 또는 글리세롤 in vitro⁶에는 민감하지 않았습니다. 글리세롤의 축적은 고삼투압 스트레스에 대한 효모 세포의 반응 및 적응에 중요하기 때문에(²⁹), AtLEA4-5 압축의 주요 기여자는 삼투압 감지의 초기 사건 동안 고분자 군집이라는 점을 강조하는 것이 적절하다. 글리세롤이 축적되는 후속 순응 단계에서 AtLEA4-5의 구조가 어떻게 변경되는지는 추가 조사가 필요합니다.

무질서한 단백질의 구조적 역학을 탐구하는 것은 다양한 기술을 포함합니다. 이러한 맥락에서 FRET는 중추적인 방법입니다. 고려 중인 특정 연구 문의 및 기능에 따라 조사관은 생체 내 NMR 분광법을 사용하여 IDR³⁰을 특성화할 수 있습니다. 또한, smFRET는 생체 내 연구를 위한 유용한 도구이다²³. 전자 상자성 공명(EPR) 분광법은 세포 맥락에서 IDR을 정량적으로 연구하는 데 사용되는 또 다른 기술이다³¹. 질량 분석법 기반 방법은 단백질의 세포 형태에 대한 구조적 정보를 제공할 수 있기 때문에 강력한 접근법이기도 합니다³². 이러한 방법에는 네이티브 질량 분석법(native-MS) 및 이온 이동도 질량 분석법(IM-MS)^32,33이 포함됩니다. 이러한 모든 방법을 통해 연구자들은 IDR의 다양한 형태와 그 역학을 탐구하여 세포 생물학에 대한 기여를 밝힐 수 있습니다. 이 작업에 설명된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 구조적 민감도의 초기 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 후속 연구는 원하는 세포 유형에서 구조적 민감도를 테스트하거나 smFRET, CD 또는 SAXS와 같은 시험관 내 방법을 통해 기계론적 통찰력을 얻을 수 있는 가능성에 중점을 둘 수 있습니다. 변화하는 세포 환경에서 IDR의 구조적 민감도를 명확하게 파악하기 위해서는 여러 방법의 조합이 필요합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96웰 플레이트	Greiner Bio-One	655096
한천	, 시그마-알드리치	5040
BglII	뉴잉글랜드 BioLabs,	R0144S,
BJ5465 세포	미국식 배양 컬렉션	208289
완충액, MES, 50 mM	, 시그마-알드리치	M8250
완충액, 트리스-HCl, 10 mM,	Invitrogen
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon 튜브	Corning	352057
LB 매체	Sigma-Aldrich	L2897
리튬 아세테이트 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
저용융 아가로스	GOLDBIO	A-204-25
마이크로 원심분리기	에펜도르프	5452000010
Miniprep 키트	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
연어 정액 DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
클로라이드 나트륨	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris 기기	E4000
UV-Visible 분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD 배지	Sigma-Aldrich	Y1500