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방법 논문

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

2.3K 조회수

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DOI:

10.3791/66350

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2024년 6월 7일

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1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 섬 분리 및 정제를 위한 돼지 췌장 조달을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

초록

췌장 섬 이식은 I형 당뇨병에 대한 새로운 치료법입니다. 그러나 기증자 매칭 및 가용성에 의해 제한됩니다. 돼지 섬 이종 이식은 동종 이식에 대한 유망한 대안을 제공하며, 주문형 기능성 섬을 대규모로 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 고립된 섬의 수율과 생존력은 기증자 췌장의 품질과 조달 방법, 특히 온난-허혈 시간의 지속 시간에 매우 민감합니다. 장기 보존과 그에 따른 섬 수율 및 생존력을 개선하기 위해 우리는 돼지 췌장의 외과적 관류 및 절제를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 직접 대동맥 대동맥 캐뉼레이션 및 장기 관류를 사용하여 온열 허혈 시간을 최소화하고 광범위한 수술 전문 지식이 없는 작업자를 위해 절차를 단순화합니다. 대동맥을 통한 췌장의 후속 동맥 관류는 미세혈관에서 정체된 혈액을 씻어내어 혈전증과 조직의 산화 손상을 줄입니다. 이 원고는 돼지 췌장의 외과적 관류 및 절제에 대한 자세한 프로토콜을 제공한 후 섬 분리 및 정제를 제공합니다.

서론

제1형 당뇨병은 췌장 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 발생한다1. 결과적으로, 환자는 외인성 인슐린에 의존하게 되어 고혈당 및 저혈당증 삽화와 함께 고위험 혈당 변동에 놓이게 된다2. 섬 동종 이식은 제 1 형 당뇨병의 잠재적 인 치료법입니다. 그러나 췌장 장기 기증자의 제한된 가용성은 절차 2,3의 광범위한 채택을 가로막는 주요 장벽으로 남아 있습니다. 돼지 기증자의 섬 이종 이식은 이러한 동물을 쉽게 구할 수 있기 때문에 유망한 대안입니다. 돼지 췌장 섬 분리의 최적화와 확장은 섬 이종 이식을 진행하는 데 중요합니다.

여러 돼지 췌장 조달 기술이 이전에 발표되었지만, 이러한 절차 중 다수는 심장사 유도 또는 출혈 후 췌장 절제술을 설명합니다 4,5,6,7,8,9,10. 이러한 기술의 주요 단점 중 하나는 심장 사망 시간과 동맥 내 및/또는 보존 용액의 관내 주입 시작 사이에 발생하는 가변적인 온열 허혈 시간(WIT)입니다. WIT가 10분만 사용되어도 섬의 수율과 생존력에 부정적인 영향을 미친다5. WIT를 최소화하려면 보존 용액으로 췌장을 신속하게 관류해야 합니다. 복부 장기 조달 중 대동맥 캐뉼레이션 후 위스콘신 대학(UW) 용액을 사용한 체내 관류는 혈액 제거, 혈관 내 혈전증 예방, 허혈성 손상 방지 및 세포 손상 최소화에 매우 중요합니다11,12.

이전 연구에서는 돼지 췌장 조달 과정에서 UW 용액을 사용하여 셀리악 줄기와 상장간막 동맥을 저압으로 세척하면 섬 수율과 순도가 향상된다는 것이 입증되었습니다4. 그러나 돼지 췌장 조달을 위해 이전에 발표된 방법에는 개복 대동맥 캐뉼레이션이 포함되는데, 이는 특히 작은 돼지의 경우 기술적으로 어려울 수 있다 13,14,15. 이 원고에서는 돼지 췌장의 외과적 관류 및 조달을 위한 시각 보조 도구와 함께 상세한 단계별 프로토콜을 제시한 다음 섬 분리 및 정제를 제공합니다. 췌장 격리 중 대동맥 캐뉼레이션의 이 새로운 기술은 WIT를 최소화하고 섬 격리 수율과 생존력을 최대화하는 수단으로 무혈 현장에서 췌장 조달을 수행할 수 있도록 특별히 개발되었습니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 시술은 Washington University School of Medicine Division of Comparative Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 35kg에서 35kg 사이의 성인 요크셔 돼지가 이 절차에 이상적입니다. 그러나 이 프로토콜은 실험 상황에 따라 다양한 크기의 돼지에 적용할 수 있습니다. 전체 절차는 수술실 환경에서 멸균 방식으로 수행되어야 합니다.

1. 수술 전 준비 및 마취

  1. 4mg/kg의 틸레타민과 졸라제팜, 20mg/kg의 케타민, 2mg/kg의 자일라진을 근육 주사하여 돼지를 진정시킵니다.
  2. 귓바퀴 정맥을 통해 말초 정맥 접근을 확립합니다.
  3. 100% 산소에 흡입된 1%-3% 이소플루란으로 전신 마취를 유도하고 돼지를 기관내로 삽관합니다.
    참고: 보다 원활한 유도 및 삽관 절차를 위해 흡입제보다 프로포폴 또는 다른 정맥 유도제를 사용하는 것이 바람직할 수 있습니다. 활력 징후, 호기말 CO2, 산소 포화도 및 심장 파형을 지속적으로 모니터링하여 마취 깊이를 평가하고 유지합니다. 복부 수술 평면은 병상 초음파를 사용하여 확인합니다.
  4. 돼지를 면도하고 흉골 노치에서 양측 사타구니까지 클로르헥시딘 글루코네이트로 준비합니다.
  5. 복부 전체를 명확하게 볼 수 있도록 수술 부위를 드레이프합니다(그림 1A).

2. 후복막의 수술 설정 및 노출

  1. 정중선 개복술 절개를 수행합니다(그림 1B).
    1. 10날 메스와 전기 소작을 사용하여 시푸이드 돌기에서 치골까지 정중선 개복술을 만듭니다. 절개 부위가 하복부 비뇨생식기 입구 주위를 구부리도록 주의하십시오.
  2. 오른쪽 내장 회전을 수행합니다.
    1. 오른쪽 결장과 소장을 외부화하여 멸균 수건으로 감쌉니다.
    2. 대장과 장을 왼쪽으로 부드럽게 수축시켜 오른쪽 후복막을 노출시키면서 장 염전이나 회전을 피합니다.
  3. 방광을 배출합니다(선택 사항).
    1. 방광이 가득 차서 충격이 가해지는 노출인 경우 두 개의 DeBakey 겸자 사이에 방광을 잡고 11날 메스를 사용하여 복부 방광 벽을 절개합니다.
    2. Yankauer 흡입 팁을 방광에 삽입하여 소변을 배출하고 방광을 감압합니다.
  4. 오른쪽 후복막의 최적 노출을 용이하게 하기 위해 복부 견인기 세트를 설정합니다(그림 1C).

3. 후복막 박리

  1. 후복막 절리를 시작합니다(그림 2A).
    1. 전기 소작을 사용하여 오른쪽 신장 수준에서 대동맥 분기점까지 정중선 오른쪽의 복막을 절개합니다.
    2. 대동맥 내측 대동맥, 하대정맥(IVC), 우측 신장 동맥 및 정맥을 날카롭게 노출시킵니다.
  2. 큰 혈관 루프를 가진 원위 대동맥의 원주 제어를 얻습니다.
  3. IVC를 결찰합니다(그림 2B).
    1. mid-infrarenal IVC의 원주 제어를 얻습니다.
    2. 2-0 실크 넥타이를 사용하여 IVC를 결찰합니다.
  4. 신장 혈관을 결찰합니다(그림 2C).
    1. 오른쪽 및 왼쪽 신장 동맥과 정맥의 원주 조절을 얻습니다.
    2. 2-0 실크 넥타이를 사용하여 이러한 구조를 결속하십시오.
    3. 여러 개의 신장 동맥이 있는 경우, 마찬가지로 각 혈관을 격리하고 결찰합니다.

4. 흉강내 박리

  1. 오른쪽 반구장을 절개합니다(그림 3A).
    1. 간을 아래쪽으로 부드럽게 수축시켜 오른쪽 반격막을 노출시킵니다. 두 개의 Allis 클램프를 오른쪽 반격막의 막 부분에 적용하고 전기 소작을 사용하여 두 클램프 사이의 다이어프램을 절개합니다.
    2. 횡격막 근육 절개술을 수평으로 약 7cm까지 확장합니다.
  2. 흉곽내 IVC의 원주 제어를 얻습니다(그림 3B).
    1. 흉강내 IVC 주위에 2-0 실크 넥타이를 매웁니다. IVC를 막지 않고 작은 지혈제로 봉합사의 끝부분을 스냅합니다.
  3. 횡격막술을 왼쪽 반격막으로 확장합니다(그림 3C).
    1. 두 개의 Allis 클램프를 사용하여 횡격막의 가장자리를 아래쪽으로 수축시키고 왼쪽 반격막까지 확장합니다.
      알림: 횡격막 절개술 중에는 심낭에 들어가지 마십시오.
  4. 왼쪽 흉부 후방의 하행 흉부 대동맥을 노출시킵니다.

5. 대동맥 캐뉼레이션, 내장 격리 및 관류

  1. 돼지를 체계적으로 항응고시킵니다.
    1. 말초 정맥 접근을 통해 전신 헤파린(100 U/kg)을 투여합니다. 대동맥 캐뉼레이션을 진행하기 전에 3분 동안 기다립니다.
  2. 18G 미세 천자 바늘을 사용하여 대동맥에 접근합니다(그림 4A).
  3. j-와이어를 바늘을 통해 대동맥에 통과시키고 와이어 위의 바늘을 제거합니다.
  4. 와이어 위에 10Fr 칼집을 놓고 와이어를 대동맥에 놓고 제거합니다(그림 4B).
  5. IV 튜브를 10Fr 피복에 연결하고 멸균 방식으로 피복을 통해 UW 용액을 주입합니다. 분당 40-60방울의 속도로 UW 용액을 주입합니다.
    알림: 흉부 대동맥이 교차 클램핑될 때까지 흐름이 시작되지 않습니다. 대동맥 내 덮개의 변위를 방지하기 위해 정맥 튜브가 장력되지 않도록 합니다.
  6. 내장 격리 및 관류를 빠르게 연속적으로 수행합니다.
    1. 대동맥 클램프를 사용하여 대동맥 내륙 대동맥을 고정합니다.
    2. 대동맥 클램프를 사용하여 하행 흉부 대동맥을 고정합니다.
    3. 이전에 배치된 2-0 동점으로 흉곽 내 IVC를 묶습니다.
    4. 말초 정맥 접근을 통해 안락사를 위해 100mg/kg KCl을 투여합니다.
      참고: 심장사는 KCl의 투여와 함께 시작됩니다.
    5. 2-0 동점보다 우수한 infrarenal IVC에서 정맥 절제술을 하고 정맥 절제술을 통해 풀 팁 흡입을 삽입합니다(그림 4C).
    6. 내장에 2-3L의 차가운 UW 용액을 관류합니다.
    7. 관류 중 전체 췌장 절제술을 위한 절개를 진행합니다.
      참고: 내장, 특히 췌장은 UW 용액이 고형 장기 영역에 관류됨에 따라 창백해져야 합니다(그림 5A).

6. 전체 췌장 절제술

  1. UW 용액이 관류될 때 소장이 수축되는 것을 해제합니다.
  2. 내장 관류 동안 췌장의 십이지장, 연결 및 비장 엽의 절개를 시작합니다. 췌장이 드러나도록 위를 우월하게 수축시킵니다. 둔한 해부와 전기 소작술을 조합하여 췌장을 omental 부착물에서 절개합니다.
    참고: 췌장의 몸체는 문맥을 효과적으로 감쌉니다. 문맥이 십이지장엽 뒤쪽으로 흐르고 그 다음에는 앞쪽으로 다리와 연결엽으로 이어지지 않도록 주의하십시오.
  3. 췌관을 분리합니다(그림 5B). 십이지장으로 들어가는 췌관을 찾습니다. 두 개의 3-0 실크 타이를 사용하여 덕트를 결찰하고 넥타이 사이의 덕트를 횡단합니다.
  4. 완전한 췌장 절제술(그림 5C).
    1. 십이지장의 C-루프에서 십이지장엽의 나머지 부분을 자유롭게 움직일 수 있을 때까지 절개합니다.
    2. 췌장을 나머지 부착물에서 분리합니다. 상장간막 동맥에서 췌장까지 작은 혈관을 조심스럽게 결찰하고 나눕니다.
    3. 문맥에서 췌장을 분리합니다. 문맥에서 췌장과 연결엽의 몸체를 절개합니다. 비장 정맥을 포함하여 문맥에서 췌장까지의 모든 정맥 가지를 결찰합니다.
      1. 연결엽과 비장엽 사이의 췌장 다리를 가로질러 문맥에서 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
        알림: 비장 엽에서 췌장 십이지장 엽을 방해하지 않도록 주의하십시오.
  5. 전체 췌장을 차가운 멸균 UW 용액에 담그고 용기를 즉시 얼음 위에 놓습니다. 췌장을 멸균 후드로 운반하여 섬 격리를 수행합니다. 췌장 섬 분리를 진행합니다(그림 6).

7. 췌관 캐뉼레이션

  1. 췌장을 생물 안전 캐비닛 내부의 얼음 위에 있는 멸균 트레이에 놓습니다.
  2. 췌장에서 과도한 섬유 조직과 혈액을 절개합니다.
  3. 필요한 경우 루멘을 더 잘 시각화하기 위해 덕트를 가로로 자릅니다. 적절한 크기의 카테터(16G)를 사용하여 캐뉼라를 찾아 덕트로 전진시킵니다.
  4. 2.0 실크 타이로 카테터를 제자리에 고정하되 내강이 막히지 않도록 합니다.
  5. 3개의 오염 제거 용액을 준비하고 캐뉼러형 췌장을 각 오염 제거 용액에 60초 동안 담그십시오.

8. 췌장의 관류와 팽창

  1. 효소 분해 용액을 준비합니다(그림 6).
    1. 시판되는 콜라겐분해효소 1 및 2 용액 100mg(자세한 내용은 재료 표 참조)을 원하는 양의 1x HBSS 및 10,000U 헤파린 용액과 혼합합니다. 분리된 췌장 조직이 100g에서 200g 사이인 경우 효소를 총 200mL의 1x HBSS 및 헤파린 용액과 혼합합니다.
  2. 췌장에 효소 용액을 주입합니다.
    1. 적당한 힘을 조절하여 60mL 볼루스에 담긴 효소 용액을 췌관에 주입합니다. 효소 용액 전체가 췌장에 주입될 때까지 이 과정을 계속합니다.
      참고: 효과적인 주입은 췌장 조직을 팽창시켜야 합니다.
    2. 일부 효소 용액이 췌장 조직에서 멸균 트레이로 누출되는 경우 8.3단계에서 이 남은 용액을 췌장에 다시 주입하거나 9.2단계에서 Ricordi 챔버에 넣습니다.
  3. 22G 바늘을 사용하여 팽창이 잘 되지 않은 췌장 실질 분절에 남아 있는 효소 용액을 직접 주입합니다.

9. 췌장의 소화

  1. 500mL의 1x HBSS가 들어 있는 회로 저장소를 47°C로 설정된 수조에 넣어 저장소 용액을 예열합니다.
    알림: 효소 용액은 36-38°C에서 최적으로 작동하며 이 온도는 연동 펌프를 시작한 후 5분 이내에 도달해야 합니다. 효소가 주입된 췌장을 포함한 Ricordi의 내용물 온도는 처음에 4 °C입니다. 회로 저장소를 47°C로 예열하면 저장소와 Ricordi 챔버의 내용물이 혼합되어 연동 펌프를 시작한 후 36분 이내에 전체 회로 온도를 38-5°C까지 끌어올립니다.
  2. 췌관에서 카테터를 제거하고 췌장을 ~1-3cm 조각으로 자릅니다.
  3. 소화 회로를 준비합니다. 연동 펌프는 소화 회로 저장소에서 가열 코일을 통해 Ricordi 챔버로 용액을 순환시킵니다(그림 6).
  4. 9개의 1.5cm 질화규소 구슬이 있는 췌장 조각을 Ricordi 챔버 내부에 놓고 나머지 효소 용액으로 필터 수준까지 채웁니다.
  5. Ricordi 챔버를 밀봉하려면 메쉬 필터와 고무 개스킷을 놓은 다음 뚜껑을 Ricordi 챔버에 놓습니다. 나사를 조여 Ricordi 챔버의 뚜껑을 고정하고 계속하기 전에 챔버가 잘 밀봉되었는지 확인합니다.
  6. 가열 코일을 47°C 온수 욕조에 넣습니다.
  7. 유입 및 유출 캐뉼라를 500mL의 1x HBSS가 들어 있는 분해 회로 저장소에 넣습니다.
  8. 전체 챔버가 분해 용액으로 채워질 때까지 450mL/분의 유속으로 펌프를 시작합니다. 유체가 회로 내부를 순환할 때 유속을 100mL/분으로 줄입니다.
  9. 소화 챔버를 수동으로 흔들어 질화규소 대리석으로 조직을 교반합니다.
  10. 8분의 분해부터 시작하여 Dithizone(DTZ) 염색을 위해 회로 저장소에서 1mL 샘플을 채취하여 분해 진행 상황을 모니터링합니다.
    1. DTZ 염색을 준비하려면 10mg의 DTZ를 Dimethyl Sulfoxide(DMSO) 2mL에 용해시킵니다.
    2. 준비된 DTZ 염색제 10μL를 분해 시료 1mL에 추가합니다. 4x 배율로 샘플을 검사합니다. 섬은 DTZ 염색으로 짙은 빨간색에서 검은색으로 나타납니다.
      참고: 관찰된 섬의 대부분 또는 전부가 '자유롭고' 온전하며, 근육 조직이 더 작은 클러스터로 분산되어 있을 때 소화가 완료됩니다.
  11. 분해가 완료된 것으로 판단되면 코일을 얼음 수조로 옮기고 저장소에서 유입 캐뉼라를 제거한 다음 펌프 속도를 210-250mL/분으로 높입니다. 소화된 조직이 Ricordi 챔버에서 회로 저장소로 배출되도록 합니다.
    참고: 분해 후 Ricordi 챔버에 조직이 거의 남아 있지 않은 것이 일반적입니다. 일반적으로 소화되지 않은 췌장 조직의 <10%가 남아 있지만 이는 검체에 따라 달라질 수 있습니다.
  12. 소화 효율성을 결정하기 위해 남은 조직의 무게를 측정합니다. 회로 저장소에서 분해된 조직을 얼음 위에서 차갑게 유지되는 250mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

10. 췌장 조직의 채취

  1. 250mL 코니컬 튜브에서 250× g 으로 분해된 췌장 조직을 브레이크 없이 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다.
  2. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 펠릿이 중단되지 않도록 하면서 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
  3. 각 원뿔형 튜브에 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 하나의 250mL 원뿔형 튜브로 결합합니다. ≤50mL의 조직이 있는 경우 Islet Collection Solution에서 펠릿을 총 부피 100mL로 재현탁시킵니다. >50mL의 조직이 있는 경우 Islet Collection Solution에서 펠릿을 총 200mL로 재현탁시킵니다. 100mL 이상의 조직이 수집되는 경우 두 번의 Cell Processor 정제 사이클을 실행합니다.
  4. RPMI 배지에 조직을 재현탁시켜 총 부피가 100mL(50mL의 조직이 수집되었다고 가정)를 만들고 세포 처리기에 로드합니다.

11. 연속 그래디언트 방법을 사용한 섬 정제

  1. 제조업체의 지침에 따라 셀 프로세서를 프라임합니다.
  2. 125mL의 고밀도 그래디언트 용액을 연속 그래디언트 형성기에 로드한 다음 200mL/분으로 설정된 펌프를 사용하여 고밀도 그래디언트 용액을 셀 프로세서에 로드합니다.
  3. 1,000RPM에서 셀 프로세서 원심분리기 기능을 시작합니다.
  4. 시스템에서 공기를 방출하고 High-density Gradient Solution으로 다시 프라이밍합니다.
  5. 125 mL의 고밀도 그래디언트 용액과 130 mL의 저밀도 용액을 그래디언트 포머에 추가합니다.
  6. 100mL의 분해된 조직 현탁액을 로드합니다.
  7. 셀 프로세서 속도를 2,000분 동안 3RPM으로 높입니다.
  8. 정제된 islet 분획 분취를 위해 16,50mL 코니컬 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 25mL의 RPMI 배지를 추가하고 모든 튜브를 오름차순으로 정렬합니다.
  9. 준비된 수집 원뿔형 튜브에서 정제된 섬 분획을 수집합니다.

12. 섬 평가 및 염색

  1. 정제된 각 islet 분획에서 100-200 μL 부분 표본을 수집하고 DTZ 염색을 위한 24웰 조직 배양 플레이트에 넣어 islet 함량과 각 정제 분획을 평가합니다. 4배 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 분획을 검사합니다. 섬은 DTZ 염색으로 짙은 빨간색에서 검은색으로 나타납니다.
  2. 섬이 식별되면 섬 함량이 가장 높은 분수를 선택합니다. 정제된 분획을 250 × g 에서 브레이크 없이 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다.
  3. 상층액을 조심스럽게 흡입하고 섬 펠릿을 섬 성장 매체에 재현탁시킵니다. 정제된 아일릿을 1-4개의 T-125 배양 플라스크에 옮깁니다.
  4. 정화 후에는 섬의 양, 생존력 및 기능을 평가합니다.
    1. islet cell 카운터를 사용하여 islet 수와 크기 분포를 평가합니다(그림 7A). 전체 췌장은 일반적으로 1-2 백만 개의 섬에 해당하는 것을 산출합니다.
    2. 생존도 염색을 위해 2μL의 calcein AM과 2μL의 ethidium homodimer-1(CaAM/EthD-1)을 1,000μL의 PBS와 혼합합니다(그림 7B). 섬을 30분 동안 염색한 다음 4배 또는 10배 미만의 배율로 평가합니다. 생존 가능한 작은 섬은 녹색으로 염색되고 생존할 수 없는 섬은 빨간색으로 염색됩니다.

13. 췌장섬의 세포 배양

  1. 처음 48시간 동안 37°C의 회수 배지에서 섬을 배양하여 충분한 영양소를 제공합니다(~1,000 islets/mL의 회수 배지).
  2. 2-21일째부터 37°C의 표준 성장 배지에서 섬을 배양합니다.

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결과

수술 설정 및 정중선 개복술은 그림 1에 나와 있습니다. 개복술 절개는 비뇨생식기 입구를 피하기 위해 구부러져야 합니다(그림 1B). 리트랙터를 설정할 때 Omni 또는 Bookwalter 리트랙터의 포스트를 테이블의 왼쪽 아래쪽 모서리에 부착하십시오. 이상적인 수축에는 오른쪽 복벽에 2개, 왼쪽 복벽에 2개, 오른쪽 결장과 소장에 1-2개의 견인 블레이드가 멸균 수건으로 싸여 있습니다(그림 1C). 차체 벽, splanchnic 또는 가단성 견인기 블레이드를 사용할 수 있으며, 이는 보조 장치 및 작업자 선호도의 가용성에 따라 다릅니다. Omni 또는 Bookwalter 견인기를 사용할 수 없는 경우 1-2개의 자체 유지 Balfour 견인기를 사용하여 양쪽의 복벽을 후퇴시킬 수 있습니다. 그런 다음 보조원은 멸균 수건으로 감싼 오른쪽 결장과 소장에 수축을 적용할 수 ...

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토론

돼지 기증자를 이용한 췌장 섬 이종 이식은 제1형 당뇨병 치료를 위한 유망한 전략입니다. 섬 분리는 까다로우며, 최종 섬 생존력과 수율은 장기 조달 중에 발생하는 저혈압 및 조직 허혈에 매우 취약하다16,17. 췌장 조달 및 보존을 최적화하기 위해 이 프로토콜은 대동맥 캐뉼레이션, 내장 격리 및 섬 격리 전 돼지 췌장 조달 중 관류를 위한 새로운 방법을 제시합니다.

돼지 섬 분리의 성공은 기증자 췌장의 최적 조달 및 보존에 달려 있습니다. 췌장 조직에서 모든 혈액을 제거하는 것은 췌장 미세혈관의 보체 활성화 및 혈전증으로 이어져 섬 수율과 생존력을 저하시킬 수 있기 때문에 섬 분리를 최적화하는 데 중요합니다 4,18

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

이 원고는 Mid-America Transplant Foundation의 임상 혁신 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 M NaOH, 100 mL밀리포어 시그마1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 - 30 ° C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL 원뿔형 튜브Millipore SigmaCLS430236-6EA
암포테리신 B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
방부제 포비돈 요오드 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad 그라디언트 이전BioRad395
칼슘 클로라이드 디하이드레이트Thermo Fisher10035-04-8
COBE 세포 처리기Ebay317690 
소화 회로 저장소, Gibco 병, 1 LThermo Fisher10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Gradient Former Connection KitBioRad1652008
Heparin [1000 U/mL]Emergency Medical Products0409-2720-01
HEPES 완충액 (1m), 100 mLThermo Fisher15630080
인간 혈청 알부민 25 %, 100 mLCelprogenHSA2001-25-1
IsofluraneCovetrusItem#:11695067772
KetaminePattersonItem #:07-894-8462
Liverase (100 mg)Millipore Sigma5401020001
LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트Thermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 튜빙Masterfle96419-16
Masterflex 연동 펌프Masterflex07522-30
PenStrep (2 mg/mL)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/바이알)Dornase 알파8931278
회수 매체, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
표준 배양 배지, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (틸레타민과 졸라제팜) Injection CPatterson항목 #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
WaterbathSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinePatterson항목 #:07-891-6165

참고문헌

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

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