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방법 논문

쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함의 확립: 봉합사-재생 치료 조사를 위한 표준화된 모델

2.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66417

⸱

2024년 5월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

이 논문에서

요약

우리는 쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결손의 자세한 수술 절차를 설명하고 모델의 단기 및 장기 예후에 대한 조사를 설명합니다. 우리는 봉합사 재생 요법을 개발하기 위한 표준화된 모델을 구축하는 것을 목표로 합니다.

초록

대규모 종골 결손은 종종 두개골 봉합 파괴와 일치하여 종골 결손 복원 및 두개골 발달에 장애를 초래합니다(후자는 발달 중인 두개골에서 발생). 그러나 표준화된 모델의 부재는 봉합사 재생 요법에 대한 연구의 진전을 방해하고 개별 연구에서 비교 분석을 수행하는 데 어려움을 초래합니다. 이 문제를 해결하기 위해 현재 프로토콜은 쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결함에 대한 자세한 모델링 프로세스를 설명합니다.

이 모델은 관상 봉합사를 가로질러 4.5mm × 2mm 크기의 전체 두께의 직사각형 구멍을 뚫어 생성되었습니다. 쥐는 안락사시켰고, 두개골 샘플은 수술 후 0일째, 2주차, 6주차, 12주차에 채취했다. 수술 직후 채취한 샘플의 μCT 결과, 관상 봉합사와 인접한 뼈 조직의 제거를 포함하는 봉합사-뼈 복합 결손이 성공적으로 확립되었음을 확인했습니다.

수술후 6주와 12주의 데이터는 결손이 봉합되는 자연 치유 경향을 보여주었습니다. 조직학적 염색은 결손 중심에서 증가된 미네랄화된 섬유와 새로운 뼈를 보여줌으로써 이러한 경향을 더욱 입증했습니다. 이러한 결과는 종골 결손 후 시간이 지남에 따라 점진적인 봉합 유합술을 나타내며 봉합사 재생을 위한 치료적 개입의 중요성을 강조합니다. 우리는 이 프로토콜이 봉합사 재생 요법의 개발을 촉진하여 종골 결손의 기능적 복원에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 봉합사 손실과 관련된 부작용을 줄일 것으로 기대합니다.

서론

두개골 봉합사는 두개골 사이의 조밀한 섬유질 연결로, 관절 역할을 하여 약간의 두개골 움직임을 용이하게 하고 압력을 받는 뇌에 보호 쿠션을 제공한다1. 최근 몇 년 동안 두개골 발달, 두개안면 항상성 및 내재된 골수호전위(osteo-reparative potential)에서 두개골 봉합사의 중추적인 역할이 강조된 연구가 증가하고있습니다 2,3,4,5,6,7,8. 성장과 발달 기간 동안, 두개골 봉합사는 두개골의 주요 성장 센터 역할을 한다4. 새로운 뼈 형성은 봉합사 양쪽의 골형성 전방에서 발생하는 반면, 봉합사 내의 세포는 미분화 중간엽 상태를 유지하여 뇌 성장과 함께 균형 잡힌 두개골 확장을 보장합니다1. 이때 두개골 봉합사의 손실은 두개골과 뇌의 성장 사이에 불일치를 초래하여 뇌 손상, 수두증, 두개내 압력 증가 및인지 기능 장애와 같은 심각한 문제를 초래합니다 3,9.

게다가, 두개골 봉합사는 종골 결손의 예후를 결정하는 데 중요한 역할을 합니다 5,7,10. 두개골 표면 전체의 재생 전위는 고르지 않게 분포되어 있으며, 두개골 봉합사는 비봉합사 영역에 비해 현저히 우수한 능력을 보여줍니다10,11. 한 연구에 따르면 종골 결손 치유 속도는 두개골 봉합사와 부상 부위 사이의 거리와 반비례한다고 한다10. 구체적으로, 관상골 및 시상봉합사의 제거는 정수리골 결손의 치유되지 않는 결과를 초래하며7, 종골결손에서 봉합사 재생의 필요성을 강조한다. 그러나 현재 연구의 초점은 주로 두개골 골구조 복원에 맞춰져 있으며 봉합사 중간엽의 재생은 소홀히 하고 있습니다.

봉합사 재생의 발전과 관련하여 봉합사 함유 뼈 피판, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 인공 생체 재료의 이식에서 유망한 결과가 관찰되었습니다. 봉합사가 있는 뼈 피판을 종골 결손에 이식했을 때, 봉합사가 없는 경우와 달리 성공적으로 통합되고 치유된 반면, 봉합사가 없는 경우에는 유합이 없고 골막, 경막 또는 골세포를 형성할 수 없는 것으로 나타났다5. 마찬가지로, 골수에서 유래한 MSC를 시상 봉합사-뼈 복합 결손물에 이식하면 봉합사와 같은 틈의 형성이 촉진되었다12. 주목할 만한 점은, 최근 연구에서는 Gli1+ MSC를 이용한 봉합사 재생의 실현을 강조하여 두개내 압력 조절, 두개골 기형 교정, 신경인지 기능 향상을 가능하게 했다는 점이다13. 재생 의학 및 생물 의학 공학이 발전함에 따라 연구자들은 적응 가능하고 사용자 정의 가능한 특성으로 인해 조직 공학 생체 재료에 점점 더 집중하고 있습니다14. 특히, 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인은 두개골과 봉합사 중간엽을 동시에 재건하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다15,16.

그러나 두개안면 연구는 뼈, 피부, 연골 및 근육과 같은 다른 조직을 복구하는 비교적 성숙한 모델과 달리 봉합사 중간엽 재생 요법을 탐색하기 위한 확립된 모델이 부족하다17. 표준화된 모델의 부재는 봉합사 재생 요법에 대한 연구를 제한하고 서로 다른 연구에서 비교 분석을 수행하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 우리의 연구는 실행 가능하고 재현 가능한 쥐 종아리 봉합사-뼈 복합 결함을 확립했습니다. 이 방법을 통해 우리는 두개골 봉합사 재건을 위한 적절한 임상 중재를 개발하고, 종골 결손의 기능적 수리에 대한 새로운 관점을 제공하고 봉합사 손실로 인한 바람직하지 않은 결과를 줄이는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

이 연구의 모든 동물 시술은 쓰촨대학교 중국서부구강학 학교 윤리위원회(WCHSIRB-D-2021-597)에서 검토 및 승인했습니다. 총 12마리(4개의 시점 각각에 3마리의 랫드)의 Sprague-Dawley(SD) 랫트(수컷, 300g, 8주령)를 상업적 출처에서 얻었습니다( 재료 표 참조).

1. 수술 전 준비

  1. 수술 용품
    1. 곡선형 겸자, 일회용 멸균 메스, 골막 엘리베이터, 관개 바늘, 면봉, 저속 핸드피스, 수술용 모터, 치과용 저속 원형 버(그림 1B, 각각 직경 1.2mm 및 0.8mm), 바늘 홀더, 3-0 모노필라멘트 봉합사 및 직선 가위를 포함하여 그림 1A에 표시된 수술 기구를 준비합니다.
  2. 살균 및 소독
    1. 사전에 증기 멸균(125-135 °C, 20-25분)으로 기기를 멸균하십시오.
    2. 에탄올을 사용하여 전기 면도기와 같이 열에 민감한 의료 장비를 살균하십시오.
    3. 멸균 의료용 부직포를 사용하여 작업 플랫폼을 덮고 주변 환경을 75% 에탄올로 소독합니다.
  3. 마취
    1. 1주일의 적응 기간으로 수술을 위해 동물을 준비합니다.
    2. 마취를 위해 수술 20분 전에 자일라진(10mg/kg)과 케타민(100mg/kg)을 쥐에게 복강내로 주입하거나 전신 마취를 달성하기 위해 적절한 마취 프로토콜을 사용합니다.
      참고: 쥐에서 복강내로 투여하는 케타민-자일라진 마취 칵테일은 일반적으로 10-15분 이내에 효과가 나타나며 주사 후 약 35-40분 후에 최대 마취에 도달합니다. 마취 중 저체온증을 예방하려면 쥐를 가열 패드에 놓는 것이 가장 좋습니다.
    3. 진통을 제공하기 위해 5mg/kg의 카프로펜을 수술 전 피하 주사합니다.
    4. "발가락 꼬집기 방법"을 사용하여 쥐가 의식이 있고 반응하는지 여부를 확인하십시오.

2. 수술 과정

  1. 현장 준비
    1. 이 자세를 유지하기 위해 특별한 장치나 구속구 없이 머리를 자연스럽게 수직으로 뻗은 엎드린 자세에 쥐를 놓습니다(그림 2A).
    2. 동물용 연고, 즉 바셀린을 쥐의 눈에 바르면 각막 건조를 예방할 수 있습니다.
    3. 전기 면도기로 콧대와 경추 관절 사이의 두피에서 머리카락을 제거합니다(그림 2B). 중앙에서 방사형으로 원을 그리며 수술 부위를 2% 요오드포어 용액과 75% 에탄올로 소독합니다. 동물의 등쪽과 절개 부위를 둘러싼 털을 덮기 위해 수술용 드레이프를 사용하십시오.
  2. 수술 부위 개방
    1. 코뼈의 중간 지점에서 시작하여 두개골의 정중선을 따라 일회용 메스로 2cm 세로 피부를 절개합니다(그림 2C).
    2. 메스로 피부층의 초기 지점과 범위를 반영하는 정중선 골막 절개를 합니다(그림 2D). 그런 다음 골막 엘리베이터(그림 2E1)를 사용하여 절개 부위 양쪽의 골막을 부드럽게 들어 올려 두정골, 전두골 및 관상골 봉합사(그림 2E2)를 노출시킵니다.
      참고: 골막을 절개할 때는 절단 시 과도한 출혈을 방지하기 위해 두개골 봉합사에 해를 끼치지 않도록 주의하십시오. 관상동맥 봉합사의 적절한 노출은 다음 절차에서 가장 중요합니다.
    3. 식염수로 상처를 헹구고 면봉으로 수술 부위를 말리십시오.
  3. 봉합사골 복합 결점 모델 수립
    1. 손잡이를 돌려 수술용 모터를 35,000rpm으로 설정한 다음(그림 1A, 노란색 화살표) 스위치(그림 1A, 흰색 화살표)를 켭니다.
    2. 관상동맥 봉합사의 어느 지점에서나 시작하여 돌파구가 느껴질 때까지 1.2mm 직경의 둥근 버를 사용하여 수직력을 가합니다.
      알림: 관상 봉합사의 중간 지점( 그림 2E2에서 노란색 화살표로 표시)을 침투 시작점으로 권장합니다. 그라인딩할 때 치과 드릴은 두개골 표면에 수직을 유지해야 합니다. 뇌 손상이나 뇌출혈을 포함하여 쥐에게 더 이상의 해를 끼치지 않도록 두개골의 전체 두께를 관통 한 후에도 계속 드릴링하지 않도록 주의하십시오.
    3. 관통 지점에서 관상 봉합사를 따라 버를 측면으로 이동하여 약 4mm 길이의 포지셔닝 홈을 만듭니다(그림 2F1). 포지셔닝 홈의 양쪽에 bur가 있는 뼈 조직을 제거하여 초기에 직사각형 전체 두께 결함을 형성합니다(그림 2F2).
    4. 0.8mm 직경의 원형 버를 사용하여 직각 연삭 및 결함 여백의 평활화를 포함하는 세부 사항을 미세 조정하고(그림 2G1) 궁극적으로 너비 2mm, 길이 4.5mm의 표준 직사각형 결함을 달성합니다(그림 2G2).
      참고: 300g SD 쥐에서 시상 및 정면 봉합사를 보존하면서 관상 봉합사를 완전히 제거하기 위해 최대 실현 가능한 결함 길이는 약 4.5mm입니다. 전후 방향의 관상동맥 봉합사의 폭을 고려하여(보충 그림 S1), 결점 폭은 2mm로 설정하였다.
    5. 자가 비교를 위해 관상동맥 봉합사의 왼쪽 및 오른쪽 절반에 걸쳐 두 개의 결함을 만듭니다.
    6. 두개골과 뇌의 열 손상으로부터 보호하기 위해 드릴링 절차 동안 식염수의 지속적인 관개를 유지하십시오. 한편, 면봉을 사용하여 작업 부위를 말리십시오.
  4. 시료 치수 검증
    1. 버니어 캘리퍼(그림 2H1, H2)를 사용하여 결함의 길이와 너비를 정기적으로 확인하여 모든 샘플에서 일관성을 보장합니다.
  5. 수술 부위 폐쇄
    1. 3-0 모노필라멘트 봉합사로 피부를 닫습니다(그림 2I).
  6. 수술 직후 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT)
    1. 가능한 경우 수술 직후 모든 쥐에 대해 in vivo μCT 스캔을 수행하여 수술 절차의 성공을 확인하고 각 개체의 결함 회복 추세를 모니터링합니다.

3. 수술 후 관리

  1. 동물 관리 프로토콜에 따라 수술 후 필요에 따라 확립된 진통제, 예를 들어 카프로펜(5mg/kg, 피하 사용)을 투여합니다.
  2. 수술 후 회복을 위해 쥐를 일정한 가열 패드(37°C)로 옮깁니다.
  3. 의식이 완전히 회복되면 쥐를 깨끗한 침구가 있는 사육장으로 옮깁니다.
    참고: 수술 후 쥐를 지속적으로 모니터링하십시오. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 때까지 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 수술한 쥐를 다른 쥐로부터 격리시키십시오.
  4. 24시간 동안 진통 관리 및 수술 후 모니터링을 실시한 후 수술 후 첫 주 동안 매일 평가를 실시합니다. 그 후 일주일에 최소 1-2 번 쥐를 모니터링하십시오.

4. 시료 채취 및 데이터 분석

  1. 시료 전처리
    1. 수술 후 0일째, 2주차, 6주차 및 12주차에 두개골 검체를 수집합니다. CO2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
    2. 추가 분석 전에 샘플을 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정합니다.
  2. μCT 평가
    1. 다음 스캔 매개변수를 사용하여 수술 후 0일, 6주차, 12주차의 두개골에 대한 μCT 스캔을 수행합니다 : X선관 전위, 70kVp; X선 강도, 0.2mA; 필터, AL 0.5mm; 통합 시간, 1 x 300ms; 및 복셀 크기, 10 μm.
    2. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성 및 단면 이미지를 얻을 수 있습니다( 재료 표 참조).
    3. 잔류 결함 부피를 측정하고 해당 소프트웨어로 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
  3. 조직학적 염색
    1. 4°C에서 6주 동안 12%(w/v) 에틸렌 디아민 테트라아세트산 용액(pH = 7.2)으로 두개골을 석회질합니다.
      알림: 3일마다 용액 교체로 샘플을 석회질화하십시오. 프로세스를 신속하게 처리하기 위해 셰이커를 사용하십시오. 25G 바늘이 시료에 쉽게 침투하면 완료가 표시됩니다.
    2. 표준 프로토콜18을 사용하여 탈수, 파라핀 포매 및 6μm 절편 준비를 진행합니다.
    3. 키트 프로토콜18에 따라 hematoxylin 및 eosin(H&E) 및 Masson의 삼색 염색을 사용하여 조직학적 분석을 수행합니다.

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결과

이 연구에서는 관상 봉합사를 가로질러 4.5mm x 2mm의 직사각형 구멍을 뚫어 쥐의 종아리 봉합사-뼈 복합 결손을 확립했습니다. 수술 개략도와 연구 흐름도는 그림 3에 나와 있습니다. 수술 후 0일 샘플, 즉 수술 직후 수집된 샘플의 3D 이미지와 단면도는 관상 봉합사와 양쪽 끝의 인접한 뼈 구조를 완전히 제거하는 것과 관련된 전체 두께 종골 결손의 성공적인 생성을 확인했습니다(그림 4A). 수술 후 6주 시점의 μCT 영상과 해당 통계 분석 결과, 결손 내에 형성된 불규칙한 석회화 결절과 함께 결손 봉합에 대한 자연스러운 경향을 보여주었습니다(그림 4). 이러한 경향은 수술 후 12주 후에 더욱 두드러졌는데(그림 4), 이는 시간이 지남에 따라 봉합사 유합 가능성이 있음을 나타냅니다. 추가 조직학적 분석은 H&a...

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토론

기존의 종래의 종골 결손 모델은 두개골 봉합사를 포함하든 그렇지 않든 주로 경조직의 복구에 집중하며, 봉합사 중간엽의 생명 재생을 무시하는 경우가 많다19,20. 봉합사 재생 연구에서, Mardas et al.15,16과 같은 이전 모델은 트레핀 버를 사용하여 쥐의 시상 봉합사 전체에 5mm 원형 결함을 생성함으로써 상당한 경조직 손실을 초래하여 봉합사 재생의 주요 목표에서 벗어났습니다. 이와 유사하게, Wilk et al.7의 방법론은 시상 봉합사와 우측 관상골 봉합사를 모두 제거하고 우측 두정골에 심각한 뼈 결손을 생성하는 것을 포함하며, 유익하기는 하지만 여러 결손 부위의 존재로 인해 복잡성과 잠재적인 교란 변수를...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 82100982(F.L.), 82101000(HW), 82001019(B.Y.), 쓰촨성 과학기술부 2022NSFSC0598(B.Y.), 2023NSFSC1499(HW) 및 West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University(RCDWJS2021-5)의 연구 자금의 지원을 받았습니다. 그림 3은 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드BiosharpBL539A
2% 요오드 용액Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.없음
75% 에탄올Chengdu Jinshan 화학 시약 Co., Ltd.없음
면봉Haishi Hainuo Group Co., Ltd. 없음
면봉Lakong Medical Devices Co., 없음
구부려진 겸자Chengdu Shifeng Co., 주식 회사.없음
잔류 결함 볼륨 평가를 위한 Dataviewer 및 Ctan 소프트웨어Bruker없음
치과 저속 라운드 버Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
일회용 멸균 메스Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.없음
일회용 주사기 (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
전기면도기JASEBM320210
에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)BioFroxx1340GR500
헤마톡실린 및 에오신 염색 키트BiosharpBL700B
관개 바늘(23G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.없음
저속 핸드피스Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.없음
Masson' s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
의료용 부직포Henan Yadu Industrial Co., Ltd. 없음
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(µ CT) Scanco Medical AGµ CT45
는 단면 이미지를 위해 20.0을 모방합니다MaterialiseNone
바늘 홀더Chengdu Shifeng Co., Ltd.없음
Periosteal 엘리베이터Chengdu Shifeng Co., Ltd.없음
식염수 용액Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.없음
Scanco 의료 시각화 소프트웨어는 3D 이미지 재구성을 위한 ScancoMedical AG없음
SPSS Statistics 20.0 통계 분석을 위한IBM없음
Sprague-Dawley 쥐 Byrness Weil Biotech Ltd없음
스트레이트 가위Chengdu Shifeng Co., Ltd.없음
외과 모터마라톤N3-140232
외과용 봉합사(3-0 모노필라멘트)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.없음

참고문헌

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