얇아진 두개골 창과 유체 타악기를 통합한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상의 수정된 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 폐쇄성 두부 손상(CHI) 방법을 통해 유도된 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(rmTBI)의 수정된 마우스 모델을 제시합니다. 이 접근법은 두개골 창과 유체 타악기를 사용하여 수막 노출로 인해 일반적으로 발생하는 염증을 줄이고 설치류의 rmTBI 모델링에서 재현성 및 정확도를 향상시킵니다.

초록

경미한 외상성 뇌 손상은 임상적으로 매우 이질적인 신경 장애입니다. 경증 TBI 후 신경병리학의 기전을 연구하고 치료제를 테스트하기 위해 잘 정의된 병리학을 가진 재현성이 높은 외상성 뇌손상(TBI) 동물 모델이 시급히 필요합니다. 동물 모델에서 TBI의 전체 후유증을 복제하는 것은 어려운 일임이 입증되었습니다. 따라서 TBI 환자에서 볼 수 있는 다양한 측면과 중증도를 설명하기 위해 TBI의 여러 동물 모델을 사용할 수 있어야 합니다. CHI는 rmTBI의 설치류 모델을 제작하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그러나 이 방법은 사용된 충격 방법, 두개골 뼈의 두께와 모양, 동물 무호흡증, 사용된 머리 지지대 및 고정 유형 등 여러 요인에 취약합니다. 이 프로토콜의 목적은 얇은 두개골 창과 FPI(Fluid Percussion Injury) 방법의 조합을 시연하여 CHI 관련 rmTBI의 정확한 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두개골 두께, 모양 및 머리 지지대를 포함하여 CHI 및 FPI 모델링의 정확성과 일관성에 영향을 줄 수 있는 요인을 최소화하는 것입니다. 얇은 두개골 창 방법을 활용함으로써 개두술 및 FPI로 인한 잠재적 염증을 최소화하여 경증 TBI 환자에서 관찰된 임상적 특징을 복제하는 개선된 마우스 모델을 얻을 수 있습니다. 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin, HE) 염색을 사용한 행동 및 조직학적 분석 결과는 rmTBI가 뇌의 행동과 총체적 형태 모두에 변화를 일으키는 누적 손상으로 이어질 수 있음을 시사합니다. 전반적으로, 변형된 CHI 관련 rmTBI는 연구자들이 rmTBI의 초점 및 미만성 병태생리학적 변화에 기여하는 기본 메커니즘을 탐구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

뇌진탕 및 준뇌진탕을 포함한 경증 TBI는 모든 TBI 사례의 대부분을 차지합니다(전체 TBI의 >80%)¹. 경증 TBI는 일반적으로 낙상, 교통사고, 폭력 행위, 접촉 스포츠(예: 축구, 복싱, 하키) 및 군사 전투에 의해 발생한다 ^2,3. 경증 TBI는 환자의 일생 동안 신경 행동 기능에 영향을 미치고 신경 퇴행성 질환의 위험을 증가시키는 신경 생물학적 사건으로 이어질 수 있습니다 ^4,5,6. 동물 모델은 경증 TBI를 연구할 수 있는 효율적이고 통제된 수단을 제공하며, 경증 TBI의 진단 및 치료를 더욱 향상시킬 수 있기를 희망합니다. 경증 TBI에 대한 다양한 모델이 개발되었는데, 예를 들어 CCI(Controlled Cortical Impact), WD(Weight Drop), FPI(Fluid Percussion Injury) 및 blast-TBI 모델 ^7,8이 있다. 단일 실험 모델은 TBI 유발 병리학 ^9,10의 전체 복잡성을 모방할 수 없습니다. 이러한 모델의 이질성은 경증 TBI 환자와 관련된 다양한 특징을 다루고 해당 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 데 유리합니다. 그러나 TBI의 각 동물 모델^{에는 한계가} 있으며3 이는 동물 경증 TBI에 대한 현재의 지식과 그 임상적 타당성을 제한한다.

WD 및 CCI 모델은 뇌 조직 손실, 급성 경막하 혈종, 축삭 손상, 뇌진탕, 혈액-뇌 장벽 기능 장애 및 TBI ^3,11,12에 따른 혼수와 같은 임상 상태를 복제하는 데 사용됩니다. WD 모델은 자유롭게 떨어지는 추로 경막이나 두개골을 쳐서 뇌 손상을 유도하는 것을 포함합니다. 무게가 가해진 물체가 온전한 두개골에 가해지는 충격은 혼합된 초점/미만 부상을 재현할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 부상 부위의 낮은 정확도 및 반복성, 반동 부상 및 두개골 골절로 인한 높은 사망률과 관련이 있습니다 ^3,11,12. CCI 모델은 공기 구동 금속을 적용하여 노출된 경막에 직접 충격을 가하는 것을 포함합니다. WD 모델과 비교하여, CCI 모델은 보다 정확하고 재현 가능하지만, 충격 팁(¹¹)의 직경이 작기 때문에 확산성 부상을 일으키지 않는다. FPI 모델링 중에 뇌 조직은 충격에 의해 잠시 변위되고 변형됩니다. FPI는 혼합성 국소/미만성 손상을 유발할 수 있으며 TBI 후 두개내 출혈, 뇌 부종 및 진행성 회백질 손상을 복제할 수 있습니다. 그러나 FPI는 뇌간 손상과 장기간의 무호흡증으로 인해 사망률이 높습니다 ^3,12. 기존의 WD, CCI 및 FPI 모델에 포함된 개두술은 대뇌 피질 타박상, 출혈성 병변, 혈액-뇌 장벽 손상, 면역 세포 침윤, 신경교세포 활성화, 모델링 시간 연장 및 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다 ^3,12.

경증 TBI는 GCS(Glasgow coma scale, GCS) 점수가 13에서 15 사이의 범위를 특징으로 합니다². 경증 TBI는 국소 또는 미만성일 수 있으며 세포 항상성 파괴, 흥분독성, 포도당 고갈, 미토콘드리아 기능 장애, 혈류 장애 및 축삭 손상과 같은 급성 손상뿐만 아니라 축삭 손상, 신경 염증 및 신경교증을 포함한 아급성 손상과 관련이 있습니다 ^2,3. TBI의 복잡한 병태생리학을 설명하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 경증 TBI/rmTBI의 기전은 여전히 파악하기 어려우며 추가 연구가 필요하다⁹. CHI가 TBI⁽¹²)의 가장 흔한 유형이라는 점을 감안할 때, 이 프로토콜은 얇아진 두개골 창(¹³)에 충격을 가하기 위해 수정된 FPI 장치를 사용하여 보다 정밀하게 제어되는 rmTBI의 마우스 모델을 생성하는 새로운 접근법을 제시한다. 이 접근 방식은 개두술로 인한 부상, 다양한 두개골 두께 및 모양으로 인한 부정확성, 반동 부상을 방지함으로써 WD, CCI 및 FPI 모델과 관련된 주요 단점을 극복하는 것을 목표로 합니다. 얇아진 두개골 창에 FPI 충격을 가하면 rmTBI 후 뇌혈관 손상을 평가하는 데 편리하며 일부 모델에서 높은 사망률을 최소화하는 데 도움이 되어 TBI 환자의 임상적 특징과 더 유사합니다.

프로토콜

이 프로토콜과 관련된 모든 절차는 기관 동물 보호 및 사용 위원회 승인(Zhejiang Normal University, 허가 번호, dw2019005)에 따라 수행되었으며 ARRIVE 및 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었습니다. 기술 사양은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 동물 취급 절차

1. 22-24 °C의 온도, 40%-60%의 습도 범위, 12시간의 명암주기가 있는 통제된 환경에서 생쥐를 사육하고 물과 표준 생쥐 차우에 대한 임시 접근을 제공합니다. 이 실험의 목적을 위해, 25마리의 ICR 수컷 마우스(25-30 g, 8주령)를 사용하였다.
2. 마우스를 대조군(n=12) 또는 rmTBI 그룹(n=13)에 무작위로 할당합니다. rmTBI를 겪은 쥐에 대한 가짜 쥐의 잠재적인 공격을 방지하려면 별도의 케이지에 분리하십시오.
3. 실험을 시작하기 전에 쥐가 케이지 환경에 적응할 수 있도록 최소 1주일을 주십시오. 이 적응 기간은 쥐가 주변 환경에 익숙해지도록 하고 연구 중 생리적 또는 행동 반응에 대한 스트레스나 불안의 잠재적 영향을 최소화합니다.

2. TBI 장치 준비

1. 수정된 FPI 장치를 사용하여 마우스에서 rmTBI 모델을 제작합니다( 재료 표 참조; 그림 1A) ¹³. FPI 장치를 사용하기 전에 실린더와 튜빙 사이, 3방향 커넥터와 튜빙 사이의 접합부에 특히 주의하면서 모든 연결부에 누출 또는 균열의 징후가 있는지 주의 깊게 검사하십시오. 충격 압력을 정확하게 결정하기 위해, 압력 트랜스듀서는 유체 충격 손상 장치⁽¹³)에 대한 충격 지점까지 설치되었다.
2. 피스톤이 실린더 내부에서 부드럽게 움직이고 충격이 효과적으로 가해질 수 있는지 확인하기 위해 FPI 장치를 주의 깊게 검사하십시오(그림 1B). 시스템 내에 기포가 없는지 확인합니다. 기포가 감지되면 50mL 주사기를 사용하여 시스템에 증류수를 조심스럽게 추가하고 가까운 3방향 커넥터 및/또는 주사기를 통해 실린더 로드를 빠르게 밀어 기포를 배출합니다.
   알림: FPI 시스템은 실린더 내부의 증류수와 연결된 튜브로 구성됩니다. 결과의 정확성과 신뢰성을 보장하기 위해 작동 전에 장치를 보정하는 것이 중요합니다.

3. 두개골 얇아짐 준비

참고: 동물 수술 및 두개골 얇아짐 준비는 다른 마우스를 고려하여 수행해서는 안 됩니다. 얇아진 두개골 창은 FPI 시술 후 뇌혈관 손상을 평가하는 데 유용합니다.

1. 실험 운영자에게 모든 동물 취급 절차 동안 멸균 가운과 마스크를 착용하도록 지시하여 동물 센터의 요구 사항을 준수하십시오.
2. 70% 에탄올 스프레이를 사용하여 실험을 시작하기 전에 실험실 벤치 탑, FPI 장치, 마취 튜브 및 인접한 카운터 공간을 소독하십시오.
3. 수술 전에 가짜 그룹과 rmTBI 그룹 모두에서 마우스의 무게를 측정하고 실험 1주일 전에 기록된 체중과 비교합니다. 거친 털, 설사, 체중 감소 또는 무기력증과 같은 좋지 않은 건강을 보이는 쥐를 연구에서 제외하십시오. 또한 반복적인 충격을 견딜 수 있는 능력을 보장하기 위해 무게가 20g 미만인 마우스를 제외하십시오. 이러한 조치는 동물 복지를 유지하고 신뢰할 수 있는 실험 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다.
4. 유도 챔버에서 3-4분 동안 4%-5% 이소플루란(1L/min의 유속으로 100% 산소)으로 마우스를 마취합니다. 수술 내내 윤활을 유지하기 위해 동물의 눈에 안과용 윤활제( 재료 표 참조)를 투여합니다. 통증을 완화하려면 마취 20분 전에 귀 사이의 중간 지점에 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 투여하고 그 후에는 24시간 동안 6시간마다 투여합니다. 또한, 마취가 끝나면 각 동물에게 5mg/kg 카프로펜의 단일 피하 용량을 투여합니다.
5. 마우스가 righting과 페달 철수 반사를 잃은 후 머리를 소독하십시오. 수술용 가위를 사용하여 쥐 머리의 털을 자르고 면도기를 사용하여 남아 있는 털을 제거합니다. 2% 클로르헥시딘을 3회 순차적으로 바르고 75% 에탄올 스크럽을 뿌려 두피를 소독합니다.
6. 적절한 위생을 보장하기 위해 동물과 주변 지역 아래에 일회용 멸균 수술 패드를 놓습니다. 쥐의 두피 정중선을 따라 가는 작은 수술용 가위를 사용하여 1.5cm를 절개하여 수술 부위를 완전히 노출시킵니다(그림 2A).
7. 기존의 입체 프레임에서 단자가 없는 이어 바를 사용하여 마우스를 고정합니다( 재료 표 참조). 스테레오택스 프레임에서 마우스 헤드 위치를 조사할 특정 대상 영역에 따라 평평한 수준 또는 약간 기울어진 각도로 조정합니다. 나중에 염증이 생기지 않도록 수술 부위의 털을 깨끗이 닦아냅니다.
8. 기존의 등온 가열 패드를 사용하여 마우스의 체온을 37°C로 유지합니다( 재료 표 참조).
9. 수술 및 임팩트 허브(female Luer Lock) 설치 과정 중에는 보정된 기화기에 의해 조절되는 연속 2% 이소플루란 농도를 전달하는 노즈 콘으로 마우스 마취(발가락 또는 꼬리 꼬집음에 대한 반응 없음)를 유지합니다.
10. 멸균 식염수를 적신 면봉을 사용하여 얇아진 두개골 창 주변의 수술 부위를 조심스럽게 청소합니다.
11. 끝이 납작한 마이크로 드릴 비트( 재료 표, 그림 2B 참조)와 미세 수술 칼날을 사용하여 오른쪽 전두엽 운동 피질에 직경이 약 2.5mm, 두께가 20μm인 얇은 두개골 창을 만듭니다. 수술 부위는 브레그마 전방 1.5mm, 정중선 측면 1.3-2.0mm에 위치합니다(그림 2C).
    1. 얇은 두개골 창을 만드는 동안 마이크로 드릴이 두개골을 관통하는 것을 방지하려면 마이크로 드릴로 연마하는 동안 간헐적으로 두개골을 식염수로 적십니다.
    2. 가느다란 주사기 바늘의 납작한 끝으로 얇아진 두개골을 부드럽게 관찰하고 부드러움을 평가하여 두개골의 두께를 확인합니다. 두개골의 두께를 결정하기 위해 노출된 대뇌 피질 미세혈관의 투명도를 육안으로 추정합니다.
    3. 두개골의 두께를 확인하려면 얇아진 부위에 멸균 식염수를 바르고 기존의 해부 현미경을 사용하여 육안으로 검사합니다( 재료 표 참조). 이 기술은 두개골이 적절하게 얇아졌는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
       알림: 건조를 방지하기 위해 얇은 두개골 준비 및 rmTBI 모델링 절차 전반에 걸쳐 쥐 눈을 윤활하십시오. 두개골을 15 μm 미만으로 얇게 만들면 경미한 피질 염증이 발생할 수 있는 경미한 피질 외상의 위험이 있다¹⁴.
12. 조정된 암 Luer Lock( 그림 2.2D와 같이 19G 바늘 허브에서 만든 내경 2mm)을 얇아진 두개골 부위에 부착합니다. 접착제와 치과용 시멘트로 Luer Lock을 고정합니다(그림 2E).
    알림: 접착제를 사용하여 얇은 두개골 창 주변 영역에 암 루어 잠금 장치를 고정할 때 두개골 영역을 완전히 건조시키고 접착제가 창 자체로 들어가는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 창 내부의 접착제는 FPI의 충격력을 크게 줄일 수 있습니다.

4. CHI 관련 rmTBI 모델링 절차

1. 앞서 설명한 대로 수정된 FPI 장치와 함께 측면 유체 타악기 방법을 사용하여 rmTBI를 소개합니다^13,15.
2. 얇아진 두개골 창과 임팩트 허브 절차를 완료한 후 마우스를 입체 장치에서 임팩터 플랫폼으로 옮깁니다.
3. 마취가 타악기 ^9,16 후 동물의 교정 반사 시간 및 부상 중증도에 미치는 잠재적 영향을 감안할 때, 구개 및 발 철수 반사를 평가하여 마취 깊이를 모니터링합니다(그림 2F).
4. 얇은 두개골 창에 접착된 암 Luer Lock을 FPI 장치 튜브 끝에 있는 남성 Luer Lock에 연결합니다(그림 2G).
   참고: rmTBI 모델링에서 마우스의 이소플루란 유도 마취는 타악기에 의한 무호흡 및 무의식 유도로 인해 연장되었습니다.
5. 수정된 장치와 함께 두 개의 가벼운 TBI(48시간 간격)를 도입합니다. 두개골 엷게 만든 창 수술을 완료하고 Luer Lock을 설치한 직후 첫 번째 FPI 충격을 가합니다. 각 경우에 마우스가 발을 꼬집었을 때 철수 반사가 돌아오는 것을 보일 때만 FPI 충격을 투여하십시오(그림 2H). 심하게 마취된 마우스에 FPI 충격을 가하면 장기간의 무호흡과 사망을 유발할 수 있습니다.
   1. FPI 충격을 가하려면 장치의 각도기를 따라 진자를 지정된 각도까지 올리고 소프트웨어 제어^13,15를 사용하여 진자를 해제합니다. 충격은 설치류 연구 ^10,17,18에서 사용 된 확립 된 프로토콜에 따라 2.0 ± 0.1 atm의 타악기 강도를 달성해야합니다. 충격이 1.9-2.1 atm 사이에 등록되지 않았거나 FPI 중에 두개골 골절이 발생한 경우 동물을 추가 테스트에서 제외합니다.
   2. 가짜 쥐의 경우 장치에 고정하되 충격을 전달하지 마십시오.
6. 충격을 가한 후에는 즉시 Luer Lock 연결을 분리하고 회수를 위해 마우스를 등온 가열 패드로 옮깁니다. 쥐가 주의력과 의식을 되찾은 후에는 암컷 Luer Lock을 제거하지 않고 홈 케이지로 되돌려 놓습니다. 48시간 후에 동일한 방식으로 두 번째 FPI 충격을 투여합니다.
7. rmTBI 후 암 루어 잠금 장치와 치과용 시멘트를 조심스럽게 제거합니다. 티슈 접착제를 사용하여 두피를 봉합하고 납작한 집게를 사용하여 두피를 꼬집어 접착 과정을 용이하게 합니다( 재료 표 참조; 그림 2I).
8. 염증, 감염을 예방하고 수술 후 통증과 불편함을 완화하려면 에리스로마이신과 디클로페낙 나트륨 연고의 혼합물을 1:1 비율로 상처에 바르십시오( 재료 표 참조). 회수를 위해 마우스를 등온 가열 패드로 옮깁니다.
9. 마우스가 입체 장치에서 제거되고 FPI용 임팩터 플랫폼에 측면으로 배치될 때 시작되어 마우스가 독립적으로 똑바로 설 수 있을 때까지 계속되는 righting reflex의 지속 시간을 기록합니다.
10. 쥐가 경계심과 의식을 되찾으면 집으로 돌아가는 케이지로 되돌려 놓습니다. 생쥐는 일반적으로 의식이 완전히 회복되어 부상 후 1.5시간 이내에 걸을 수 있습니다.
11. TBI 모델링 후 며칠 동안 호흡 패턴, 코와 입 주변의 점액 존재, 상처 부위의 발적, 부기, 삼출물 또는 재개를 포함한 다양한 징후에 대해 마우스를 관찰합니다. 위의 비정상 증상 중 하나 이상을 가진 동물을 연구에서 제외합니다.
    참고: AAV-GCaMP6s의 사전 미세주입을 통해 이광자 레이저 스캐닝 현미경¹⁵을 사용하여 얇은 두개골 창을 통해 손상된 피질의 기저 신경 Ca2+ 항상성 및 흥분성을 관찰할 수 있습니다.

5. 모리스 워터 메이즈 (MWM) 테스트

참고: MWM( 재료 표 참조)은 TBI 후 마우스의 공간 학습 및 기억 결핍을 평가하기 위해 널리 알려진 방법입니다.

1. 부상 후 7일(DPI)부터 MWM 테스트를 수행합니다. MWM의 원형 수영장은 직경 120cm, 높이 50cm이며 수온은 25 °C로 유지되었습니다. 원형 수영장을 4개의 사분면으로 분리하고 탈출 플랫폼, 직경 6cm, 높이 30cm의 원형 플랫폼이 북동쪽 사분면의 수면 아래 1cm에 잠겨 있습니다.
2. 원형 수영장 바로 위에 카메라를 배치하여 쥐의 이동 궤적을 기록합니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 쉽게 인식할 수 있도록 그리고 대기 시간, 수영 거리 및 이동 궤적을 포함한 데이터를 기록할 수 있도록 마우스의 등에 검은색 테이프를 표시합니다.
3. 각 사분면에 대해 한 번씩 4개 사분면 각각의 내벽을 향하도록 마우스를 물 속에 넣습니다. 쥐가 플랫폼을 찾으면 10초 동안 그대로 두십시오. 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 운영자에게 마우스를 플랫폼으로 안내하고 10초 동안 플랫폼에 놓아둔 다음 마우스를 홈 케이지로 돌려보내 휴식을 취하도록 요청하십시오.
4. 각 마우스에 대해 수집 시험을 매일 4회 반복합니다. 획득 시험 후 12DPI에서 60초 공간 프로브 실험을 수행하고 마우스가 원래 플랫폼 영역을 횡단한 횟수와 플랫폼이 위치한 사분면에 마우스가 머무는 시간을 기록합니다.
5. 각 시험 후에는 수건으로 쥐를 빠르게 말리거나 온난화 램프 아래에 두어 DPI 7에서 DPI 11까지의 60초 획득 시험 동안 체온을 유지하고 저체온증을 방지합니다.
6. 위에서 설명한 실험 절차를 완료한 후 13DPI에서 펜토바르비탈(45mg/kg, ip)로 마우스를 마취합니다. 경막식으로 등장성 식염수를 관류한 다음 인산염 완충 식염수(pH 7.2)에 4% 파라포름알데히드를 관류합니다. 일반적인 HE 염색을 위해 뇌를 채취하여 총체적인 피질 및 해마 형태 변화를 평가합니다. HE 염색 프로토콜에 대한 상세한 설명은 선행 간행물^13,15에서 찾을 수 있다.
7. 모든 실험이 완료된 후 마우스 샘플이 필요하지 않은 경우 펜토바르비탈(≥100mg/kg, i.p.)을 과다 투여하여 마우스를 안락사시킵니다. 조직을 채취하거나 사체를 처리하기 전에 최소 60초 동안 심장 박동이 없을 때까지 쥐를 모니터링하십시오.

결과

이 연구에서 설명된 프로토콜은 얇은 두개골 창을 통해 rmTBI를 유도하는 방법을 간략하게 설명하며, 이는 기존 타악기 TBI 모델링 중 개두술 준비로 인한 뇌 손상에 대한 솔루션을 제공합니다. 이 수정된 유체 타악기 절차를 수정된 장치와 함께 사용함으로써 FPI 충격의 향상된 정밀도와 재현성이 달성되었습니다¹³. 수정된 임팩터는 두개골 개두술의 유무에 관계없이 CHI 및 FPI 모델링 모두에 사용할 수 있는 다양성을 가지고 있습니다. 또한, 부상의 심각성은 충격 진자의 하강 각도와 같은 부상 매개변수를 조정하거나 피스톤 폴의 엔드 플레이트에 다양한 경도의 폐쇄 셀 에틸렌-비닐 아세테이트 폼 패드를 추가하여 조절됩니다.

수정된 rmTBI 모델은 대뇌 피질 경막을 노출시키지 않고 국소 및 미만성 병리학을 생성하는 것과 같은 상당한 이점을 제공하여 수막 노출 및/또는 실질에 대한 직접적인 FPI로 인한 염증을 최소화합니다. 또한 이 모델은 두개골 뼈 두께와 모양의 변화를 줄여 신뢰할 수 있는 부상 결과를 생성합니다. 따라서 수정된 rmTBI 모델은 다양한 부상 정도에 걸쳐 임상적으로 관련된 뇌진탕 후 증상(PCS) 관련 신경 병리학적 및 행동 결함을 시뮬레이션하는 데 효과적이고 신뢰할 수 있습니다. 특히, 이 모델은 동물 TBI 모델의 정확성과 재현성에 의존하는 TBI 병리학적 기전을 조사하는 데 유용하며, 특히 경미한 TBI 관련 기전을 조사하는 데 유용합니다.

얇아진 두개골 아래에 위치한 쥐 중간 대뇌 동맥과 꼬리 코 정맥¹⁹의 전두엽 측면 분기는 카메라 아래에서 명확하게 시각화할 수 있었습니다. 각각 약 2.0 atm의 압력에서 두 번의 rmTBI 타악기 후 모든 마우스는 0 DPI에서 경막하 혈종을 나타냈습니다. 얇아진 두개골의 온전함은 손상되지 않은 것으로 보였지만; 그러나, 미세혈관 형태의 변화와 함께 미세혈관 수의 감소가 관찰되었으며(그림 2H), 이전에 보고된^{바와 같이 15}. 2DPI로 혈종이 대부분 해결되었습니다. 사망률은 주로 쥐가 깊은 마취 상태에 있는 동안 충격으로 인해 발생하며, 이로 인해 무호흡이 크게 연장될 수 있습니다. 충격이 가해지기 전에 구개와 발 철수 반사를 통해 마취 깊이를 정기적으로 평가하면 사망률을 크게 줄일 수 있습니다. 유체 타악기 후 사망률에 영향을 줄 수 있는 추가 요인에는 쥐의 긴장, 두개골 경도, 성별 및 연령이 포함됩니다. 동일한 rmTBI 프로토콜을 사용한 이전 연구에서 C57BL/6J 마우스 한 마리가^{죽었다 15}. 이 프로토콜에서는 전체 절차를 소개하기 위해 수컷 ICR 마우스만 사용되었습니다.

인간과 동물 연구 모두에서 반복적인 뇌진탕성 머리 충격조차도 광범위한 미세 구조 백질 손상을 유발할 수 있음을 보여주었습니다 ^20,21,22 이는 인지 능력 저하와 관련이 있습니다 ^21,22 . 7-12 DPI에서 rmTBI는 MWM 패러다임을 사용하여 조사된 공간 학습 및 기억에 손상을 일으킬 수 있습니다. 그림 4는 이 평가에서 얻은 결과를 보여줍니다.

MWM의 마지막 획득 시험을 분석한 결과, 대조군에 비해 rmTBI 마우스가 수중 플랫폼에 도달하는 데 걸리는 대기 시간이 크게 증가(p< 0.05)한 것으로 나타났습니다. 프로브 시험에서 원래 플랫폼 사분면에서 보낸 시간의 백분율을 분석한 결과 대조군에 비해 rmTBI 그룹이 유의하게 감소(p<0.01)한 것으로 나타났으며, 이는 rmTBI가 있는 마우스에서 공간 참조 학습 및 메모리 능력이 감소했음을 나타냅니다.

본 명세서에 기술된 방법은 C57BL/6J 마우스를 이용한 이전 간행물¹⁵ 에서 활용되었다. MWM 외에도 아래에 설명된 대로 세 가지 추가 분석이 수행되었습니다.

OFT는 평균 이동 속도, 총 이동 거리 및 중심 구역에서 이동 거리의 백분율을 측정하여 이동 및 탐사 능력을 평가하는 데 활용되었습니다. 6DPI에서 OFT(Open-field Test)를 수행하여 마우스의 운동, 탐색 및 불안을 평가합니다. 40 x 40 x 40cm 크기의 테스트 장치는 16개 구역(각각 18 x 18cm 측정)으로 나뉩니다. 마우스를 장치 중앙에 배치하고 5분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 했습니다. 중앙 4개 구역을 이동한 거리, 총 이동 거리, 평균 이동 속도, 경계 구역에서 보낸 시간을 기록했습니다. 불안 수준은 중앙 구역에서 이동한 거리의 백분율과 5분의 관찰 기간 동안 접경 구역에서 설치류가 보낸 시간을 기준으로 평가되었습니다. 6 DPI에서 rmTBI는 그림 4¹⁵와 같이 마우스의 일반적인 기관차 능력에 큰 영향을 미치지 않을 수 있으며, 상당한 불안을 유발하고 탐색 행동을 변경할 수 있습니다. 또한, 수정된 rmTBI 모델은 미만성 축삭 손상을 유발하며, 이는 이 프로토콜에 설명된 인지 능력 테스트와 같은 추가 행동 테스트를 통해 평가할 수 있습니다.

RmTBI는 그림 5¹⁵와 같이 마우스에서 공간 작업 및 참조 기억을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 인지 기능은 Y-미로 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 이 테스트는 마우스의 단기 작업 기억 결핍을 측정하기 위해 8 DPI에서 수행되었습니다. 자발적인 교대 행동을 위해 아크릴 Y-미로 장치(높이 20cm, 길이 50cm, 하단 너비 10cm)가 사용되었습니다. 마우스를 장치 중앙에 놓고 8분 동안 탐색하도록 한 후 팔 항목이 기록되었습니다. 자발적인 교대 행동은 마우스가 삼중항 세트의 세 팔에 연속적으로 들어가는 것으로 정의됩니다. 자발적 교대율(%)을 (연속 삼중항 세트 / 총 암 항목 수에서 2를 뺀 값) x 100으로 계산합니다. 공간 참조 메모리의 경우 8분 훈련 중에 Y-maze 장치의 한쪽 팔을 무작위로 닫습니다. 최초 노출 후 1시간 후, 쥐는 세 팔을 모두 벌린 상태로 미로에 다시 들어가 3분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 새로운 팔과 다른 두 팔을 탐색하는 데 소요된 시간이 기록됩니다. 선호도 지수를 새로운 군에서 보낸 시간과 세 군 모두에서 보낸 시간으로 계산합니다.

또한, 모든 행동 검사를 완료한 후 간단한 HE 염색(그림 6)¹⁵을 사용하여 뇌의 총 구조적 병변을 평가하는 것이 좋습니다. 병변 부위에서 전방 1mm에서 병변의 후방 가장자리까지 관상동맥으로 절단된 피질 영역과 전형적인 초승달 모양 영역(브레그마: -1.7에서 -2.2mm)에서 관상동맥으로 절단된 해마 영역을 사용합니다. 안구 격자(확대 400x)를 사용하여 6개의 무작위 필드에서 각 슬라이드의 뉴런을 계산하고 뉴런 수의 평균을 구하면 시야당 숫자 밀도(숫자 밀도)가 제공되었습니다. rmTBI의 영향을 받은 뇌 영역은 다양한 정도의 뉴런 손상을 보이는 것으로 밝혀졌다¹⁵. 특히, 운동 피질은 해마보다 더 강력하고 다양한 손상 정도를 보여주었다. HE 염색은 정상 뉴런에서 pyknotic 형태로의 상당한 변화를 보여주었습니다(그림 6A,B,E,F). 또한, 세포외 기질은 병변 부위에서 특이적으로 느슨해지는 것이 관찰되었습니다(그림 6F). 관찰된 기질이 느슨해진 영역 외에도 rmTBI 마우스는 치상이랑의 상당한 수의 입하 뉴런과 일부 피질 및 CA1 뉴런에서 더 어두운 빨간색으로 보이는 과변색 염색이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 이러한 염색 패턴은 세포질 수축 또는 pyknotic nucleus의 동반 징후를 나타내지 않았습니다(그림 6C,D,G,H,K)¹⁵. 위에서 언급한 행동(WMM 검사 제외) 및 HE 염색 방법은 수정된 rmTBI 모델¹⁵를 소개한 최근 간행물에 자세히 설명되어 있습니다.

그림 1: 수정된 FPI 장치 및 소프트웨어 스크린샷 (A) 수정된 FPI 장치. (B) 스크린샷은 FPI 압력 파형과 상승 시간, 하강 시간 및 절반 너비 지속 시간과 같은 실시간 충격 압력 매개변수의 자동 측정 및 내보내기를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: ICR 마우스에서 rmTBI의 수정된 마우스 모델. (A) 수술 부위를 노출시키기 위해 정중선을 절개합니다. (B) 운동 피질에 얇아진 두개골 창이 만들어졌다. 노출된 대뇌 피질 미세혈관의 투명도는 두개골의 두께를 결정하는 데 사용됩니다. (C) 두개골의 두께는 가느다란 주사기 바늘의 납작한 끝으로 얇아진 두개골을 부드럽게 관찰하고 부드러움을 평가함으로써 확인할 수도 있습니다. (D) 암컷 루어 락은 얇아진 두개골 창에 붙어있었습니다. (E) 부착된 암수 Luer Lock은 치과용 시멘트를 도포하여 고정되었습니다. (F) 마취 깊이는 구개와 발 철수 반사를 확인하여 모니터링했습니다. (G) FPI 영향은 철수 반사가 발 꼬집기로 돌아온 후에 전달되었습니다. (H) 0 DPI에서 얇아진 두개골 창의 포스트 rmTBI 이미지. (I) 두피를 티슈 접착제로 봉합했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: ICR 마우스의 공간 참조 학습 및 메모리에 대한 rmTBI의 효과. (A) 11 DPI로 기록된 마지막 획득 시험 중 마우스의 탐색 추적, (B) 12 DPI로 기록된 프로브 시험의 공간 프로브 경로, (C) 마지막 획득 시도 동안 마우스가 플랫폼을 찾는 데 걸린 탈출 시간. 그 결과, rmTBI 그룹은 대조군보다 숨겨진 플랫폼에 도달하는 데 훨씬 더 오래 걸리는 것으로 나타났습니다(p<0.05). (D) 프로브 시험 중 총 탐색 시간에 대한 원래 플랫폼 사분면에서 마우스가 보낸 시간의 비율은 대조군보다 rmTBI 그룹에서 유의하게 낮았습니다(p<0.01). n=8. *p<0.05, **p<0.01 vs. unpair t-test에 의한 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: C57BL/6J 마우스의 이동, 탐색 및 불안에 대한 rmTBI의 효과. (A) 5분 OFT 동안 대조군 및 rmTBI 마우스 움직임의 대표적인 흔적. (B-E) 요약된 데이터는 중앙 구역에서 이동한 거리, 총 이동 거리, 평균 이동 속도 및 주변 구역에서 보낸 시간을 각각 보여줍니다. 제어, n=13; rmTBI, n =12입니다. 피<. 01 vs. 비쌍체 T-검정에 의한 대조군. 이 수치는¹⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: C57BL/6J 마우스의 공간 작업 및 참조 메모리에 대한 rmTBI의 효과. (ᅡ, 나) Y 미로에서 공간 작업 및 참조 기억 평가 중 제어 및 rmTBI 마우스 움직임의 대표적인 흔적. Y 미로 자발적 교대 테스트는 설치류 모델¹⁵에서 단기 기억을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다. (C) 공간 작업 평가 중 대조군과 rmTBI 마우스의 자발적 교대 속도 요약. 설치류는 일반적으로 이미 탐험한 부분을 다시 방문하는 것보다 미로의 새로운 부분을 탐험하는 것을 선호합니다. 선호도 지수는 설치류가 새로운 팔에서 보낸 시간과 세 팔 모두에서 보낸 시간을 기준으로 계산되며, 이 지수는 그런 다음 분석됩니다. (D) 공간 작업 평가 중 대조군 및 rmTBI 마우스의 선호도 지수 요약. 제어, n=13; rmTBI, n=12입니다. 피<. 01 vs. 비쌍체 T-검정에 의한 대조군. 이 수치는¹⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: C57BL/6J 마우스에서 대조군과 rmTBI 사이의 동측 손상 운동 피질과 해마 치마 이랑의 HE 염색 비교. (ᅡ, 나) 정상적인 운동 피질; 및 (C, D) 다양한 배율에서 대조군 마우스의 해마 영역. (E, F) rmTBI 마우스의 손상된 운동 피질 및 (G, H) 해마 영역. 대뇌 피질과 CA1의 과색성 뉴런은 수술 준비 또는 지속적인 rmTBI에 의해 약간 영향을 받았을 수 있습니다. 그러나, 대조군 마우스의 정상 뉴런과 비교했을 때, rmTBI 마우스의 운동 피질에서 저색성(중간 손상일 수 있음) 및 pyknotic (apoptotic 뉴런) 뉴런이 관찰되었습니다. 이러한 신경 세포 사멸 특징에는 신경 세포질 및 핵 수축이 포함되며 명백한 액포가 수반됩니다. 특히, (E)의 경계선 흰색 선은 병변 조직과 주변 조직 사이의 경계를 나타냅니다. 또한, DG 하위 영역(H)의 과색 뉴런은 새로 생성된 미성숙 및 성숙한 과립 뉴런을 지칭했을 수 있습니다. 아래 막대 그래프는 (I) 운동 피질과 해마 (J) CA1 및 (K) DG 하위 영역에서 정상 및 rmTBI 영향 뉴런의 분포를 보여줍니다. 제어, n=13; rmTBI, n=12, ***p<입니다. 001 vs. 비쌍체 T-검정에 의한 대조군. 이 수치는¹⁵에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

TBI는 폐쇄형과 관통성의 두 가지 주요 유형을 말하며, 후자는 두개골과 경막의 파괴를 특징으로 합니다. 임상 데이터에 따르면 CHI는 관통 부상보다 더 흔합니다 ^1,2. 한 번의 경미한 TBI 후유증 후, 대부분의 환자는 일반적으로 단기간에 해결되는 PCS 증상을 경험하며, PCS가 장기 후유증으로 발전하는 환자의 비율에 대해서는 논란이 있다^23,24. 결과적으로, 연구자들은 낙상, 교통 사고 및 접촉 스포츠에서 일반적으로 발생하는 다발성 뇌진탕²⁵의 누적 효과를 더 잘 이해하기 위해 반복적인 CHI 모델에 초점을 맞추었습니다. 이러한 반복적인 영향은 더 심각하고 장기적인 영향을 초래할 수^{있다 26,27}. 반복적인 CHI 모델을 사용하여 연구자들은 여러 뇌진탕의 잠재적인 부가적 또는 시너지 효과를 탐색하고 PCS에 기여하는 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이러한 모델은 반복적인 머리 충격의 장기적인 결과를 완화하기 위한 표적 치료 중재의 개발을 촉진할 수 있습니다.

일부 CHI 모델은 선형 힘과 회전력을 모두 통합하여 초점 단일과 rmTBI를 모두 시뮬레이션하려고 시도하지만, 이러한 모델은 두개골 골절, 두개골 형태 및 두께, 확장된 동물 무호흡증¹⁰, 특히 회전 머리 움직임이 통합된 경우 기계적 입력 매개변수의 변동성과 같은 요인으로 인해 반동 부상 및 부상 중증도의 부정확성을 초래할 수 있습니다⁹. 피스톤 제어 충격 및 중량 강하 방법은 CHI²⁵의 동물 모델에서 rmTBI를 유도하는 데 일반적으로 사용됩니다. 피스톤 제어 충격은 전자기 또는 공압 구동 임팩터 장치를 사용하여 충격 매개변수를 정밀하고 조정 가능한 설정으로 할 수 있어 높은 충격 재현성을 가능하게 합니다. 그러나 CCI에서와 같이 노출된 피질에 또는 닫힌 두개골에 피스톤 제어 충격을 사용하려면 충격 중에 동물의 머리를 입체 프레임에 엄격하게 고정해야 합니다. 반대로, 중량 감소 방법은 설치가 쉬운 간단하고 비용 효율적인 재료가 필요하지만, 부상의 심각성에서 다소 높은 변동성이 단점이 있습니다²⁵.

FPI 모델은 일반적으로 혼합 국소 및 미만성 부상을 유발하여 다양한 중증도의 TBI를 제조할 수 있습니다. 장점에도 불구하고 FPI 모델에는 잠재적인 제한 사항도 있습니다. CCI 모델과 마찬가지로, FPI는 여전히 뇌 조직에 염증을 유발할 수 있는 외과적 절차인 개두술을 필요로 한다¹⁷. 더욱이, 가벼운 FPI조차도 다양한 깊이에서 경막을 관통하는 경우가 많아 데이터 해석에 혼란을 초래할 수 있습니다. 따라서 CCI 및 FPI 모델은 경증 TBI 환자에서 관찰되는 임상적 특징을 복제하는 데 한계가 있다⁹. 따라서 우리는 CHI 관련 rmTBI의 보다 정확한 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수 있는 thinned-skull window와 FPI 방법을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목적은 경증 TBI 환자의 임상적 특징을 밀접하게 반영하는 것입니다. 재현성이 높은 모델은 경증 TBI의 병태생리학의 기저를 조사하고 잠재적인 치료적 개입을 평가하는 데 매우 유용한 도구가 될 것입니다.

rmTBI에 대한 우리의 연구 결과는 경미한 TBI 조사를 위해 얇은 두개골 창을 활용한 이전 간행물과 일치합니다^28,29. 예를 들어, Ren et al.은 좌측 두정골 연합 피질(left parietal association cortex)에 약 30μm 두께의 얇은 두개골 창을 만들었으며, 수술용 입체 기구⁽²⁹)에서 직경 1mm의 뭉툭한 끝을 사용하여 창을 부드럽게 눌러 경미한 TBI를 유도했습니다. 그들의 연구는 손상된 피질에서 세포 사멸과 반응성 산화 종(ROS) 발현의 현저한 확장을 보여주었다²⁹. rmTBI를 조사하기 위해 Nguyen et al.은 두정 협회 피질(²⁸)의 쥐가 얇아진 두개골 창(두께 20-40μm)에 수정된 임팩터 팁(1.5mm 두께의 3mm 직경의 원형 실리콘 팁)이 있는 3개의 CCI를 적용했습니다. 장기 이미징을 위해 얇아진 두개골 영역의 투명도를 보호하고 유지하기 위해 그들은 얇아진 두개골 창을 시아노아크릴레이트 접착제의 얇은 층으로 덮었습니다. 3개의 CCI는 3주 동안 일주일에 한 번씩 수행되었으며, 충격 매개변수는 속도 4m/s, 깊이 2mm였습니다. 3개의 CCI의 결과, 마우스는 명백한 성상교세포증(astrogliosis)과 미세아교세포(microglial) 활성화를 보여주었다²⁸. 경증 TBI/rmTBI의 모델로 얇아진 두개골 창을 사용한 것은 비교적 최근의 일이라는 점을 감안할 때, 부상의 중증도/진행과 다양한 충격 기법 간의 관계를 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 2일 간격으로 투여된 두 개의 FPI 후 세포 형태에서 명백한 변화를 관찰할 수 있었습니다¹⁵. 한편, 다른 연구에서는 얇아진 두개골 창을 한 번 부드럽게 압박하면 명백한 세포 사멸 및 반응성 산화 종 발현을 동반한 경미한 TBI가 유발되었으며²⁹ 3주간의 CCI는 강력한 성상교증과 미세아교세포 활성화를 초래했다²⁸.

설명된 방법을 사용하여 일관된 부상 모델을 제작하기 위해 몇 가지 단계를 신중하게 진행해야 합니다. 얇아진 두개골 창 작업 중에는 다른 대상 영역(예: 운동 피질에 중점을 둠)에 따라 마우스 머리는 이 프로토콜에서 얇은 두개골 창의 반대쪽을 향해 약간 측면 각도로 수평 수준의 정위 프레임에 고정되어야 합니다. 이 특정 위치는 운동 피질에 해당하는 영역에서 얇아진 두개골 창의 생성을 용이하게 할 수 있습니다. 이어 바를 정확하게 배치하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 측면 중 하나이며 마스터하는 데 시간과 연습이 필요할 수 있습니다. 두개골 창 솜씨 수술을 시도하거나 CHI를 유도하기 전에 두개골이 수평인지 확인하는 것이 중요합니다. 두개골의 위치가 올바르지 않으면 그에 따라 머리를 조정해야 합니다. 두개골 뼈의 불균일한 모양과 두께로 인해 두개골 성장은 특정 뼈 내에서도 가변적이므로 얇은 두개골 창 절차(^CHI)를 수행하기 전에 머리 위치를 조정하는 것이 중요합니다. 그렇게 하지 않으면 두개골 골절의 위험이 증가하여 CHI 정확도와 신뢰성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 얇아진 두개골 창 절차에 대한 보다 포괄적인 지침은 Guang et ^al.14에 요약된 프로토콜을 참조하십시오.

TBI 모델링 영역의 선택은 연구 초점에 따라 연구자마다 다릅니다. 대부분의 연구에서 충돌 부위가 브레그마와 람다 사이의 중앙에 위치한다고 보고했음에도 불구하고, CHI에서 손상의 실제 위치에 대한 상당한 변동성을 감안할 때, CHI 동물 모델²⁵에 대한 검토에서 언급된 바와 같이, 향후 실험 연구에서 충격 위치를 변경하는 것이 권장된다. 수정된 CHI 얇아진 두개골 손상 모델을 검증하려면 이 프로토콜에 설명된 대로 운동 피질부터 시작하는 것이 좋습니다. rmTBI는 국소 운동 피질 손상을 유발할 수 있으며, 이 프로토콜의 OFT와 같은 운동 평가 접근 방식을 사용하여 쉽게 평가할 수 있습니다. 이 과정에서 절개한 부위는 치유되는 데 시간이 필요하며, 이로 인해 말초 면역 반응이 유발될 수 있으며, 궁극적으로 실험에 변동성이 발생할 수 있습니다. 염증, 감염, 수술 후 통증 및 불편함의 위험을 최소화하려면 에리스로마이신과 디클로페낙 나트륨의 조합이 함유된 국소 연고를 상처에 바르는 것이 좋습니다. 이 접근법은 동물의 수술 절차와 관련된 염증 및 통증을 줄이는 데 효과적인 것으로 나타났습니다.

얇은 두개골 기반 유체 타악기 프로토콜은 수막을 FPI에 노출시킴으로써 일반적으로 발생하는 염증을 줄이기 때문에 설치류에서 rmTBI를 모델링하는 유망한 방법입니다. 두개골 얇아진 창에 있는 이 기술은 다양한 정도에서 임상적으로 관련된 PCS를 효과적으로 생성할 수 있어 rmTBI를 연구하는 연구자에게 잠재적인 대안을 제공합니다. 더욱이, 얇아진 두개골 창은 in vivo¹⁵에서 Ca²⁺ 항상성 및 신경 세포 과흥분성의 관찰을 용이하게 합니다. 이 기법을 사용하면 단기/중등/장기적으로 PCS 진행의 기본 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있으며, 이를 통해 PCS 진행을 예측하고 보다 효과적인 치료법을 개발할 수 있는 능력을 향상시킬 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
75% 에탄올	산둥 XieKang 의료 기술 유한 회사
부프레노르핀 염산염	톈진 제약 연구소 제약 Co., Ltd	H12020272	솔루션, 진통제
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	분말, 진통제
클로르헥시딘 디글루코네이	트 상하이 Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	19%-21% 수용액, 항균
치과 시멘트 및 솔벤트 키트	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder가 일치하는 용매
해부 현미경	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
에리스로마이신 연고	무한 Mayinglong 제약 그룹 Co., Ltd.	220412	항생제
광섬유 차가운 광원	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
플랫 팁 마이크로 드릴 비트	심천 RWD 생명 과학 Inc.	HM31008	2mm, 강철
FPI 장치 소프트웨어	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR 마우스	진화 실험실 동물 센터	재고#2023091	수컷 마우스 25마리, 25-30g, 8주 된
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
등온 가열 패드	원저우 Repshop 애완 동물 제품 Co., Ltd.
Luer Loc hup			19G 니들 허브를 사용하여 맞춤 제작
마이크로 핸드 헬드 두개골 드릴	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
수정된 FPI 장치	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris 물 미로	심천 RWD 생명 과학 Inc.	63031	마우스 공간 학습 및 기억 능력 평가
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	마우스 기관지 및 불안 평가
안과 윤활제	쑤저우 Tianlong 제약 Co., Ltd.
나트륨 디클로페낙 연고	무한 Mayinglong 제약 그룹 Co., Ltd.	221207	비스테로이드성 항염증제
소동물 마취 시스템-강화	심천 RWD 생명 과학 Inc.	R530IP
스마트 비디오 추적 시스템	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	동물 추적 및 분석
입지 프레임	심천 RWD 생명 과학 Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	동물 상처
Y 미로	봉합 Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	마우스 공간 작업 기억 평가