당사는 단일핵 차세대 염기서열분석 분석을 지원하기 위해 동결보존, 유도만능줄기세포, 유래 기질/내피세포 및 혈액 세포 유형에서 고품질 핵을 추출하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 고품질의 온전한 핵을 생산하는 것은 멀티오믹스 실험에 필수적이지만 일부 실험실에서는 이 분야의 진입 장벽이 될 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
유도만능줄기세포(iPSC) 기반 모델은 혈액 발달을 이해하는 데 탁월한 플랫폼이며, iPSC 유래 혈액 세포는 임상 시험 시약 및 수혈 가능한 세포 치료제로서 중개적 유용성을 가지고 있습니다. 단핵 RNA 염기서열분석(snRNAseq) 및 Transposase-Accessible Chromatin 염기서열분석(snATACseq)을 포함하되 이에 국한되지 않는 멀티오믹스 분석의 출현과 확장은 세포 발달에 대한 우리의 이해를 혁신할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 여기에는 체외 조혈 모델을 사용하는 발달 생물학이 포함됩니다. 그러나 배양된 세포 또는 일차 세포에서 온전한 핵을 분리하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 다양한 세포 유형은 종종 세포 강성과 함량에 따라 맞춤형 핵 제제를 필요로 합니다. 이러한 기술적 어려움은 데이터 품질을 제한하고 멀티오믹스 연구에 관심이 있는 연구자에게 장벽으로 작용할 수 있습니다. 세포 수집 및/또는 처리의 한계로 인해 표본 동결 보존이 필요한 경우가 많으며, 동결 샘플은 온전한 핵 분리를 위한 추가적인 기술적 문제를 야기할 수 있습니다. 이 원고에서는 단핵 다중오믹스 워크플로우에 사용하기 위해 체외 조혈 발달의 여러 단계에서 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하는 자세한 방법을 제공합니다. 우리는 iPSC 유래 부착성 기질/내피 세포와 비부착성 조혈 전구 세포에서 핵을 분리하는 데 방법을 집중적으로 개발해 왔는데, 이는 이들 세포가 구조적 및 세포 정체성과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문입니다. 설명된 문제 해결 단계는 핵 응집과 파편을 제한하여 다운스트림 분석을 위한 충분한 양과 품질로 핵을 회수할 수 있도록 했습니다. 다른 동결 보존된 세포 유형으로부터 핵을 분리하기 위해 유사한 방법을 적용할 수 있습니다.
서론
조혈은 비교적 잘 특성화된 발달 시스템이지만, 체외에서 혈액 세포 형성을 재현할 수 없다는 것은 관련 요인에 대한 이해가 불완전하다는 것을 보여줍니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기반 조혈 모델은 주요 발달 요인 및 관련 생물학을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 시스템은 또한 혈액 질환을 연구하기 위한 우수한 모델을 제공하며, iPSC 기반 혈액 세포는 번역 및 치료 관련 시약을 생산하기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4. 단세포 연구는 조혈 과정에서 생성되는 세포 유형을 포함하여 iPSC 기반 발달 생물학을 조사하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다5. 세포 하위집단 간의 관계를 추론할 수 없는 벌크 RNA 염기서열분석6과 비교하여, 단일세포 양식은 세포 이질성을 평가할 수 있게 하고 세포 발달의 식별 및 특성화를 용이하게 할 수 있습니다 6,7.
iPSC에서 조혈 세포를 형성하려면 혈모성 내피 세포를 형성하기 위해 원시 줄무늬, 중배엽 및 내피 상태를 통한 순차적 분화가 필요합니다. 혈인성 내피세포는 조혈모세포와 전구세포의 직접적인 전구세포이다8. 이러한 세포 유형은 형태학적 특성과 세포 특성이 현저하게 다릅니다. 체외 유래 조혈 세포 모델의 후성유전학적 환경과 발달 역학에 대한 이해는 제한적이지만, 이는 iPSC 시스템의 완전한 치료 잠재력을 발휘하기 위한 필수 지식입니다. 대부분의 경우, 단일 세포 분석 양식만이 세포 집단, 전사 활성, 염색질 환경 및 이질적인 세포 제제 간의 발달을 제어하는 조절 메커니즘을 식별할 수 있습니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNAseq)과 단일 핵 RNA 염기서열 분석(snRNAseq)의 두 가지 방법론은 개별세포 수준9에서 전사 통찰력을 제공할 수 있습니다. 데이터 유효성과 신뢰성을 결정하는 주요 요인은 엄격한 품질 기준을 충족하는 샘플에 대한 타협하지 않는 요구입니다. 여기에는 셀/핵 밀도, 최적의 생존력 및 최소 응집에 대한 정확한 요구 사항이 포함됩니다. 단일 핵의 준비는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이전에 동결 보존된 세포의 사용과 관련된 추가적인 문제가 있을 수 있습니다.
표준 scRNAseq 접근법에 대한 4가지 중요한 잠재적 한계에 주목합니다. 첫째, 세포 현탁액을 생성하기 위한 표준 프로토콜은 종종 냉동 보존 후 회수된 것보다 신선한 세포 또는 조직에서 추출한 제제를 참조합니다10. 이로 인해 잠재적으로 가치 있는 자원의 유용성이 줄어들 수 있습니다. 둘째, 다양한 세포 유형의 해리 효율은 가변적입니다. 예를 들어, 많은 면역 세포 유형은 비교적 쉽게 해리를 겪습니다. 대조적으로, 기질 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 일반적으로 세포외 기질과 기저막에 내장되어 있으며, 핵 분리를 복잡하게 만들 수 있는 고유한 세포 특성을 가지고 있습니다11,12. 이러한 특성은 공격적인 해리 프로토콜을 필요로 할 수 있으며, 이는 더 섬세한 세포 집단의 구조적 무결성을 위태롭게 할 수 있습니다. 셋째, 일부 세포(예: 거핵세포)는 직경이 100μm를 초과할 수 있어 기존의 여러 상업용 단세포 플랫폼에 어려움을 초래할 수 있다(13). 또한, 부적절한 취급은 효소 가수분해 및 기계적 해리를 포함하는 세포 분리의 초기 단계에서 세포 손상 및 스트레스 반응을 유발할 수 있으며, 이는 유전자 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있습니다11,14.
이러한 이유와 다른 이유로, 단일핵 접근법은 단일세포 방법(single cell method)에 대한 바람직한 대안이 될 수있다 15. 세포막에 비해 핵막의 우수한 안정성을 감안할 때, 핵 외피는 조직 동결 보존 후에도 온전한 상태로 유지될 수있다 16. 이는 핵 추출을 촉진하고 차세대 염기서열분석 양식에 적합한 시료 유형의 다양성을 향상시킬 수 있습니다. 둘째, 핵은 기계적 섭동에 대한 저항력이 높아지고 해리 동안 전사 이동이 적게 나타나는 경향이 있다14. 따라서 핵은 더 큰 RNA 안정성과 더 재현성 있는 전사 프로필을 제공할 수 있습니다. 단일핵 분석법의 세 번째 주목할 만한 장점은 세포 크기 제약이 없고 심근세포 또는 거핵세포와 같은 더 큰 세포에 적용할 수 있다는 점이다12. 넷째, 핵은 유전자 발현, 접근 가능한 염색질 영역 및 기타 매개변수(17)에 대한 통합 분석을 통해 확장된 통찰력을 제공하는 멀티오믹스 분석에 적합한 기질 역할을 하여 세포 이질성, 발달 및 기능 상태에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다18.
조혈 발달 중 iPSC를 프로파일링함으로써 멀티오믹스 접근법은 정상 또는 병리학적 질환 모델에서 발달 과정을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 유래 세포를 일차 세포 또는 조직과 비교하면 생체 내 생물학에 대한 iPSC 모델 충실도를 평가할 수 있으며, 이를 통해 iPSC 모델을 개선하고 새로운 세포 집단 및 혈액 형성을 유도하는 요인을 발견할 수 있습니다.
많은 그룹이 핵 분리와 그에 따른 차세대 염기서열분석 분석을 성공적으로 수행했지만, 단일 핵 기반 분석을 수행하는 데 관심이 있는 일부 실험실에서는 고품질 핵을 분리하는 것이 여전히 장벽으로 남아 있습니다. 이 원고는 이전에 동결 보존된 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하기 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 부착 기질/내피 세포와 비부착 조혈 전구 세포에 초점을 맞추었는데, 이는 이들 세포가 구조 및 함량과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문에 차세대 염기서열 분석 또는 기타 실험에 적합한 고품질 핵의 회수율을 높이기 위해 맞춤형 수정 및 문제 해결이 필요하기 때문입니다.
프로토콜
1. 세포의 동결 보존
- 90% FBS 및 10% DMSO의 1mL에서 mL당 >1 x 106 개의 분리된 iPSC 유래 세포를 동결합니다. -80°C의 냉동 용기에 극저온을 넣어 동결 속도를 줄이고 생존 가능한 세포 회수를 최적화합니다(재료 표). 상당한 세포 손실이 예상되며, 이는 배양 조건과 세포 정체성에 따라 달라질 수 있습니다.
- -80 °C에서 24시간 이내에 액체 질소 저장으로 이동합니다.
2. 세포의 해동
- 액체 질소 저장고에서 극저온을 회수하고 37°C 수조에서 2분 동안 해동합니다. 작은 얼음 결정이 여전히 보일 때 수조에서 제거하십시오.
- cryovial에서 빈 15mL 튜브로 세포를 옮기고 조심스럽게 혼합하면서 10mL의 사전 예열된 배지(RPMI 1640 + 10% FBS)를 천천히 추가합니다. 400 x g 에서 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 2% FBS 및 1mM CaCl2 (재료 표)가 보충된 DPBS 1mL로 재구성합니다. 1000 μL 마이크로피펫으로 3회 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.
3. 죽은 세포 제거
- 50μL의 데드 셀 제거 칵테일(Table of Materials)을 1mL의 세포 현탁액에 추가합니다. 세포 혼합물에 50μL의 비오틴 선택 칵테일을 추가합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이 단계는 세포 현탁액 내에 포함된 Annexin V+ 죽은 세포를 비오틴으로 라벨링합니다.
- 30초 동안 격렬하게 소용돌이치는 덱스트란 비드는 비오틴으로 표시된 원치 않는 세포 유형의 고갈을 위해 설계되었습니다(재료 표). 세포 현탁액에 100μL의 덱스트란 비드를 추가하고 1000μL 마이크로피펫으로 위아래로 2번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다(재료 표).
- 2% FBS 및 1mM CaCl2 를 함유한 DPBS 1.3mL를 세포 현탁액에 추가하고 1000μL 마이크로피펫으로 2배 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 자석(재료 표)에 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 자석과 튜브를 뒤집어 농축된 라이브 셀 현탁액을 새로운 15mL 코니컬 튜브에 붓습니다. 400 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다. 대부분의 상층액을 제거하고 DPBS + 0.04% BSA 1mL에 재현탁합니다. 1000 μL 마이크로피펫으로 3번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
4. 핵의 분리
- 460 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 활세포 현탁액을 원심분리한 다음 상층액을 흡입하여 세포 펠릿이 파괴되지 않도록 합니다.
- 얼음에 냉각하여 갓 준비한 0.5x 용해 완충액 100μL를 추가하고(표 1) 100μL 마이크로피펫으로 10배 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
- 500μL의 냉각 세척 버퍼(표 2)를 혼합하지 않고 튜브에 추가합니다. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 핵의 세척 및 평가
- 상층액을 흡입하고 500μL의 냉각 세척 완충액을 추가하여 혼합하지 않고 남아 있는 온전한 펠릿을 용해시킵니다. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거합니다.
- 120 μL의 냉각된 희석된 핵 완충액에 재현탁합니다(표 3). 40μm 셀 스트레이너를 사용하여 셀 현탁액을 필터링합니다(재료 표).
- 0.4% 트리판 블루로 염색하고 10x 현미경에서 분리된 핵의 품질을 육안으로 평가합니다(재료 표).
6. 고립된 핵 처리
- 핵을 얼음 위에 유지하십시오. 시간이 지남에 따라 핵 응집이 발생할 수 있고 추가 여과 단계가 필요할 수 있으므로 즉시 추가 처리를 진행하십시오.
결과
우리는 앞서 언급한 프로토콜을 사용하여 냉동 보존된 iPSC 유래 부착 기질/내피 세포 및 비부착(부동) 조혈 전구 세포에서 핵을 추출했습니다. 핵 격리 절차의 자세한 개략도는 그림 1에서 확인할 수 있습니다.
형태학적 검사를 위해 분리된 핵을 트리판 블루로 염색하고 현미경으로 시각화했습니다. 핵 형태학적 검사는 처리 직전에 매우 중요한데, 파편이나 응집된 핵은 정밀 미세유체 기기의 막힘으로 인해 품질 데이터 생성을 감소시키거나 방해할 수 있기 때문입니다. 기존 키트 프로토콜을 사용하여 준비된 샘플에서 분리된 핵을 현미경으로 검사한 결과, 시각화된 필드에 따라 파편과 ≥1 핵 응집체가 존재하는 것으로 나타났습니다(그림 2A-B). 이 샘플은 품질이 떨어져서 폐기되었습니다.
고품질 핵은 둥글고 온전하며, 분석법 최적화 후 관찰된 것과 같은 덩어리가 거의 없거나 전혀 없습니다(그림 2C-D). 우리는 이 샘플에서 응집체나 뭉침을 관찰하지 못했습니다. 이러한 핵은 다운스트림 처리 및 분석을 지원하기에 충분한 품질과 수량을 가지고 있었습니다. 유사한 문제 해결 및 프로토콜 최적화는 잠재적으로 다른 동결 보존된 세포 유형으로 확장될 수 있습니다.
그림 1: 동결 보존된 세포에서 핵 추출을 보여주는 다이어그램. 동결 보존된 세포에서 핵 분리와 관련된 단계를 자세히 설명하는 시각적 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 냉동 보존된 인간 iPSC 유래 세포에서 분리한 핵. 트리판 블루로 염색된 부착 기질/내피 세포에서 분리된 핵은 다운스트림 분석을 방해하는 중요한 파편 (A) 작은 입자 및 (B) 핵 응집체(큰 입자)를 보여줍니다. 여기에 제시된 기술적 수정을 수행한 후, (C) 동결 보존된 인간 iPSC 유래 조혈 전구 세포 또는 (D) 기질/내피 세포 집단에서 다운스트림 분석을 지원하기에 충분한 양으로 고품질 핵을 분리했습니다. 참고로, 이러한 비부착성 조혈전구세포는 4에 기술된 바와 같이 조혈분화 9+8일째에 수집하였고, 부착성 기질/내피세포는9+7일에 수집하였다. 핵 형태는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 완충액 준비 | |||
| 0.5X 용해 완충액 | 주식 | 결승전 | 2mL |
| 1X 용해 완충액 | 1배 | 0.5배 | 1mL |
| Lysis Dilution Buffer | 1mL | ||
| 용해 버퍼 | 주식 | 결승전 | 2mL |
| 증권 시세 표시기 | 10% | 1% | 200 마이크로리터 |
| 디지토닌 | 5% | 0.01% | 4 μL |
| 디에이티(DTT) | 1000 밀리미터 | 1 m엠 | 2 μL |
| 마그네슘Cl2 | 1개 M | 3의 mM | 6 μl의 |
| NaCl (염화나트륨) | 5개 M | 10 밀리미터 | 4 μL |
| 노니뎃 P40 대용품 | 10% | 0.10% | 20 μL |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 1.67 mL | ||
| RNase 억제제 | 40 U/μl | 1U/μl | 50 마이크로리터 |
| 트리스 -HCl (pH7.4) | 1개 M | 10 밀리미터 | 20 μL |
| Tween-20 (트윈-20) | 10% | 0.10% | 20 μL |
| Lysis Dilution Buffer | 주식 | 결승전 | 2 밀리리터 |
| 증권 시세 표시기 | 10% | 1% | 200 마이크로리터 |
| 디에이티(DTT) | 1000 밀리미터 | 1 m엠 | 2 μL |
| 마그네슘Cl2 | 1개 M | 3의 mM | 6 마이크로리터 |
| NaCl (염화나트륨) | 5개 M | 10 밀리미터 | 4 μL |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 1.72 mL | ||
| RNase 억제제 | 40 U/μl | 1U/μl | 50 마이크로리터 |
| 트리스 -HCl (pH7.4) | 1개 M | 10 밀리미터 | 20 마이크로리터 |
표 1: 0.5x Lysis 버퍼 준비. 이 용액은 4.2단계의 핵 분리 절차를 위해 지정됩니다. 용해 완충액과 용해 희석 완충액을 혼합하여 0.5x 용해 완충액을 제조합니다. 각 실험 직전에 새로운 완충액을 준비하고 얼음을 유지하는 것이 중요합니다. 일부 세포 유형에 대한 문제 해결에는 온전한 핵 분리를 용이하게 하기 위해 용해 완충액의 1배, 0.5배 또는 더 낮은 희석이 포함될 수 있습니다.
| 완충액 준비 | |||
| 세척 버퍼 | 주식 | 결승전 | 4mL |
| 증권 시세 표시기 | 10% | 1% | 400 μL |
| 디에이티(DTT) | 1000 밀리미터 | 1 m엠 | 4 μL |
| 마그네슘Cl2 | 1개 M | 3의 mM | 12 μL |
| NaCl (염화나트륨) | 5개 M | 10 밀리미터 | 8 μL |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 3.40 mL | ||
| RNase 억제제 | 40 U/μl | 1U/μl | 100 μL |
| 트리스 -HCl (pH7.4) | 1개 M | 10 밀리미터 | 40 마이크로리터 |
| Tween-20 (트윈-20) | 10% | 0.10% | 40 마이크로리터 |
표 2: 세척 완충액의 준비. 이 용액은 핵 분리 중에 활용됩니다. 이것은 각 실험 전에 신선하게 준비하고 얼음 위에 보관해야 합니다.
| 완충액 준비 | |||
| 희석된 핵 완충액 | 주식 | 결승전 | 1mL |
| 디에이티(DTT) | 1000 밀리미터 | 1 m엠 | 1 μL |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 924 마이크로리터 | ||
| 핵 완충액 | 20배 | 1배 | 50 μL |
| RNase 억제제 | 40 유/μL | 1 유/μL | 25 마이크로리터 |
표 3: 희석된 핵 완충액의 제조. 이 솔루션은 5.2단계에서 사용됩니다. 각 실험 전에 신선하게 준비하고 얼음 위에 보관해야 합니다.
토론
프로토콜 내의 중요한 단계
고품질 핵을 분리하는 것은 빠르게 발전하고 있는 현재의 단일 핵 기반 차세대 염기서열분석 기법을 성공적으로 구현하는 데 필수적입니다. 이러한 접근 방식, 특히 동결 보존된 표본에 관심이 있는 실험실에 대한 기존 장벽을 인식하여 우리의 의도는 이전에 동결된 세포에 적합한 핵 분리 기술을 만드는 것이었습니다. 냉동 보존된 검체에서 핵을 분리하는 것은 임상 샘플 및 희귀 iPSC 유래 세포 집단에 필요한 경우가 많습니다.
특정 세포 집단에 맞게 lysis buffer dilution, lysis time 및 filtration frequency를 조정하는 것이 중요합니다. 우리는 냉동 보존된 인간 iPSC 유래 조혈 전구 세포와 같은 특히 민감한 세포 유형이 1x lysis buffer를 사용하여 1분 이내에 과용해되는 것을 관찰했습니다. 이러한 과잉 용해는 단순한 기술적 또는 운영상의 오작동이 아닙니다. 오히려, 과용해(over-lysis)와 응집(clumping)은 접착성 핵 물질의 누출을 나타낼 수 있습니다. 견고한 세포골격 구조를 가진 부착성 기질 및 내피 세포와 강력한 세포 간 접착을 형성하는 경향이 있는 막의 경우, 응집된 핵을 제거하기 위해 이중 여과가 필요했습니다. 핵 응집체는 미세유체 채널을 방해하여 실험 무결성에 실질적인 위험을 초래하고 잠재적으로 데이터 출력을 방해할 수 있습니다.
또한 죽은 세포 제거 단계를 통합하면 온전한 핵의 회수율이 크게 증가하면서 응집과 파편이 제한된다는 사실도 발견했습니다. 실험 시작 시 트리판 블루 염색을 기반으로 >70%의 생존 가능한 세포가 포함된 샘플을 처리해야 했습니다. 모든 완충액을 얼음 위에 두는 것도 생존력을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
기술의 한계
설명된 방법은 배양된 iPSC-유래 세포 유형4로부터 핵 회수를 최적화하도록 설계되었습니다. 유사한 문제 해결 절차가 iPSC 유도 세포를 넘어 다른 동결 보존 세포 유형을 포함하도록 확장될 수 있지만, 테스트 없이 개별 샘플 또는 세포 유형에 대한 특정 요구 사항을 예측하는 것은 다소 어렵습니다. 시료 또는 세포 유형에 관계없이 생존 가능한 전체 세포가 <5% 남아 있는 핵 제제를 목표로 하고, 응집을 최소화하고, 과도하게 용해된 핵을 줄이는 것은 실험 성공과 직접적인 관련이 있어야 합니다.
기존 방법에 대한 중요성
번역 관련 iPSC 기반 분화 시스템은 다양한 세포 유형과 전구 세포를 생산할 수 있습니다. 이 프로토콜은 핵 분리를 최적화하기 위해 서로 다른 방법론적 요구 사항을 가진 예시적인 세포 유형으로서 iPSC 유래 부착 기질/내피 세포 및 비부착 조혈 전구 세포에 초점을 맞춥니다. 우리는 이 프로토콜이 단백질 함량, 막 구조 및 세포 강성에 따라 분리 방법을 미세 조정해야 한다는 것을 인식하여 중추적인 발달 단계를 조사하기 위해 다른 iPSC 유래 세포 유형에 적용 및 적용될 수 있을 것으로 기대합니다. 그러나 여기에 설명된 방법론은 광범위한 동결 보존 세포 유형에서 고품질 핵을 회수할 수 있도록 할 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 지도와 제안을 해준 Jason Hatakeyama(10x Genomics)와 Diana Slater(Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, HL156052에서 CST)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 시약 | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | /A | 이 연구에서 사용된 iPSCs는 CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents를 통해 얻어졌습니다. | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| strong>Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | 이 키트는 비오틴으로 표지된 원치 않는 세포 유형을 고갈시키기 위해 설계되었습니다. 이 키트에는 사체 제거(Annexin V) 칵테일, 비오틴 선택 칵테일 및 덱스트런 비드가 포함되어 있습니다. 이 키트는 Annexin V를 사용하여 세포사멸 세포의 세포막 외부 첨판에 있는 포스파티딜세린을 표적으로 합니다. 원치 않는 세포는 Annexin V, Biotinylated 항체 및 자성 입자로 라벨링되고 EasySep 자석을 사용하여 컬럼 없이 분리됩니다. 원하는 세포를 새 튜브에 붓기만 하면 됩니다. |
| Materials | |||
| 10 µ l 마이크로피펫 | 병동 과학 | 470231606 | |
| 100 µ l 마이크로피펫 | 병동 과학 | 470231598 | |
| 1000 µ l 확장 범용 팁 | 옥스포드 랩 제품 | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µ l Micropipette | 병동 과학 | 470231602 | |
| 2.0 ml 극저온 바이알 | Corning | 431386 | |
| 20 µ l Micropipette | 병동 과학 | 470231608 | |
| 200 µ l Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µ l 피펫 팁 스테이션 | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l 피펫 팁 스테이션 | 코닝 | 4144 | |
| 카운팅 챔버 | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ 엠 | Bel-Art | H136800040 | |
| 자석 | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C 동결 용기 | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei 분리 시약 | Nuclei 분리 시약은 Lysis Buffer, 세척 완충액, 묽게 된 핵 완충액 및 용해 희석 완충액. 이러한 버퍼의 구성은 표 1, 2 및 3에 나와 있습니다. 당사의 핵 분리 방법은 표준 키트 프로토콜(예: 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide[CG000338])과의 분리를 개선했습니다. 이 프로토콜은 Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns(PN-1000283)를 포함한 여러 상용 키트와 함께 사용할 수 있습니다. | ||
| 사체 제거 키트 | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS 소 혈청 알부민(BSA) 스톡 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| 염화마그네슘 솔루션, 1 m | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 대체 | Sigma | 74385 | |
| 뉴클레아제 무함유 Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| 핵 완충액(20X) | 10X 유전체학 | 2000153 | |
| 프로텍터 RNase 억제제 | Sigma | 3335399001 | |
| 염화나트륨(NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| 염화나트륨 용액, 5m | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 기타 장비 | |||
| 자동 세포 계수기 | CytoSMART | 699910591 | |
| 현미경 | Zeiss | Primostar 3 |
참고문헌
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