당사는 단일핵 차세대 염기서열분석 분석을 지원하기 위해 동결보존, 유도만능줄기세포, 유래 기질/내피세포 및 혈액 세포 유형에서 고품질 핵을 추출하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 고품질의 온전한 핵을 생산하는 것은 멀티오믹스 실험에 필수적이지만 일부 실험실에서는 이 분야의 진입 장벽이 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유도만능줄기세포(iPSC) 기반 모델은 혈액 발달을 이해하는 데 탁월한 플랫폼이며, iPSC 유래 혈액 세포는 임상 시험 시약 및 수혈 가능한 세포 치료제로서 중개적 유용성을 가지고 있습니다. 단핵 RNA 염기서열분석(snRNAseq) 및 Transposase-Accessible Chromatin 염기서열분석(snATACseq)을 포함하되 이에 국한되지 않는 멀티오믹스 분석의 출현과 확장은 세포 발달에 대한 우리의 이해를 혁신할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 여기에는 체외 조혈 모델을 사용하는 발달 생물학이 포함됩니다. 그러나 배양된 세포 또는 일차 세포에서 온전한 핵을 분리하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 다양한 세포 유형은 종종 세포 강성과 함량에 따라 맞춤형 핵 제제를 필요로 합니다. 이러한 기술적 어려움은 데이터 품질을 제한하고 멀티오믹스 연구에 관심이 있는 연구자에게 장벽으로 작용할 수 있습니다. 세포 수집 및/또는 처리의 한계로 인해 표본 동결 보존이 필요한 경우가 많으며, 동결 샘플은 온전한 핵 분리를 위한 추가적인 기술적 문제를 야기할 수 있습니다. 이 원고에서는 단핵 다중오믹스 워크플로우에 사용하기 위해 체외 조혈 발달의 여러 단계에서 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하는 자세한 방법을 제공합니다. 우리는 iPSC 유래 부착성 기질/내피 세포와 비부착성 조혈 전구 세포에서 핵을 분리하는 데 방법을 집중적으로 개발해 왔는데, 이는 이들 세포가 구조적 및 세포 정체성과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문입니다. 설명된 문제 해결 단계는 핵 응집과 파편을 제한하여 다운스트림 분석을 위한 충분한 양과 품질로 핵을 회수할 수 있도록 했습니다. 다른 동결 보존된 세포 유형으로부터 핵을 분리하기 위해 유사한 방법을 적용할 수 있습니다.
서론
조혈은 비교적 잘 특성화된 발달 시스템이지만, 체외에서 혈액 세포 형성을 재현할 수 없다는 것은 관련 요인에 대한 이해가 불완전하다는 것을 보여줍니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기반 조혈 모델은 주요 발달 요인 및 관련 생물학을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 시스템은 또한 혈액 질환을 연구하기 위한 우수한 모델을 제공하며, iPSC 기반 혈액 세포는 번역 및 치료 관련 시약을 생산하기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4. 단세포 연구는 조혈 과정에서 생성되는 세포 유형을 포함하여 iPSC 기반 발달 생물학을 조사하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다5. 세포 하위집단 간의 관계를 추론할 수 없는 벌크 RNA 염기서열분석6과 비교하여, 단일세포 양식은 세포 이질성을 평가할 수 있게 하고 세포 발달의 식별 및 특성화를 용이하게 할 수 있습니다 6,7.....
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프로토콜
1. 세포의 동결 보존
- 90% FBS 및 10% DMSO의 1mL에서 mL당 >1 x 106 개의 분리된 iPSC 유래 세포를 동결합니다. -80°C의 냉동 용기에 극저온을 넣어 동결 속도를 줄이고 생존 가능한 세포 회수를 최적화합니다(재료 표). 상당한 세포 손실이 예상되며, 이는 배양 조건과 세포 정체성에 따라 달라질 수 있습니다.
- -80 °C에서 24시간 이내에 액체 질소 저장으로 이동합니다.
2. 세포의 해동
- 액체 질소 저장고에서 극저온을 회수하고 37°C 수조에서 2분 동안 해동합니다. 작은 얼음 결정이 여전히 보일 때 수조에서 제거하십시오.
- cryovial에서 빈 15mL 튜브로 세포를 옮기고 조심스럽게 혼합하면서 10mL의 사전 예열된 배지(RPMI 1640 + 10% FBS)를 천천히 추가합니다. 400 x g 에서 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 2% FBS 및 1mM CaCl2 (재료 표)가 보충된 DPBS 1mL로 재구성합니....
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결과
우리는 앞서 언급한 프로토콜을 사용하여 냉동 보존된 iPSC 유래 부착 기질/내피 세포 및 비부착(부동) 조혈 전구 세포에서 핵을 추출했습니다. 핵 격리 절차의 자세한 개략도는 그림 1에서 확인할 수 있습니다.
형태학적 검사를 위해 분리된 핵을 트리판 블루로 염색하고 현미경으로 시각화했습니다. 핵 형태학적 검사는 처리 직전에 매우 중요한데, 파편이나 응집된 핵은 정밀 미세유체 기기의 막힘으로 인해 품질 데이터 생성을 감소시키거나 방해할 수 있기 때문입니다. 기존 키트 프로토콜을 사용하여 준비된 샘플에서 분리된 핵을 현미경으로 검사한 결과, 시각화된 필드에 따라 파편과 ≥1 핵 응집체가 존재하는 것으로 나타났습니다(그림 2A-B). 이 샘플은 품질이 떨어져서 폐기되었습니다.
고품질 핵은 둥글고 온.......
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토론
프로토콜 내의 중요한 단계
고품질 핵을 분리하는 것은 빠르게 발전하고 있는 현재의 단일 핵 기반 차세대 염기서열분석 기법을 성공적으로 구현하는 데 필수적입니다. 이러한 접근 방식, 특히 동결 보존된 표본에 관심이 있는 실험실에 대한 기존 장벽을 인식하여 우리의 의도는 이전에 동결된 세포에 적합한 핵 분리 기술을 만드는 것이었습니다. 냉동 보존된 검체에서 핵을 분리하는 것은 임상 샘플 및 희귀 iPSC 유래 세포 집단에 필요한 경우가 많습니다.
특정 세포 집단에 맞게 lysis buffer dilution, lysis time 및 filtration frequency를 조정하는 것이 중요합니다. 우리는 냉동 보존된 인간 iPSC 유래 조혈 전구 세포와 같은 특히 민감한 세포 유형이 1x lysis buffer를 사용하여 1분 이내에 과용해되는 것을 관찰했습니다. 이러한 과잉 용해는 단순한 기술적 또는 운영상의 오작동이 아닙니다. 오히려, 과용해(.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 지도와 제안을 해준 Jason Hatakeyama(10x Genomics)와 Diana Slater(Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, HL156052에서 CST)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 시약 | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | /A | 이 연구에서 사용된 iPSCs는 CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents를 통해 얻어졌습니다. | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| strong>Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | 이 키트는 비오틴으로 표지된 원치 않는 세포 유형을 고갈시키기 위해 설계되었습니다. 이 키트에는 사체 제거(Annexin V) 칵테일, 비오틴 선택 칵테일 및 덱스트런 비드가 포함되어 있습니다. 이 키트는 Annexin V를 사용하여 세포사멸 세포의 세포막 외부 첨판에 있는 포스파티딜세린을 표적으로 합니다. 원치 않는 세포는 Annexin V, Biotinylated 항체 및 자성 입자로 라벨링되고 EasySep 자석을 사용하여 컬럼 없이 분리됩니다. 원하는 세포를 새 튜브에 붓기만 하면 됩니다. |
| Materials | |||
| 10 µ l 마이크로피펫 | 병동 과학 | 470231606 | |
| 100 µ l 마이크로피펫 | 병동 과학 | 470231598 | |
| 1000 µ l 확장 범용 팁 | 옥스포드 랩 제품 | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µ l Micropipette | 병동 과학 | 470231602 | |
| 2.0 ml 극저온 바이알 | Corning | 431386 | |
| 20 µ l Micropipette | 병동 과학 | 470231608 | |
| 200 µ l Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µ l 피펫 팁 스테이션 | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l 피펫 팁 스테이션 | 코닝 | 4144 | |
| 카운팅 챔버 | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ 엠 | Bel-Art | H136800040 | |
| 자석 | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C 동결 용기 | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei 분리 시약 | Nuclei 분리 시약은 Lysis Buffer, 세척 완충액, 묽게 된 핵 완충액 및 용해 희석 완충액. 이러한 버퍼의 구성은 표 1, 2 및 3에 나와 있습니다. 당사의 핵 분리 방법은 표준 키트 프로토콜(예: 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide[CG000338])과의 분리를 개선했습니다. 이 프로토콜은 Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns(PN-1000283)를 포함한 여러 상용 키트와 함께 사용할 수 있습니다. | ||
| 사체 제거 키트 | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
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| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS 소 혈청 알부민(BSA) 스톡 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| 염화마그네슘 솔루션, 1 m | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 대체 | Sigma | 74385 | |
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| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 기타 장비 | |||
| 자동 세포 계수기 | CytoSMART | 699910591 | |
| 현미경 | Zeiss | Primostar 3 |
참고문헌
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.....
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재인쇄 및 허가
