방법 논문

Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis를 통한 Sipunculus nudus 의 활성 Fibrinogenolytic Agents의 신속한 분리 및 표시

DOI:

10.3791/66536

⸱

2024년 4월 19일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 Sipunculus nudus의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하기 위한 피브리노겐-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 프로토콜을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

피브리노겐을 직접 용해시킬 수 있는 섬유소 용해제는 항응고 치료에 널리 사용되고 있습니다. 일반적으로 새로운 섬유소 용해제를 식별하려면 먼저 각 구성 요소를 분리한 다음 이들의 섬유소 용해 활성을 확인해야 합니다. 현재 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 크로마토그래피는 주로 분리 단계에서 사용됩니다. 한편, 피브리노겐 플레이트 분석 및 반응 생성물 기반 PAGE는 일반적으로 섬유소 용해 활성을 표시하기 위해 채택됩니다. 그러나 이 두 단계의 시공간 분리로 인해 동일한 겔로 활성 섬유소 용해제를 분리하여 표시하는 것은 불가능합니다. 본 연구에서는 섬유소 용해제 식별의 분리 및 표시 과정을 단순화하기 위해 땅콩 벌레(Sipunculus nudus)의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하는 새로운 fibrinogen-PAGE 방법을 구축했습니다. 이 방법에는 fibrinogen-PAGE 준비, 전기 영동, renaturation, incubation, staining 및 decolorization이 포함됩니다. 단백질의 섬유소 용해 활성과 분자량을 동시에 검출할 수 있습니다. 이 방법에 따르면 6시간 이내에 땅콩 웜호질제네이트의 활성 섬유소 용해제를 두 개 이상 성공적으로 검출했습니다. 또한 이 fibrinogen-PAGE 분석법은 시간과 비용이 절약됩니다. 또한, 이 방법은 다른 유기체의 섬유소 용해제를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

서론

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최근 몇 년 동안 혈전성 질환의 지속적인 증가로 인해 혈전성 질환은 새로운 주요 글로벌 건강 문제가 되었습니다1. 현재 항혈전제는 항혈소판응집제, 항응고제, 혈전용해제의 세 그룹으로 분류됩니다. 그 중에서도 urokinase(영국), tissue plasminogen activator(tPA) 등과 같은 혈전용해제는 혈전 2를 가수분해할 수 있는 유일한 임상용 약물입니다. 한편, 새로운 혈전용해제의 확인에 의해 보다 안전하고 효과적인 혈전용해제가 개발되고있다 3.

그러나 새로운 혈전용해제를 식별하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며, 주로 분리/정제 및 특성화/확인 단계가 포함됩니다. 전자는 각 구성 요소를 분리하는 것이고 후자는 피브리노(유전자) 용해 활성을 표시하는 것입니다 4,5. 이전 연구에서 친화성 크로마토그래피 및 피브린(ogen) 플레이트 분석 6,7,8을 통해 땅콩 벌레(Sipunculus nudus)에서 새로운 피브리노(유전자) 용해 효소(sFE)를 성공적으로 분리했음에도 불구하고 이러한 과정은 시간과 노동력이 많이 소요됩니다. 먼저, 땅콩벌레 균질액이 피브린(오겐) 플레이트 방법 및 반응 생성물에 의해 피브리노(유전)용해 활성을 가지고 있는지 여부를 PAGE9에 기반하여 확인할 필요가 있습니다. 그런 다음, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 기타 방법과 같은 일련의 크로마토그래피를 분리 및 정제를 위해 수행해야 합니다(10,11). 그 후, 분리된 각 성분의 섬유소 용해 활성을 확인하기 위해 fibrin plate assay를 다시 수행합니다. 마지막으로, native-PAGE 및 sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE를 수행하여 활성 섬유소 용해제(12)의 분자량을 측정한다. 따라서 활성 섬유소 유전 용해제를 신속하게 분리하여 표시하는 것이 중요합니다.

땅콩 웜 균질액에서 활성 섬유소 용해제를 빠르게 분리하고 표시하기 위해 PAGE와 피브리노겐 플레이트 방법을 결합하여 새로운 피브리노겐-PAGE 방법을 개발했으며, 즉, 섬유소 용해제 피브리노겐의 기질을 native-PAGE 겔에 첨가했습니다. native-PAGE 후, 성분을 분자량에 따라 분리하였다. 한편, 각 활성 섬유소 용해 성분은 염색에 의해 표시될 수 있습니다. 이 방법을 통해 6시간 이내에 땅콩 웜 균질액의 활성 섬유소 용해제를 두 개 이상 성공적으로 검출했습니다. 또한 이 fibrinogen-PAGE 분석법은 시간과 비용이 절약됩니다. 또한, 이 방법은 다른 유기체의 섬유소 용해제를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

프로토콜

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1. 땅콩 벌레 균질화 제조

  1. 땅콩 벌레 50g과 식염수 150mL를 균질기에 넣습니다.
  2. 24000rpm에서 60초 동안 균질화합니다.
    알림: 3회 반복합니다.
  3. 9710 x g 에서 균질액을 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  4. 추가 연구를 위해 상층액을 땅콩 벌레 균질액으로 수집합니다.

2. Fibrinogen-PAGE 겔 준비

  1. 50mL 유리 비커에 0.01g의 피브리노겐을 무게를 잰다.
  2. 1.9mL의 DDH2O, 1.3mL의 Tris-HCl(1.5M, pH 8.8) 및 0.05mL의 SDS(10%, w/v)를 비커에 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞는다.
  3. 비커를 37°C에서 30분 동안 놓습니다.
    참고: 이 단계는 피브리노겐을 용해시키는 것입니다.
  4. 아크릴아마이드 1.7mL(30%, w/v), 과황산암모늄(APS; 10%, w/v) 0.05mL, TEMED 0.002mL를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞는다.
    알림: 이것은 분리 젤입니다.
  5. 분리 젤을 10웰 겔 몰드에 붓습니다.
  6. 2mL의 DDH2O를 겔 몰드에 첨가하십시오. 30분 동안 기다립니다.
  7. 금형을 거꾸로 뒤집어 물을 완전히 제거하십시오.
  8. DDH2O1.4mL, Tris-HCl 0.25mL(1.0M, pH 6.8), SDS 0.02mL(10%, w/v), 아크릴아미드 0.33mL(30%, w/v), APS 0.02mL(10%, w/v), 0.002mL의 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 비커에 넣습니다. 피펫팅으로 잘 섞는다.
    참고: 이것은 로딩 젤입니다.
  9. 로딩 젤을 2.5 단계와 동일한 겔 몰드에 붓습니다. 빗을 즉시 삽입하십시오.
    참고: 여기에 사용된 피브리노겐-PAGE 겔은 분리 겔을 함유하는 피브리노겐(0.2%)과 로딩 겔로 구성되었습니다. 피브리노겐의 농도는 필요에 따라 조정할 수 있습니다.

3. 전기영동

  1. 준비된 fibrinogen-PAGE 겔을 접착제 몰드와 함께 전기영동 탱크에 넣습니다. 전기 영동 용액 1300 mL (트리스 1.963 g, 글리신 12.22 g, SDS 0.65 g, DDH2O 1300 mL)를 탱크에 붓는다. 빗을 꺼냅니다.
  2. 20 μL의 sFE 및 20 μL의 땅콩 웜 균질액에 5 μL의 5x 비변성 로딩 버퍼를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞는다. 준비된 fibrinogen-PAGE 겔에 넣으십시오.
    알림: 혼합물을 끓이지 마십시오. sFE는 기존에 6,7,8에서 확인된 피브리노(geno)용해 효소로 본 연구에서 양성 대조군으로 사용되었다. 땅콩 벌레 균질액은 검출할 샘플입니다. 브로모페놀 블루, β-메르캅토에탄올 및 SDS가 없는 비변성 로딩 버퍼와 SDS-PAGE 로딩 버퍼와 비교. 각 샘플 레인은 단백질의 이동을 명확하게 감지하기 위해 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼로 분리되어 있습니다.
  3. 80V에서 30분 동안 또는 120V에서 20분 동안 전기영동을 수행합니다.
  4. 접착제 몰드에서 fibrinogen-PAGE 겔을 제거합니다.

4. 재형성

  1. fibrinogen-PAGE 겔을 플라스틱 상자에 옮깁니다.
  2. Tris-HCl 100mL(0.05M, pH 7.4)와 Triton X-100 2mL를 상자에 넣습니다. 60-70rpm의 셰이커에 10분 동안 올려 놓습니다.
  3. 피펫팅으로 세척 버퍼를 제거합니다.
    참고: 세 번 반복합니다.

5. 인큐베이션

  1. 플라스틱 상자에 Tris-HCl 50mL(0.05M, pH 7.4)를 추가합니다.
  2. 37 °C에서 4 시간 동안 배양합니다.
    참고: 배양 시간은 섬유소 용해 활성의 강도에 따라 조정할 수 있습니다.

6. 염색

  1. 피펫팅으로 배양 완충액을 제거합니다.
  2. Coomassie Brillant Blue Staining 용액 50mL를 상자에 넣고 60-70rpm의 Shaker에 30분 동안 올려 놓습니다.

7. 탈색

  1. 피펫팅으로 염색액을 제거합니다.
  2. DDH2O 50mL를 상자에 넣습니다.
  3. 60-70rpm의 셰이커에 상자를 30분 동안 놓습니다.
    참고: DD H2O는 여기에서 탈색 용액으로 사용되었습니다. 쉐이킹 시간은 섬유소 용해 활성의 강도에 따라 조정할 수 있습니다.

결과

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전기영동 후 마커의 모든 밴드가 명확하게 표시되었습니다. 1x SDS-PAGE 로딩 레인은 10kDa 대역(브로모페놀 청색)만 표시했습니다. sFE 및 땅콩 웜 샘플에서는 관찰 가능한 띠가 나타나지 않았습니다(그림 1). 샘플의 밴드는 보이지 않지만 마커와 브로모페놀 블루의 성능은 전기영동이 성공적이었음을 나타내며 샘플은 분자량에 따라 분리되었습니다.

염색으로 인해 겔 전체가 파랗게 변했지만, 탈색으로 인해 섬유소 용해제에 의해 피브리노겐이 분해된 부위가 투명해졌습니다. 마커와 비교하여 sFE는 25kDa에 가까운 활성 섬유소 분해 밴드를 나타냈습니다. 땅콩 웜 균질액은 25kDa, 33kDa, 43kDa 및 70kDa보다 큰 일련의 띠를 표시했습니다(그림 2). 그 결과, sFE는 25kDa 섬유소 용해 성분만 함유하고 있었지만, 땅콩 웜 균질액에는 sFE 성분 및 기타 섬유소 용해제가 함유되어 있는 것으로 나타났습니다. 보충 그림 1 은 마커를 짙은 파란색으로, 타겟 샘플을 밝은 띠로 보여주는 겔 이미지의 예입니다.

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그림 1: 전기영동 후의 겔. M: 마커; 레인 1: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 2: sFE; 레인 3: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 4 : 땅콩 벌레 균질화; 레인 5: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 탈색 후의 겔. M: 마커; 레인 1: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 2: sFE; 레인 3: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 4 : 땅콩 벌레 균질화; 레인 5: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 마커는 짙은 파란색으로, 타겟 샘플은 밝은 띠로 표시된 겔 이미지. M: 마커; 레인 1: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 2: sFE; 레인 3: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼; 레인 4 : 땅콩 벌레 균질화; 레인 5: 1x SDS-PAGE 로딩 버퍼. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE는 우리 팀이 이전에 3,6,8,13에 의해 땅콩 벌레에서 분리 한 새로운 fibrino (geno) 용해 효소입니다. 그러나 sFE의 식별 프로세스는 섬유소 용해 활성 검출, 단백질 구성 요소 분리 및 활성 확인 단계를 포함하여 시간과 노동력이 많이 소요되었습니다. 간단한 방법으로, fibrinogen plate assay는 주로 샘플의 fibrinogenolytic 활성을 확인하기 위해 예비 스크리닝 단계에서 사용됩니다. 그러나 피브리노겐 플레이트 분석 방법은 어떤 성분이 활성 상태인지 분리할 수 없습니다. 따라서 크로마토그래피와 네이티브/SDS-PAGE를 사용하여 활성 검출 후 구성 요소를 분리해야 합니다. 그런 다음 반응 생성물을 SDS-PAGE에 의해 다시 분해하여 기질 피브리노겐의 분해를 확인합니다. 이 연구에서는 기질 피브리노겐을 PAGE 겔에 첨가하여 섬유소 용해제를 검출했습니다. 전기영동, 재생, 배양, 염색 및 탈색 후, 활성 섬유소 용해제의 분자량 및 섬유소 용해 활성을 동일한 겔로 명확하게 표시했습니다. 이 방법을 통해 6시간 이내에 땅콩 웜 균질액에서 하나 이상의 활성 섬유소 용해제를 성공적으로 검출했습니다.

최적의 결과를 얻으려면 fibrinogen-PAGE 겔 준비, 재현 및 배양에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 일반적으로 피브리노겐의 농도가 낮을수록 섬유소 용해 영역이 더 무색이며, 이는 제제의 섬유소 용해 활성을 나타냅니다. 그러나 피브리노겐의 농도가 낮을수록 배경이 무색이 되고 배경과 섬유소 용해 영역을 구별하기가 더 어려워집니다. renaturation 시간은 성분의 fibrinogenolytic 활동에 두드러지게 영향을 미칠 것입니다. 이 시간이 너무 짧아서 PAGE 겔에서 SDS를 씻어낼 수 없는 경우, 성분의 섬유소 용해 활성은 잔류 SDS에 의해 억제됩니다. 마찬가지로, 배양 시간이 너무 짧으면 섬유소 용해 반응이 철저하지 않습니다. 배양 시간이 너무 길면 분자량을 나타내는 데 사용되는 마커가 씻겨 나갑니다. 이 연구에서는 이러한 조건을 최적화했지만 이러한 조건은 땅콩 벌레에서 섬유소 용해제를 분리하여 표시하도록 설정되었습니다. 따라서 이러한 중요한 단계의 개인화된 조건은 특정 섬유소 유전 용해제에 따라 설정되어야 합니다.

이 fibrinogen-PAGE는 피브리노겐 용해 활성을 가진 피브리노겐 용해제를 스크리닝하는 데만 적합하지만 피브리노겐 용해 활성 또는 플라스미노겐 활성화 활성을 가진 제제에는 적합하지 않다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 이러한 활성을 표시하려면 피브리노겐을 피브린 또는 플라스미노겐으로 대체하여 방법을 최적화할 수 있습니다. 주목할 가치가 있는 또 다른 점은 이 연구에서 테스트된 활성 섬유소 용해제가 단량체였으며 SDS 전기영동 조건에서 영향을 받지 않았다는 것입니다. 따라서 테스트된 약제가 폴리머인 경우 이 방법은 분자량을 표시할 수 없는 native-PAGE 조건으로 조정해야 합니다. 따라서 여기서 소개하는 fibrinogen-PAGE 방법은 일반적인 기본 버전일 뿐이며, 다른 섬유소 용해제를 빠르게 스크리닝할 수 있도록 최적화할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 샤먼시 과학기술국(No. 3502Z20227197), 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070; No. 2022J01311), Quanzhou Science and Technology Plan의 고급 인재 혁신 및 기업가 정신 프로젝트(No. 2022C015R). 기술 지원을 제공해 주신 Fucai Wang(Huaqiao University)과 Lei Tong(Huaqiao University)에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드BiosharpBL513B
과황산암모늄XiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
비커PYREX2-9425-02
원심분리기 튜브(1.5mL)BiosharpBS-15-M
항온 인큐베이터JINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue 염색 솔루션BeyotimeP0017F
전자 분석 저울DENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
젤 로딩 피펫 팁, 벌크BiosharpBS-200-GTB
균질화기AHSATS-1500
수평 회전 발진기NuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
피펫 팁(1mL)AxygeneT-1000XT-C
피펫 팁(10 &마이크로; L)AxygeneT-10XT-C
피펫 팁 (200 &마이크로; L)AxygeneT-200XT-C
피펫터(1mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
피펫(10&마이크로; L)Thermo Fisher ScientificZX98775
피펫터(200 &마이크로; L)Thermo Fisher ScientificZY20280
피펫터(50 &마이크로; L)Thermo Fisher ScientificZY15331
냉장 원심분리기cenceH1650R
소듐 도데실 설페이트시그마-알드리치V900859
트리스SolarbioT8060
트리스-HClSolarbioT8230
트리톤 X-100SolarbioT8200

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

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