로즈 벵골 매개 광역학 요법을 통한 칸디다 글라브레이트의 쁘띠 콜로니 유도

요약

Candida spp. 약물 내성에서 몸집이 작은 군집의 중요성은 완전히 탐구되지 않았습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 약물 내성 진균 감염에 대한 유망한 전략을 제공합니다. 이 연구는 로즈 벵골 매개 aPDT가 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 를 효과적으로 비활성화하고 몸집이 작은 콜로니를 유도하여 독특한 절차를 제시한다는 것을 보여줍니다.

초록

칸디다혈증 환자의 사망률이 40%에 달하는 약물 내성 칸디다균과 그들의 작은 돌연변이는 여전히 주요 치료 과제로 남아 있습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 항생제/항진균제와 달리 여러 진균 구조를 표적으로 하여 내성을 억제할 수 있습니다. 몸집이 작은 콜로니를 유도하는 전통적인 방법은 에티듐 브로마이드 또는 플루코나졸에 의존하는데, 이는 약물 감수성과 스트레스 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구는 약물 내성 칸디다 글라브라타 분리물(Candida glabrata isolate)과 싸우기 위해 녹색광(피크 520nm)과 로즈 벵골(RB) 광감작제의 적용을 조사했습니다. 그 결과, aPDT 치료는 세포 성장을 크게 억제하고(≥99.9% 감소) 몸집이 작은 콜로니 형성을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 미토콘드리아 산화 환원 지시자 염색의 크기 감소와 손실로 입증되었습니다. 이 연구는 aPDT가 시험관 내에서 다제내성 C. glabrata 균주에서 몸집이 작은 콜로니를 유도할 수 있다는 초기 증거를 제공하여 내성 진균 감염과 싸우기 위한 잠재적으로 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

서론

진균 감염, 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 점점 더 약물 내성이 강해지는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에 의한 감염은 전 세계적으로 심각한 위협이 되고 있습니다¹. 이러한 감염은 특히 입원 환자와 면역 체계가 약한 환자에게 치명적일 수 있습니다. 항진균제 내성이 증가하면 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 인한 사망률이 높은 중증 진균 감염인 침습성 칸디다증(invasive candidiasis)의 통제를 위협합니다 ². 내성 균주는 효과적인 치료를 방해하여 잠재적으로 복잡성과 사망률을 증가시킬 수 있습니다. 미국 캘리포니아주 알라메다 카운티에서는 C. glabrata가 가장 널리 퍼진 침입종이 되었다³. 칸디다 종의 유병률 및 분포에 대한 이러한 변화는 지역 의료 관행, 환자 인구 통계, 항진균제의 활용 및 칸디다 감염에 대한 위험 요인의 유병률에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

기능적 미토콘드리아가 없는 칸디다의 몸집이 작은 돌연변이는 이 세포소기관이 약물 반응, 독성 및 스트레스 저항....

프로토콜

1. C. glabrata의 배양

참고: 플루코나졸을 포함한 대부분의 항진균제에 내성이 있는 다제내성 C. glabrata (C2-1000907)가 실험에 사용됩니다. 실험 조건은 다른 균주 간에 변동이 존재할 수 있으므로 특정 균주에 맞게 조정해야 할 수 있습니다. 모든 실험은 일관성을 위해 25°C(자연 감염 모방)에서 자란 로그 단계 칸디다를 사용했습니다. C. glabrata의 균사 부족은 37 °C에서 균사를 형성하는 C. albicans에 비해 정량화를 단순화합니다¹⁰.

1. C. glabrata의 로그상 배양을 준비하려면 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 3mL의 멸균 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지가 있는 유리 시험관으로 옮깁니다(재료 표 참조). 25°C에서 14-16시간 동안 진탕하여 배양합니다(155rpm, 45° 각도로 배지로의 공기 투과율을 높임).
2. 배양 후 멸균 기술을 사용하여 신선한 YPD로 배양액을 0.1의 OD₆₀₀으로 희석합니다. 25°C에서 155rpm에서 진탕하여 6....

결과

데이터는 표준 오차가 ± 평균으로 표시되며 각 그룹에서 최소 3배의 독립적인 실험에서 얻어졌습니다. 콜로니 수, OD₆₀₀ 측정 및 TTC 염색 결과를 포함한 실험 데이터는 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 그래프로 작성되고 통계적으로 분석되었습니다( 재료 표 참조). 데이터를 분석하기 위해 일원 분산 분석 또는 t-검정 이 사용되었으며 p-값 <0.05가 유의한 것으로 간주되었습니다. 스캐닝은 1200dpi의 해상도에서 48비트 풀 컬러 광학 스캐너로 수행되었으며 집락 직경의 후속 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

그림 2의 성장 곡선에서 볼 수 있듯이, C. glabrata C2-1000907(T3p)의 몸집이 작은 돌연변이는 치료되지 않은 일반 크기(T0)의 부모 진균에 비해 더 느린 성장을 .......

토론

이 연구는 PDT가 칸디다에서 몸집이 작은 콜로니 형성을 유도하는 첫 번째 보고 방법으로 밝혀졌으며, 이는 에티듐 브로마이드 및 플루코나졸의 확립된 효과를 능가합니다. 이 새로운 관찰은 독성을 감소시킴으로써 곰팡이 박멸과 저항 메커니즘의 출현에 대한 의미를 밝히기 위해 추가 연구를 필요로합니다.

RB 매개 PDT는 C. glabrata의 성장을 효과적으로 억제하여 칸디다 감염에 대한 잠재적인 대체 치료 접근법을 제시합니다. 광 활성화 감작제인 RB는 특정 파장에 노출될 때 일중항 산소와 활성 산소종(ROS)을 생성합니다. 이러한 산화 스트레스는 지질, 단백질 및 핵산과 같은 필수 세포 구성 요소에 손상을 일으켜¹³ 본 연구에서 나타난 바와 같이 미토콘드리아 기능 장애를 유발합니다. 이것은 칸디다균이 표준 항진균제에서 관찰되는 기존 메커니즘을 통해 내성을 개발하는 것을 어렵게 만듭니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 &무; m filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL 마이크로퓨지 튜브	Neptune, San Diego, USA#	3745
20% 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브	Corning, AZ, USA	352059
셀 스트레이너 캡이 있는 5 mL 원형 바닥 튜브	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96웰 플레이트	Alpha plus, Taoyuan Hsien, 대만	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
에티듐 브로마이드 용액	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
플루코나졸, 2 mg/mL	화이자, 뉴욕, 미국	BC18790248
GraphPad	프리즘 GraphPad 소프트웨어	버전 7.0
녹색 발광 다이오드(LED) 스트립	Nanyi electronics Co., Ltd, Tainan, Taiwan	5050	여기파: 500~550 nm
저온.쉐이크 인큐베이터	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
구강 관리 면봉	Good Verita Enterprise, 대만 타이페이	161357
Muller Hinton II 한천	BD biosciences, 캘리포니아, 미국	211438
멀티모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	SpectraMax i3x
OD600 분광 광도계	Biochrom, 영국 런던	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, 미국	330000	재고 농도 40 mg/mL = 4%, PBS에 준비, 4 °에 저장; C
멸균 유리관	Sunmei, 타이난, 대만	AK45048-16100
효모 추출물 펩톤 포도당 매체	HIMEDIA, 인도	M1363