방법 논문

재발-완화 실험적 자가면역 뇌척수염에서 CD4 T 세포의 역할

DOI:

10.3791/66553

⸱

2024년 1월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스의 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델을 사용하여 활성화 단계 및 면역 효과 기능의 관점에서 EAE의 초기 및 재발에서 CD4 T 세포의 역할을 조사했습니다.

초록

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다발성 경화증(MS)은 면역 세포의 침투와 중추신경계(CNS)의 탈수초화를 특징으로 하는 자가면역 질환입니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증 연구를 위한 원형 동물 모델 역할을 합니다. 본 연구에서는 활성화기와 면역반응에 초점을 맞춰 EAE의 시작과 재발에 대한 CD4 T세포의 역할을 조사하는 것을 목표로 하였다. EAE 마우스 모델을 만들기 위해 암컷 마우스는 완전한 Freund's adjuvant(CFA)로 유화된 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55로 면역되었습니다. 임상 점수는 매일 평가되었으며, 그 결과 EAE 그룹의 마우스가 전형적인 재발-완화 패턴을 보였다는 것이 입증되었습니다. 헤마톡실린-에오신(H&E) 및 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색 분석은 중추신경계에서 염증 세포의 상당한 침투와 EAE 마우스의 탈수초화를 밝혀냈습니다. 활성화 단계와 관련하여, CD4+CD69+ effector T (Teff) cell과 CD4+CD44+CD62L- effector memory T (Tem) cell이 EAE의 시작에 기여할 수 있지만, 재발 단계는 CD4+CD44+CD62L-Tem cell에 의해 지배되었을 것으로 추정된다. 또한 면역 기능 측면에서 보조 T(Th)1 세포는 주로 EAE를 시작하는 데 관여합니다. 그러나 Th1 세포와 Th17 세포 모두 재발 단계에 기여하며, EAE 병리학적 과정에서 조절 T(Treg) 세포의 면역억제 기능이 억제되었습니다.

서론

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다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 면역 세포가 침투하고 탈수초화가 발생하는 것이 특징인 자가면역 질환입니다 1,2. 최근 연구에 따르면 소아마비는 젊은이들에게 영향을 미치는 가장 흔한 장애성 질환으로 밝혀졌으며 전 세계적으로 발병률이 지속적으로 증가하고 있습니다3. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 MS4의 염증 단계의 여러 측면을 시뮬레이션하는 다발성 경화증의 원형 동물 모델입니다. 면역 기능의 관점에서 아직 항원을 만나지 않은 초기 CD4 T 세포를 helper T(Th) 0 세포라고 합니다. 이 세포는 다양한 기능을 나타내기 위해 성숙 및 활성화 과정을 거칩니다. CD4 T 세포는 Th1, Th2, 조절 T(Treg), 여포 도우미 T(Tfh), Th17, Th9 및 Th22 세포를 포함하는 특정 기능에 따라 여러 하위 집합으로 분류할 수 있습니다5. Th1 및 Th17 세포 아형이 EAE6의 중요한 발병 인자라는 것은 일반적인 합의입니다. Th1 세포는 인터페론 γ(IFN-γ)을 분비할 수 있고, Th17 세포는 인터루킨(IL)-17 및 기타 염증 인자를 분비하여 미세아교세포 및 성상세포와 같은 다른 면역 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 세포는 IL-18, IL-12, IL-23 및 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인7을 생성하여 Th1/Th17 세포의 면역 반응을 추가로 유도하여 진행성 탈수초 및 축삭 손상을 초래할 수 있습니다. 활성화 단계 관점에서 볼 때, CD4 T 세포는 naive, effector, memory T cell8을 포함하여 별개의 세포 하위 집합과 분화된 상태로 발달할 수 있는 미리 결정된 운명을 가지고 있습니다. 초기 CD4 T 세포는 증식하고 서로 다른 환경에서 다른 기능을 가진 다양한 effector subset으로 분화합니다9. 대부분의 effector cell은 수명이 짧으며, 소수의 T 세포 집단이 동일한 항원을 다시 만날 때 빠른 effector 기능을 나타내는 기억 T 세포로 발전하여 숙주에게 매우 강력하고 장기적인 보호를 제공합니다10,11.

현재의 연구는 CD4 T 세포가 EAE의 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 시사하지만, 활성화 단계와 면역 효과 기능에 따라 분류된 다양한 CD4 T 세포 하위 집합이 EAE의 시작과 재발에 어떻게 기여하는지는 여전히 불분명합니다. 본 연구에서는 C57BL6/J 마우스에서 미엘린 희소돌기아교세포당단백질(MOG)35-55 펩타이드를 면역화하여 EAE 모델을 확립하고, CD4 T 세포의 활성화기 및 면역 기능에 초점을 맞춰 EAE의 시작과 재발을 조사하였다.

프로토콜

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본 연구를 위해 6주에서 8주 사이의 총 18마리의 암컷 C57BL/6J 마우스를 대조군(n=6)과 EAE 그룹(n=12)으로 무작위로 나누었다. 쥐는 Ningxia Medical University의 실험 동물 센터에서 구입했습니다. 생쥐는 12시간의 명암 주기로 온도와 습도가 조절되는 방에 수용되었으며 담수와 음식에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 연구가 시작되기 전에 닝샤 의과대학의 실험동물 윤리위원회(Experimental Animal Ethics Committee)로부터 윤리 승인을 받았다.

1. C57BL/6 마우스의 재발성 송금 EAE 개발

  1. 시약 용해
    1. 5.4mg MOG35-55(재료 표)를 1.8mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 용해시킵니다. 12.6mg의 Mycobacterium tuberculosis H37RA(재료 목록)를 칭량하고 완전한 Freund's adjuvant(CFA) 용액 1.8mL(재료 목록)에 추가합니다. 360μL의 백일해 독소(PTX; 재료 표) 피펫을 사용하여 7.2mL의 PBS에 넣습니다(Table of Materials).
  2. MOG35-55 및 CFA의 에멀젼 제조
    1. 1.1단계에서 준비한 2개의 5 mL 주사기를 사용하여 MOG35-55 용액과 CFA 용액을 피펫으로 분리하고 티 밸브에 연결합니다. 유백색의 유중수 에멀젼이 얻어질 때까지 얼음에서 1시간 동안 계속 혼합합니다.
      참고: 에멀젼은 물에 떨어뜨린 후 분산되지 않고 물 표면에 떠 있을 때 성공적으로 준비됩니다.
  3. 마우스 마취
    1. 마취기 증발기의 앞쪽 끝에 있는 충전 밀봉 캡의 나사를 풉니다. 중앙의 밀봉 나사를 따라 이소플루란 20mL를 천천히 붓고 충전 밀봉 캡을 잠급니다. 마취 기계 증발기의 공기 흐름이 마취 유도 상자(재료 표)와 전달되도록 티 밸브 스위치를 전환하십시오.
    2. 공기 펌프 전원 공급 장치를 연결하고 공기 펌프 스위치를 켠 다음 출력 가스 흐름이 400mL/min이 되도록 산소 유량계 전면에 있는 공기 소스 밸브를 회전 및 조정합니다. 증발기를 열고 유도 농도를 3%로 조정하고 마취제가 유도 상자를 채울 때까지 기다립니다.
    3. 약 1분 후 마우스를 인덕션 박스에 넣고 인덕션 박스를 닫고 마우스가 깊은 수면, 근육 이완 및 안정적인 호흡에 빠질 때까지 기다립니다. 그런 다음, 마우스는 이상적인 마취 상태로 결정될 수 있습니다(Table of Materials).
      알림: 마우스가 완전히 마취될 때까지 마취기 증발기의 공기 흐름이 마취 마스크와 전달되도록 티 밸브 스위치를 전환하십시오.
  4. 마우스 면역
    1. EAE 그룹 마우스에서 겨드랑이와 사타구니 평면12 의 척추 양쪽에서 약 0.5cm, 바늘과 함께 1.2단계에서 준비한 200μL의 에멀젼 200μL를 바늘과 함께 1.2단계에서 제조한 에멀젼 200μL를 피하주사합니다. 각 부위에 50μL의 에멀젼을 사용합니다(재료 표).
  5. PTX 주입
    1. 꼬리를 잡아 케이지에서 쥐를 꺼내 케이지 와이어에 놓습니다. 4번째와 5번째 손가락으로 쥐의 꼬리를 잡고 몸과 팔다리가 앞으로 나아가는 추세를 유지하기 위해 부드럽게 위로 당깁니다. 쥐의 머리를 잡고 중지와 약지를 사용하여 쥐 뒷면의 피부를 잡습니다.
    2. 1.4단계에서 면역 접종 후 0시간 및 48시간에 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 1-2cm의 침투 깊이로 복부 중간선 양쪽을 따라 0.5cm 위치에 PTX 200μL를 복강내로 주입합니다(재료 목록).
      참고: MOG35-55 면역 후 48시간에 PTX를 주입하기 전에 1.3단계에 설명된 절차에 따라 마우스를 마취해야 합니다. 쥐는 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 돌보아야 합니다.
    3. 대조군의 마우스의 경우 동일한 방법으로 식염수로 치료하고 매일 임상 점수를 평가합니다.
      참고: 마우스는 다음 척도13에 따라 EAE의 징후를 평가했습니다: 0 = 질병 증상 없음, 1 = 꼬리의 완전한 마비, 2 = 부분적인 뒷다리 마비/쇠약, 3 = 완전한 뒷다리 마비, 4 = 앞다리 및 뒷다리 마비, 5 = 빈사 상태.

2. 조직학적 염색 분석

  1. 뇌 수집
    1. 1.3 단계에 따라 마우스를 마취합니다. 경추 탈구로 생쥐를 안락사시키고 가슴을 열어 심장을 완전히 드러냅니다. 귓바퀴를 잘라내고 간이 회색과 흰색이 될 때까지 좌심실에 바늘이 달린 20mL 주사기를 사용하여 미리 냉각된 식염수로 천천히 관관합니다.
    2. 꼬리 끝이 위로 올라갈 때까지 4% 파라포름알데히드를 천천히 관류하면 몸이 뻣뻣해지고 간이 단단해집니다. 머리의 목을 베고, 두개골을 자르고, 핀셋을 사용하여 뇌를 채취하고, 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 고정합니다(재료 표).
  2. 파라핀 절편의 준비
    1. 그라디언트 탈수: 2.1단계의 뇌 조직을 70% 에탄올에 1시간 동안 연속적으로 담그고, 80% 에탄올을 1시간 동안 에탄올, 1시간 동안 95% 에탄올, 1시간 동안 무수 에탄올에 연속적으로 담그고, 새로운 무수 에탄올로 교체하고, 1시간 동안 계속 담그십시오(재료 표).
    2. 투명도: 2.2.1단계의 뇌 조직을 자일렌에 30분 동안 담그고 새 자일렌으로 교체한 다음 조직이 투명해질 때까지 계속 담그십시오(재료 표).
    3. 임베딩 : 파라핀에 2.2.2 단계의 뇌 조직을 1 시간 동안 삽입하고, 새로운 파라핀으로 교체하고, 1 시간 동안 매립을 계속하고, 곰팡이 방출 후 6 μm 조각으로 자르고, 슬라이드를 뜨거운 물에 넣고 37 °C에서 건조시키고 실온에서 보관합니다 (재료 표).
    4. 탈왁싱: 2.2.3단계의 뇌 조직을 자일렌에 20분 동안 담그고, 신선한 자일렌으로 교체하고, 20분 동안 계속 담그고, 무수 에탄올에 5분 동안 넣고, 신선한 무수 에탄올로 교체하고, 5분 동안 담그고, 75% 에탄올을 5분 동안 담그고, 수돗물로 헹굽니다(재료 표).
    5. 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색: 2.2.4단계의 조직을 헤마톡실린 용액으로 3-5분 동안 염색한 후 수돗물로 헹굽니다. 조직을 헤마톡실린 분화 용액으로 간단히 처리하고 수돗물로 철저히 헹굽니다. hematoxylin Scott 수돗물 블루잉 용액으로 조직을 처리하고 수돗물로 헹굽니다. 85% 에탄올에 5분, 95% 에탄올에 5분 동안 담그고 에오신 염료로 5분 동안 염색 단계를 수행합니다(재료 표).
    6. 탈수: 2.2.5단계의 조직을 무수 에탄올에 5분 동안 연속적으로 담그고, 신선한 무수 에탄올로 교체하고, 5분 동안 계속 담그고, 신선한 무수 에탄올로 교체하고, 5분 동안 담그고, 크실렌을 5분 동안 담그고, 신선한 자일렌으로 교체하고, 5분 동안 담그고, 중성 검으로 밀봉합니다(재료 표).
    7. 현미경을 사용하여 뇌 조직을 관찰하고 이미지 획득 및 분석을 수행합니다(재료 표).

3. LFB 염색 분석

  1. 미엘린 칼집 수집: 머리 말단에서 꼬리 말단까지 쥐의 척추를 2마디 아래로 자르고, 꼬리 말단까지 척수를 불어내고, 척수를 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 고정합니다.
    참고: 미엘린 수초는 2.1단계에서 동일한 마우스에서 채취했으며, 심장 관류 단계는 2.1과 동일합니다.
  2. 파라핀 절편 탈파라핀 화 및 재수화: 3.1단계의 슬라이드를 20분 동안 크실렌에 연속적으로 넣고 신선한 자일렌으로 교체하고 20분 동안 계속 담그고 5분 동안 무수 에탄올을 계속 담그고 5분 동안 무수 에탄올로 교체하고 5분 동안 75% 알코올을 담그고 수돗물로 씻습니다.
  3. 빠른 파란색 염색: luxol 빠른 파란색 염색 용액 A를 60°C 오븐에 넣고 30분 동안 예열합니다. 용액 A에 3.2단계의 슬라이드를 넣고 조각이 마르지 않도록 1시간 동안 플라스틱 멤브레인으로 덮은 다음 슬라이드를 꺼내 수돗물로 빠르게 씻습니다.
  4. 배경 분화: 3.3단계의 슬라이드를 luxol fast blue 염색 용액 B에 2초 동안(염료가 뜨거울 때) 넣고 luxol fast blue 염색 용액 C에 직접 담궈 15초 동안 분화하고 수초가 파란색이 되고 배경이 거의 무색이 될 때까지 물로 씻습니다.
  5. 에오신 카운터 염색: 3.4단계의 슬라이드를 65°C의 오븐에 넣어 건조시킵니다. 완료되면 오븐에서 꺼내 식히십시오. 슬라이드를 95% 에탄올과 에오신 카운터스테인에 넣고 1분 동안 대조합니다.
  6. 탈수 및 밀봉 : 3.5 단계의 슬라이드를 무수 에탄올에 5 분 연속적으로 넣고 신선한 무수 에탄올로 교체하고 5 분 동안 계속 담그고 5 분 동안 계속 담그고 다시 새로운 무수 에탄올로 교체하고 5 분 동안 계속 담그고 크실렌 5 분 동안 담그고 신선한 자일렌으로 교체하고 5 분 동안 담그십시오. 샘플을 세척 및 건조시키고 중성 검으로 밀봉하십시오.
  7. 현미경 검사: 정립 광학 현미경(Table of Materials)을 사용하여 이미지를 수집하고 분석합니다.

4. 유세포 분석

  1. 생쥐의 복강을 엽니 다. 핀셋을 사용하여 비장을 추출하고 가위를 사용하여 얼음 위의 PBS에서 1.5-2.5cm의 작은 조각으로 다집니다. 2.5mL 주사기 피스톤을 사용하여 2% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 RPMI-1640 10mL에서 비장을 분쇄하고 70μm 세포 스트레이너를 통해 밀어 넣어 단일 세포 현탁액을 얻습니다(재료 표).
    참고: 비장은 2.1단계에서 동일한 마우스에서 수확했습니다.
  2. 단계 4.1에서 얻은 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 5mL의 적혈구 용해 완충액을 사용하여 얼음에서 10분 동안 용해합니다. 2% FBS가 함유된 RPMI-1640으로 세척하고, 350 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 2% FBS가 함유된 RPMI-1640으로 세포를 재현탁합니다.
  3. 자동 세포 계수기(Table of Materials)로 세포를 계수하고 농도를 1 x 106 cells/mL로 조정합니다.
  4. 100μL의 세포 현탁액을 1.5mL 튜브에 피펫팅하고 1μL의 안티 마우스 CD16/32 항체14 (0.5mg/mL)를 30분 동안 배양하여 비특이적 염색을 차단합니다. RPMI-1640으로 세척하고 350 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하고 상층액을 버립니다. 2% FBS를 함유한 100μL의 RPMI-1640에 세포를 재현탁합니다.
  5. Teff 세포15 의 경우 CD45(Alexa Fluor 700), CD3(FITC), CD4(APC) 및 CD69(BV674)에 특이적인 항체가 있는 염색체를 30분 동안 복용, 각 항체당 2μL. Tem 세포16 에 대해 CD45(Alexa Fluor 700), CD3(FITC), CD4(APC), CD44(BV421) 및 CD62L(PE)에 특이적인 항체가 있는 염색을 30분 동안 각 항체에 대해 2μL. RPMI-1640으로 세척하고 350 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 350μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 유세포분석기 및 관련 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 세포 비율을 분석합니다.

5. cytometric bead array에 의한 cytokines 분석

  1. 세포 분석 비드 어레이(Table of Materials)를 사용하여 마우스 뇌에서 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 IFN-γ를 측정합니다.
  2. 2.1단계에서 설명한 대로 마우스 뇌를 수집합니다.
  3. 총 단백질 추출: 뇌 조직 50mg을 자르고 무게를 잰다(대조군은 뇌 3개, 최고조에 달한 EAE 그룹, RR 단계). 1.5mL 튜브에 뇌를 넣고 PMSF, 프로테아제 억제제 및 인산가수분해효소 억제제가 포함된 500μL의 용해 완충액을 추가합니다.
  4. 뇌를 약 1mm3 개의 작은 조각으로 자르고, 400 W, 5 초 ON 및 5 초 OFF에서 초음파 균질기로 추출합니다. 5회 반복합니다. 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓고 12000 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 수집합니다(재료 표).
  5. 아래와 같이 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 표준물질을 준비합니다.
    1. 동결건조된 마우스 Th1/Th2/Th17 표준물질의 바이알을 엽니다. 표준물질을 15mL 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 튜브 상단에 표준으로 레이블을 지정합니다.
    2. 2.0mL의 분석 희석제에서 표준물질을 재구성합니다. 재구성된 표준물질이 실온에서 15분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 재구성된 단백질을 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
    3. 12mm x 75mm 튜브에 라벨을 붙이고 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 순으로 희석합니다. 라벨링된 각 튜브에 300μL의 분석 희석액을 피펫으로 넣습니다.
    4. 연속 희석 수행: 최고 표준물질 300 μL를 1:2 희석 튜브에 옮기고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 300:2 튜브에서 1:4 튜브로 300μL를 1:256 튜브까지 전송하여 연속 희석을 계속합니다. 0pg/mL 음성 대조군 역할을 하는 분석 희석액만 포함된 12mm x 75mm 튜브를 준비합니다.
      참고: 피펫팅으로 철저히 혼합하십시오. 마이크로비즈의 항체 커플링이 떨어지는 것을 방지하기 위해 와류를 일으키지 마십시오.
    5. 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 포획 비드를 혼합하려면 실험을 위해 각 그룹(대조군, 피크 단계의 EAE 그룹 및 RR 단계)에 3개의 샘플이 있는 표준물질을 포함하여 19개의 튜브를 준비합니다. 포획 구슬 현탁액을 섞기 전에 5초 동안 격렬하게 소용돌이치십시오. 각 capture bead 190 μL를 단일 tube에 추가하고 mixed capture beads로 라벨링합니다. 비드 혼합물을 철저히 소용돌이치십시오.
      참고: 항체 접합 비드는 시간이 지남에 따라 현탁액에서 침전됩니다. 비드 현탁액 부분 표본을 복용하기 전에 바이알을 와류(vortex)해야 합니다.
    6. 분석을 수행하기 위해 혼합물 포획 비드를 와류로 만듭니다. 모든 분석 튜브에 50μL의 비드를 추가합니다. 표 1과 같이 50μL의 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 표준 희석액을 대조 튜브에 추가합니다.
    7. 모든 분석 튜브에 마우스 Th1/Th2/Th17 PE 검출 시약 50μL를 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 분석 튜브를 배양하고 빛으로부터 보호합니다. 각 분석 튜브에 세척 완충액 1mL를 추가하고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 각 분석 튜브에서 상등액을 조심스럽게 흡인하고 폐기합니다.
    8. 각 분석 튜브에 300μL의 세척 버퍼를 추가하여 비드 펠릿을 재현탁합니다. FCAP Array 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 데이터를 분석합니다.

  

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

임상 점수 평가
그림 1에서 볼 수 있듯이 대조군의 마우스는 어떠한 임상 증상도 나타내지 않았습니다. MOG35-55를 투여한 EAE 그룹의 마우스는 면역 접종 후 약 12일 후에 꼬리 마비를 보였다. 16일째가 되자 증상은 완전한 뒷다리 마비(정점 단계, 정점으로 정의됨)에 도달했습니다. 그 후, 증상은 점차 완화되었습니다. 생쥐의 임상 증상은 25일경에 악화되었고 약 30일경에 완전한 뒷다리 마비에 도달했습니다(재발기, RR로 정의됨). 특히 증상이 이전보다 더 오래 지속되어 전형적인 재발-완화 특징이 나타났습니다. 재발-완화 EAE 마우스의 주요 징후는 질병이 진행되는 동안 특정 주기성과 변동이 있는 다양한 발병, 완화 및 재발 단계를 경험합니다.

조직학적 분석
대조군 쥐는 염증성 세포 침투 없이 혈관이 고르게 분포되고 명확하게 정의된 온전한 뇌 조직 구조를 보여주었습니다. (그림 2A). EAE 그룹 마우스의 최고 단계에서 뇌에서 염증 세포의 상당한 침투가 관찰되었으며(그림 2B), 혈관 주위에 커프와 같은 변화를 형성했습니다(빨간색 화살표로 표시). 마찬가지로, RR 단계에서 EAE 그룹 마우스에서는 염증 세포의 명백한 침투가 있었으며(그림 2C), 혈관 주위(빨간색 화살표로 표시)가 우세하게 응집되었습니다.

LFB 염색 분석
대조군에서는 척추 백질의 미엘린 수초가 파란색으로 보였는데, 이는 그 구조가 손상되지 않고 빽빽하게 채워져 있음을 나타냅니다(그림 3A). EAE 그룹의 최고 단계에서 척추 백질은 밝은 파란색 또는 흰색을 나타냈습니다. 구조는 느슨하고 불연속적인 것으로 보였으며 빨간색 화살표로 표시된 액포 변성의 상당한 존재가 있었습니다(그림 3B). EAE 모델 그룹의 RR 단계에서는 척수에서 백질 수초의 광범위한 손실이 관찰되었습니다. 구조는 느슨한 것처럼 보였고 상당한 수의 액포 변성이 관찰될 수 있었습니다(빨간색 화살표로 표시; 그림 3C).

유세포 분석 분석
그림 4A,B에 묘사된 결과는 대조군과 비교할 때 피크 단계에서 EAE 마우스의 CD4+CD69+ Teff 세포 비율이 크게 증가했음을 보여주었습니다(P < 0.0001). 또한, 이러한 세포의 비율은 RR 단계에서 증가했지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(P > 0.05). 그림 4C,D는 대조군(P < 0.0001)에 비해 피크 및 RR 단계 모두에서 EAE 마우스의 CD4+CD44+CD62L-Tem 세포 비율이 눈에 띄게 증가한 것을 보여주었습니다.

cytometric bead array로 측정한 Cytokine
그림 5에 표시된 결과는 대조군과 비교했을 때 EAE 그룹에서 IL-4(P < 0.0001), IL-6(P < 0.001), IFN-γ(P < 0.0001) 및 TNF-α(P < 0.0001)의 수치가 대조군과 비교했을 때 유의하게 상승했음을 보여줍니다. IL-17A의 발현도 증가했지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(P > 0.05). 더욱이, IL-2 수준은 EAE 마우스의 최고 단계에서 변화를 보이지 않았다(P > 0.05). 그러나 RR 단계(P < 0.01)에서 유의하게 증가했습니다. 또한, RR 단계에서 TNF-α(P < 0.001) 및 IL-17A(P < 0.01) 발현은 대조군에서 관찰된 것보다 유의하게 높았습니다. 반대로, EAE 그룹에서 IL-10의 발현은 피크 단계와 RR 단계 모두에서 대조군보다 현저히 낮았습니다(P < 0.0001).

figure-results-1
그림 1: 임상 점수 평가. 임상 점수는 매일 평가되었으며 마우스가 MOG35-55에 의해 면역된 고전적인 재발-완화 EAE를 발달시켰음을 보여줍니다. (A) EAE 마우스의 증상 진행 다이어그램. (B) 평균 임상 점수를 통한 EAE 마우스의 평가. 데이터는 평균 ± SEM, n = 6으로 표현됩니다. 데이터는 통계적으로 유의한 차이를 평가하기 위해 사후 비교와 함께 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 분석되었습니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 뇌 H&E 염색의 현미경 지도. (A) 대조군의 쥐 뇌. (B) EAE 마우스의 뇌가 최고조에 달한 경우. 염증성 세포는 EAE 그룹 마우스의 최고 단계에서 뇌에 침투하여 혈관 주위에 분포하여 커프와 같은 변화(빨간색 화살표)를 형성했습니다. (C) RR 단계의 EAE 마우스 뇌. RR 단계의 EAE 그룹 마우스의 염증 세포가 혈관 주위에 응집되어 있습니다(빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 미엘린초 LFB 염색의 현미경 지도. (A) 대조군의 마우스 수초. (B) EAE 마우스는 최고 단계에 있습니다. 척추 백질은 연한 파란색 또는 흰색이었고, 구조가 느슨하고 불연속적이었으며, 많은 수의 액포 변성이 나타났습니다(빨간색 화살표). (C) RR 단계의 EAE 마우스 수초. 척수의 백질 수초가 널리 손실되었고, 구조가 느슨했으며, 많은 수의 액포 변성이 나타났습니다(빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: MOG35-55에 의한 면역은 EAE 마우스의 피크 및 RR 단계 모두에서 CD4 Teff 및 Tem 세포 비율의 상향 조절을 유도했습니다. (A) CD4+CD69+ 세포의 면역 염색을 표시하는 예시 흐름 그래프. (B) CD4+CD69+ Teff 세포의 비율. (C) CD44+CD62L+ 세포의 면역염색을 보여주는 예시적인 흐름도(CD4 T 세포의 게이트). (D) CD44+CD62L+ Tm 세포의 비율. 데이터는 평균 ± SEM, n = 5로 표현됩니다. 데이터는 통계적으로 유의한 차이를 평가하기 위해 사후 비교와 함께 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 분석되었습니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 세포 측정 비드 어레이로 분석한 마우스 뇌의 사이토카인 수준. 데이터는 평균 ± SEM, n = 3으로 표현됩니다. 데이터는 통계적으로 유의한 차이를 평가하기 위해 사후 비교와 함께 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 분석되었습니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

튜브 라벨농도(pg/mL)사이토카인 표준 희석
10 (네거티브 컨트롤)표준 희석 없음(Assay Dilution만 해당)
2201:256
3401:128
4801:64
51561:32
6312.61:16
76251:8
812501:4
925001:2
105000최고 표준

표 1: 대조관에 대한 사이토카인 표준물질 희석액 목록.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다발성경화증은 중추신경계의 가장 흔한 자가면역 탈수초 질환으로, 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다17. EAE는 MS18의 임상적 병리학적 특징을 시뮬레이션하기 위한 전형적인 동물 모델입니다. 연구에 따르면 다발성경화증이 있는 개인은 중추신경계의 축삭돌기와 뉴런의 퇴화로 인해 인지 장애 및 기타 장애를 경험하는 것으로 나타났습니다 19,20,21. EAE 모델의 최고점과 RR 단계에서 마우스는 꼬리와 뒷다리에 마비를 보였습니다. 또한, 염증성 세포가 중추신경계로 침투하여 다양한 정도의 미엘린 수초 손실로 이어지는 것이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 이 실험에서 EAE 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타냅니다.

MOG35-55 및 CFA의 유화 공정은 균질화 공정 중 발열로 인한 MOG35-55의 열화를 방지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. PTX는 혈관 투과성을 향상시키기 위해 복강내로 투여되어 T 세포가 혈액-뇌 장벽을 쉽게 통과하고 뉴런을 둘러싼 수초에 도달할 수 있도록 합니다22. 특히 주의가 필요한 것은 생쥐가 마비되어 혼자서는 먹거나 마실 수 없는 경우 과도한 갈증과 배고픔을 방지하기 위해 케이지에 음식과 물 트레이를 제공하거나 수동으로 먹이를 주는 것이 중요하다는 것입니다.

CD4+CD69+ Teff 세포 및 CD4+CD44+CD62L-Tem 세포의 비율을 분석하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. EAE 마우스의 비장에서 CD4+CD69+ Teff 세포의 비율은 최고 단계에서 현저하게 상향 조절되었습니다. 또한, 재발 단계에서 대조군보다 높았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 반면에, CD4+CD44+CD62L-Tem 세포의 비율은 피크 단계와 RR 단계 모두에서 대조군에 비해 EAE 마우스에서 유의하게 높았습니다. 이는 EAE의 시작이 피크 단계에서 CD4+CD69+ Teff 및 CD4+CD44+CD62L- Tem 세포를 모두 포함할 수 있는 반면, RR 단계는 주로 CD4+CD44+CD62L- Tem 세포에 의해 지배될 수 있음을 시사합니다. CD69는 림프구 활성화 중에 발현되는 가장 초기의 막 표면 분자입니다. T세포의 부착과 이동을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 이를 통해 면역세포가 신체 내 감염 또는 염증 부위를 식별하고 국소화하는 데 도움을 줍니다23. 휴지 T 세포는 CD69를 발현하지 않지만, 항-CD3/TCR 활성제에 의해 자극되고 활성화될 때 유도적으로 발현될 수 있다24. effector 단계 이후, T 세포의 상당 부분은 더 이상 분화할 수 없기 때문에 세포사멸을 겪습니다. 이러한 개체 수 감소는 주로 항원 자극 중에 생성되는 IL-2를 포함한 생존을 촉진하는 사이토카인이 없기 때문에 발생합니다. 또한, 이러한 사이토카인에 대한 수용체의 하향 조절은 이러한 클론 수축 현상에 더욱 기여합니다25. 또한, 적응면역 반응을 통한 감염원의 제거는 T 세포의 클론 수축을 유도하여 궁극적으로 병원체에 재감염될 경우 숙주에 면역 반응을 제공할 수 있는 수명이 긴 기억 세포를 더 적게 남깁니다26. 본 연구에서 CD4+CD69+ T 세포의 비율은 최고 단계에서 현저하게 증가했으나 RR 단계에서 감소했는데, 이는 CD4 Teff 세포가 일정 기간 동안 생존할 수 없고 궁극적으로 세포사멸을 겪으며, 항원 특이적 T 세포의 극히 일부만이 수명이 긴 기억 T 세포로 발달한다는 것을 나타냅니다. Tem cell은 CD62L의 발현이 낮습니다. 그러나 그들은 염증이 있는 조직으로의 이동을 용이하게 하는 일부 chemokine 수용체와 접착 분자를 발현할 수 있습니다. 항원 재활성화 후 증식 속도는 상대적으로 느리지만 사이토카인은 빠르게 방출되어 effector 기능을 시작합니다27. 본 연구에서는 에멀젼에서 방출된 마우스의 항원이 면역 체계를 다시 공격하면 Tem 세포가 재활성화되고 IL-6 및 IFN-γ와 같은 많은 수의 사이토카인이 방출될 수 있으며, 이는 EAE 마우스의 재발을 초래할 수 있습니다.

자가면역질환(다발성 경화증 포함)과 관련된 주요 전염증성 CD4 T 세포 집단은 IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α를 분비하는 Th1 세포와 IL-17을 분비하는 Th17 세포입니다. Th1 세포 관련 IFN-γ는 희소돌기아교세포에 직접적인 해로운 영향을 미쳐 환자의 중추신경계 뉴런에 손상을 줄 수 있음이 입증되었다28. Th17 세포는 또한 다발성 경화증을 포함한 여러 자가면역 질환에서 중요한 역할을 합니다. 연구에 따르면 다발성 경화증 환자의 뇌 병변에서 Th17 세포와 IL-17 mRNA의 수치가 질병이 없는 개인과 비교했을 때 높은 수치가 관찰되었습니다29. IL-10 및 TGF-β30 생성을 특징으로 하는 Treg 세포는 면역억제 효과가 있으며 자가 성분에 대한 면역 체계의 내성을 유지하는 데 중요한 역할을 하여 신체가 면역 항상성을 유지할 수 있도록 합니다. 여기에서 우리는 피크 단계에서 EAE 그룹에서 IL-4, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α 발현의 상당한 상향 조절을 관찰했습니다. 또한 IL-17A의 발현도 증가했지만 유의성은 없었습니다. 대조적으로, RR 단계에서 TNF-α 및 IL-17A의 발현 수준은 대조군에 비해 유의하게 높았습니다. 이는 EAE의 피크 단계가 주로 Th17 세포보다는 Th1 세포에 의해 주도되는 반면, EAE의 RR 단계는 Th1 및 Th17 세포 모두에 의해 시작되었음을 시사합니다. 최고점과 RR 기간 모두에서 EAE 그룹에서 IL-10의 발현이 대조군보다 현저히 낮았다는 점은 주목할 가치가 있으며, 이는 EAE의 병리학적 진행 중에 Treg 세포의 면역 억제 기능이 방해받았음을 시사합니다.

결론적으로, 본 연구는 MOG35-55 펩타이드를 이용한 면역화를 통한 마우스 재발-완화 EAE 모델의 성공적인 확립을 시사합니다. 활성기의 관점에서 볼 때, EAE의 최고기는 아마도 CD4+CD69+ Teff 및 CD4+CD44+CD62L-Tem 세포에 의해 시작되었을 것이며, EAE RR 단계의 재발은 주로 CD4+CD44+CD62L-Tem 세포에 의해 지배될 수 있습니다. 면역 효과 기능의 관점에서 EAE의 최고 단계는 주로 Th17 세포가 아니라 Th1 세포에 의해 시작되었습니다. 그러나 EAE의 RR 단계는 Th1 및 Th17 세포에 의해 시작되었습니다. Treg 세포의 면역억제 기능은 EAE 병리학적 과정에서 억제되었습니다. 그럼에도 불구하고 Th1/Th17 세포의 활성화와 Treg 세포의 억제의 기저에 있는 분자 메커니즘은 추가 조사가 필요합니다.

공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 닝샤 자연과학재단(2022AAC03601 및 2023AAC02087)과 닝샤 의과대학 연구재단(XM2019052)의 지원을 받았습니다. Ningxia Medical University 의료 과학 기술 연구 센터의 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취기 증발기Norvap20-17368
  IsofluraneSigma-Aldrich (상하이) 트레이딩 Co.Ltd.
70 μ m 세포 스트레이너XIYAN Co., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 안티 마우스 CD45 항체Biolegend103128
APC 안티 마우스 CD4 항체Biolegend100616
자동 세포 계수기 Jiangsu JIMBIO technology Co., LTDJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 CBA KitBD Biosciences560485
Biotin 안티 마우스 CD16 / 32 항체Biolegend101303
Brilliant Violet 510 안티 마우스 CD69 항체Biolegend104532
BV786 쥐 안티 마우스 CD62L (MEL-14)BD Pharmingen563109
Column Tissue& 세포 단백질 추출 키트Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Freund의 AdjuvantSigma-Aldrich(상하이) 거래 Co.Ltd 완료. 
탈수기DIAPATHDonatello
일회용 멸균 주사기 (1mL)Yikang Group210820
일회용 멸균 주사기 (2.5mL)Yikang Group210820
일회용 멸균 주사기 (5mL)Yikang Group210820
염색기DIAPATHGiotto
끼워넣는 기계우한 Junjie 전자공학 Co., 주식 회사JB-P5
에탄올SCRC100092683
태아 둔감한 혈청Procell 생명 과학& Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)FSP500
FITC 햄스터 안티 마우스 CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
유세포 분석기Becton, Dickinson and CompanyFACSCelesta
유세포 분석기Becton, Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo 소프트웨어BD Biosciences10.8.1
냉동 플랫폼Wuhan Junjie Electronics Co., 주식회사 JB-L5
유리 슬라이드서비스바이오G6004
HE 염료 용액 세트서비스바이오G1003
헤마톡실린-에오신 용액서비스바이오G1002
고속 냉장 원심분리기써모 피셔 사이언티픽Mogafugo8R
이미징 시스템니콘니콘 DS-U3
Luxol 빠른 블루 염색 키트ServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Myelin 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
중성 껌SCRC10004160
OrganizerKEDEEKD-P
오븐LaboteryGFL-230
병리학 슬라이서LeicaRM2016
백일해 독소 Bordetella 백일Sigma-Aldrich (상하이) 무역 Co.Ltd.P7208
인산염 완충 식염수ServicebioG4202
피펫 0.5-10 μ LDLAB Scientific7010101004
피펫 100-1000 μ LDLAB Scientific7010101014
피펫 20-200 μ LDLAB 사이언티픽7010101009
RPMI-1640프로셀 생명과학& Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)
티 밸브Guangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
조직 스프레더Zhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
정립 광학 현미경NikonNIKON ECLIPSE E100
XyleneSCRC10023418
792632SLCH4887해 PM150110

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