방법 논문

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

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DOI:

10.3791/66579

⸱

2024년 9월 6일

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

초록

뉴클레오솜은 진핵생물 염색질의 주요 단위를 구성하며 생물물리학적 특성 및 염색질 결합 단백질과의 상호 작용에 관한 수많은 유익한 단일 분자 조사의 초점이었습니다. 이러한 연구를 위한 DNA의 뉴클레오솜 재구성에는 일반적으로 DNA 테더를 따라 형성된 뉴클레오솜의 배치와 수를 정밀하게 제어하는 염 투석 절차가 포함됩니다. 그러나 이 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 입력으로 상당한 양의 DNA와 히스톤 옥타머가 필요합니다. 대안 전략을 제공하기 위해, 히스톤 샤페론 Nap1을 활용하는 단일 분자 힘 및 형광 현미경을 위한 현장 뉴클레오솜 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 통해 사용자는 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열 없이도 모든 DNA 템플릿에서 뉴클레오솜을 조립하고, 필요에 따라 뉴클레오솜 밀도를 조정하고, 더 적은 시약을 사용할 수 있습니다. In situ 뉴클레오솜 형성은 몇 초 내에 발생하여 실험 워크플로우가 더 간단하고 단일 분자 측정으로 편리하게 전환할 수 있습니다. 뉴클레오솜 역학을 조사하고 염색질에 대한 개별 단백질의 거동을 시각화하기 위한 두 가지 다운스트림 분석의 예가 자세히 설명되어 있습니다.

서론

진핵 염색질의 주요 포장 단위는 뉴클레오솜으로, DNA의 ~ 147 염기쌍 (bps)이 코어 히스톤 단백질 1,2의 옥타머를 감싸고 있습니다. 게놈 패키징 외에도 뉴클레오솜 아키텍처는 다양한 기능을 수행할 때 염색질 결합 단백질에 의해 활용될 수 있는 생물물리학적 조절의 또 다른 풍부한 층 역할을 합니다 3,4. 뉴클레오솜의 물리적 특성에 대한 실험적 접근 및 측정은 기술적으로 어려웠는데, 이는 이러한 단위가 미세한 규모(예: 나노미터 길이, 피코네톤 힘)에서 작동하기 때문에 프로빙에는 기능을 의미 있게 알려줄 수 있는 충분한 감도와 정밀도가 필요하기 때문입니다. 더욱이, 염색질 결합 단백질은 종종 기질과 일시적으로 결합하며, 대부분의 앙상블 접근법은 이러한 상호 작용의 동역학을 알려주는 적절한 시간적 해상도가 부족합니다5. 다행히도, 단 하나 분자 기술의 출현은 즉시에 있는 개인적인 단백질 및 그들의 상호 작용을 구상하고 교묘히 다루는 것을 가능하게 해, nanoscale6에 일어나는 이 분자 사건에 관하여 기계론적인 정보를 계시하. 특히, 단일 분자 상관 힘 및 형광 현미경(smCFFM)은 고분해능 형광 검출 및 힘 조작 도구를 모두 활용하여 염색질 및 염색질-단백질 복합체의 역학, 조성 및 조정을 동시에 해결합니다 7,8.

힘 조작 방법으로 "광학 핀셋"을 특별히 사용하는 smCFFM에서는 단단히 집중된 레이저를 사용하여 일반적으로 미크론 크기의 플라스틱 비드와 같은 유전체 물체를 3차원9로 가둡니다. DNA 조각과 같은 생체 중합체는 비드에 접합될 수 있으며(예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴, 디곡시제닌-항-디곡시제닌 항체 결합을 통해), 사용자는 보정된 힘을 적용하고 시스템(10)에 의해 생성된 힘/변위를 측정할 수 있다. 추가된 형광 모듈을 사용하면 동시 다색 형광 이미징을 통해 단백질 구성 및 거동을 추적할 수 있습니다.

smCFFM에 대한 뉴클레오솜 템플릿을 재구성하는 주류 방법은 염 투석 11,12,13에 의해 맞춤형 DNA 템플릿에 뉴클레오솜을 조립하는 것입니다. 이 절차에서, 정제 된 히스톤 옥타 머는 고 염 완충액 (~ 1M 염화나트륨)에서 DNA 템플릿과 함께 배양되고, 염이 천천히 투석됨에 따라 뉴클레오솜은 서열 의존적 위치 방식으로 DNA에 자발적으로 조립됩니다14,15. 따라서, 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열(예를 들어, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17)이 DNA 템플릿 내에 통합되어 맞춤형 뉴클레오솜 어레이를 생성하는 것이 일반적이다. 이 잘 확립된 방법은 DNA에 걸친 뉴클레오솜의 배치와 수에 대한 정밀한 제어를 제공하지만, 몇 가지 단점이 있습니다: (1) 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 DNA 서열의 통합은 염색질 결합 단백질의 활성을 편향시키는 인위적으로 안정적인 뉴클레오솜을 생성할 수 있습니다. (2) 뉴클레오솜 형성을 위한 염 투석 과정에는 많은 양의 DNA와 옥타머가 필요합니다. (3) 이 절차는 최적의 뉴클레오솜 어레이 밀도를 위해 올바른 DNA 대 옥타머 비율을 적정하는 데 상당한 노력뿐만 아니라 1-며칠의 작업이 필요합니다.

이 원고에서는 생체 내 뉴클레오솜 형성의 생리적 경로와 유사한 재조합 히스톤 샤페론 Nap1을 사용하여 단일 분자 상관력 및 형광 현미경 내에서 DNA를 따라 제자리에서 DNA를 형성하는 대체 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 사용자는 비특이적 DNA 염기서열에서 뉴클레오솜을 조립하고, 뉴클레오솜 밀도를 쉽게 조정하고, 훨씬 더 적은 양의 시약을 몇 분 내에 사용할 수 있습니다. 또한 in situ 뉴클레오솜 DNA 테더의 형성은 더 간단한 실험 워크플로우와 내장된 단일 분자 시각화 및 조작의 편리함을 가능하게 합니다. 따라서 균일하고 특이적인 뉴클레오솜 포지셔닝이 필요하지 않은 경우 이 프로토콜은 크로마틴에 대한 뉴클레오솜 역학 또는 단백질 거동 조사에 유용한 옵션을 제공하며, 이에 대해 예제 분석도 설명합니다.

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 비오틴화된 DNA의 제조

  1. λ DNA 20μg, 비오틴-dCTP 33μM, 비오틴-dUTP 33μM, 비오틴-dATP 33μM, dGTP 33μM, Klenow 효소 10단위 및 1x NEB Buffer 2를 포함하는 120μL 부피 반응을 준비합니다.
    참고: 이 절차는 특히 12-뉴클레오티드(nt) 5' 단일 가닥(ss) DNA 돌출부(23)를 포함하는 선형 이중 가닥(ds) 메틸화가 없는 박테리오파지 λ 게놈 DNA(48,502bps)를 사용합니다. 그러나, 프로토콜은 적어도 몇 개의 ss 5' 돌출부(nts)를 포함하는 경우, 선형 dsDNA의 모든 길이 또는 서열을 사용하도록 조정할 수 있으며, 길이 및 nt 서열은 광학 트랩 간의 다운스트림 테더링을 위해 각 말단에 설치된 비오틴화된 nt의 수를 나타냅니다. 또한 반응을 축소할 수 있습니다. 예를 들어, 5μg의 DNA를 30μL 부피 반응에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 방식으로 생성된 DNA 기질은 비틀림에 의해 구속되지 않습니다. 비틀림 제약이 있는 DNA를 생성하는 프로토콜에 대해서는 이전에 발표된 보고서24,25를 참조하십시오.
  2. 실온에서 15분 동안 반응을 배양합니다.
  3. 10mM의 EDTA를 추가하고 75°C에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 에탄올 침전을 수행하여 비오틴화된 DNA 생성물을 얻습니다.
    1. 0.1M 아세트산 나트륨 0.1x 부피와 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 3배를 추가합니다. -20 °C에서 최소 1시간에서 밤새 유지하십시오. 13,500 x g 에서 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다.
    2. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 75% 에탄올을 추가합니다. 13,500 x g 에서 4 °C에서 1분 동안 원심분리합니다.
    3. 상층액 제거, 에탄올 첨가 및 원심분리 단계를 반복합니다.
    4. 모든 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿을 100-200 μL의 TE 완충액 또는 ddH2O에 용해시킵니다(용해를 용이하게 하기 위해 37°C에서 배양 가능). Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다.

2. 플로우 셀(flow cell)의 채널 준비

참고: 이 절차는 상업적으로 이용 가능한 미세유체 칩( 재료 표 참조)을 기반으로 하지만 다중 채널 플로우 셀이 있는 모든 smCFFM 기기에 적용할 수 있습니다.

  1. 부동태화 채널(ch.) 4 및 5(또는 단백질을 포함할 모든 ch. )( 그림 1A의 채널 개략도 참조). 각 채널에 500μL의 0.1% BSA를 추가하고 0.8bar(내경이 0.010인치인 튜빙의 경우 ~0.45μL/s)로 8분 동안 흐릅니다. 용액을 제거합니다.
  2. 각 채널에 500μL의 0.05% Pluronic-F127을 추가하고 0.8bar에서 8분 동안 흐릅니다. 용액을 제거하고 1x PBS로 주사기를 헹굽니다. 각 채널에 2mL의 1x PBS를 추가하고 0.8bar에서 27분 동안 흐릅니다.
  3. 스트렙타비딘 코팅 비드의 원액을 소용돌이치고(이 절차에서는 3.13μm 크기의 비드 사용) 비드 용액 2.15μL를 1x PBS 1mL에 추가합니다. ch. 1에 추가하십시오.
    참고: 스트렙타비딘 코팅 비드의 크기와 농도는 사용자 선호도에 따라 조정할 수 있습니다.
  4. 30-80ng의 비오틴화 λ DNA를 1x PBS 1mL에 추가합니다. ch. 2에 추가하십시오.
    참고: 비오틴화된 DNA의 농도는 사용자 취향에 맞게 조정할 수 있습니다. 더 많은 양의 DNA는 DNA 밧줄을 형성하는 빈도를 증가시키지만 한 번에 여러 DNA 분자를 밧줄로 묶는 빈도도 증가하여 실험의 어려움을 가중시킬 수 있습니다.

3. Nap1 매개 in situ nucleosome formation

  1. 500μL의 protein-free 이미지 버퍼를 ch. 3에 추가합니다.
    참고: ch. 3 의 완충액 조성은 유연하며 뉴클레오솜과 관심 특정 단백질 모두에 적합해야 합니다. 선택적으로, 사용자는 뉴클레오솜으로 적절하게 감싸지지 않은 히스톤 옥타머를 제거하기 위해 형광단 및/또는 경쟁사 DNA의 광표백을 줄이기 위해 산소 제거 시스템을 추가하도록 선택할 수 있습니다.
  2. 2 nM S. cerevisiae Nap1 및 2-5 nM LD655 표지 H4 히스톤 옥타머 (HO)를 1x HR 완충액18의 500 μL에 첨가하십시오. ch. 4에 추가하십시오.
    알림: 히스톤 옥타머 및 Nap1은 상업적으로 구입하거나 사내에서 준비할 수 있습니다( 재료 표 참조). 테더링된 각 DNA를 따라 형성되는 뉴클레오솜의 수는 옥타머 농도와 이 채널에서 보낸 시간에 따라 달라집니다. 각 DNA 분자를 따라 사용자가 원하는 대략적인 뉴클레오솜 밀도는 이러한 매개변수 중 하나 또는 모두를 조정하여 조절할 수 있습니다. 또한 사용자는 선호하는 형광단으로 히스톤 옥타머를 라벨링하도록 선택할 수 있습니다.
  3. 선택 사항: 염색질 결합 단백질 또는 기타 관심 단백질을 적절한 완충액에 ch. 5 에 추가합니다.
  4. 모든 채널을 1.0bar(현재 실험 설정에서 ~0.55μL/s)에서 30초 동안 흐르게 하여 플로우 셀 채널을 샘플로 플러시합니다.
  5. 유량을 0.2bar(현재 실험 설정에서 ~0.16μL/s)로 설정합니다. 광학 트랩(OT)을 ch. 1 로 이동하고 적절한 스트렙타비딘 코팅 비드 쌍을 포착합니다.
  6. OT를 ch. 3으로 이동하고, 비드 쌍에 대한 힘 보정을 수행하고, 적색 공초점 레이저(또는 선택한 다른 레이저 라인)를 켜고, 이미징 영역을 보정합니다.
  7. 흐름을 0.2bar로 설정하고 OT를 ch. 2로 이동합니다. 비오틴화된 DNA를 포착합니다.
  8. OT를 ch. 3 으로 이동하고 흐름을 중지합니다. OT 사이의 거리를 늘려 DNA를 늘리고 관련 힘-거리(FD) 곡선을 모니터링하여 단일 DNA 테더(여러 테더와 반대)의 존재를 확인합니다. 곡선은 주어진 윤곽 길이26에서 dsDNA에 대한 웜 유사 사슬 모델을 따라야 합니다.
  9. DNA 장력이 약 1pN이 되도록 OT 사이의 거리를 조정합니다.
    참고: 1pN의 장력은 뉴클레오솜이 DNA27 로 둘러싸인 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분히 낮지만 전체 DNA 분자를 라인 스캐닝 이미징 축 내에 배치할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.
  10. 라인 스캔을 켜서 빨간색 레이저가 켜진 상태에서 카이모그래프 수집을 시작합니다.
    참고: 사용자 선호도에 따라 테더링된 DNA의 Kymographs 또는 2D 스캔을 얻을 수 있습니다.
  11. 흐름이 꺼진 상태에서 OT를 ch. 4 로 이동합니다. Nap1에 의해 촉진된 HO는 DNA에 로드되고 래핑되어 실시간으로 뉴클레오솜을 형성합니다. 뉴클레오솜 로딩은 카이모그래프 내의 DNA에 나타나는 형광 궤적으로 시각화됩니다. 동시에, DNA의 뉴클레오솜 형성은 OT의 위치가 일정하게 유지될 때 더 많은 HO가 로드됨에 따라 힘 증가에 의해 모니터링될 수 있습니다.
    참고: 형광 여기 레이저는 형광단의 광표백을 방지하기 위해 뉴클레오솜 형성 단계에서 끌 수 있습니다. 또한, 히스톤 옥타머가 뉴클레오솜으로 싸여 있지 않은 DNA에 대한 히스톤 옥타머의 비특이적 결합은 이 프로토콜을 사용하여 발생할 수 있습니다. 이러한 결합 이벤트는 아래의 Unwrapping Nucleosomes (step 4) 프로토콜에 설명된 대로 DNA가 늘어날 때 "rip"을 생성하지 않으며, 특히 완충액에 자유 경쟁자 DNA가 포함된 경우 부드러운 완충액 흐름에 의해 씻겨질 수 있습니다.
  12. 대략적으로 원하는 수의 뉴클레오솜이 형성되면 데이터 수집을 시작합니다.

4. 뉴클레오솜 풀기

  1. 2단계와 3단계를 완료합니다.
  2. 뉴클레오솜을 포함하는 DNA 테더를 형성한 후 OT를 ch. 3으로 이동합니다.
  3. 힘이 대략 0이 될 때까지 OT 사이의 거리를 줄여 뉴클레오솜 해제 실험을 준비합니다. 힘을 0으로 만듭니다.
  4. 0.1μm/s의 일정한 속도로 OT 1을 OT 2에서 멀어지게 합니다. 카이모그래프에서 OT 1의 비드는 시각적으로 OT 2의 비드에서 더 멀리 이동합니다. FD 곡선에서 거리가 증가함에 따라 힘이 증가합니다. 뉴클레오솜이 풀리면 힘(~8-37 pN)에 "찢어짐" 또는 전이가 나타나는데, 이는 개별 뉴클레오솜 27,28,29의 내부 랩이 풀리는 것을 의미합니다.
    참고: 언래핑이 발생하는 힘은 평형이 아닌 프로세스에서 예상되는 풀링 속도에 따라 달라집니다. 때로는 여러 개의 뉴클레오솜이 한 번에 풀리면서 FD 곡선의 전이에서 더 큰 거리 변화를 일으킵니다. 또한, 뉴클레오솜의 외부 랩이 풀리는 것은 이 실험 환경에서 쉽게 볼 수 없습니다(토론 섹션 참조).

5. 염색질에 결합하는 단백질 시각화

  1. 2단계와 3단계를 완료합니다.
  2. ch. 5에서 500μL의 이미지 버퍼에 10nM의 Cy3 표지 링커 히스톤 H1.4를 추가합니다.
    참고: 관심 있는 모든 단백질을 원하는 농도로 ch. 5 에 추가할 수 있습니다(일반적으로 단일 분자 시각화의 경우 100nM 미만).
  3. 뉴클레오솜을 포함하는 DNA 테더를 형성한 후 적색 레이저 외에 녹색 레이저를 켜고 OT를 ch. 5 로 이동하여 크로마틴에 결합하는 H1의 실시간 이미징을 수행합니다.
  4. 충분한 통계가 달성될 때까지 카이모그래프 또는 스캔을 계속 수집합니다(이벤트 빈도 및 실험 난이도에 따라 최소 10~20개의 카이모그래프).

결과

3단계(그림 1A)에 설명된 설정을 사용하여 DNA 테더를 따른 뉴클레오솜 형성을 2D 스캔(그림 1B, 왼쪽)에서 빨간색 형광 병소의 모양 또는 카이모그래프(그림 1B, 오른쪽)에서 시간 경과에 따른 궤적으로 시각화했습니다. 적절하게 래핑된 뉴클레오솜은 컨포칼 검출의 회절 한계(~300nm) 내에서 시간이 지남에 따라 정지된 형광 궤적을 생성했습니다. 특히, 회절 한계 하에서 서로 가까이 형성된 여러 뉴클레오솜은 공간적으로 분해될 수 없으며 더 밝은 초점 또는 궤적으로 나타납니다. 그럼에도 불구하고 개별 뉴클레오솜 궤적의 광표백 단계를 분석한 결과 1단계(그림 1C) 또는 2단계(그림 1D) 광표백 현상이 자주 나타났으며, 이는 이 샘플에서 H4 단백질의 약 70% 라벨링 속도를 감안할 때 병소에 대부분 단핵체가 포함되어 있음을 나타냅니다. 더욱이, 이 실험 조건에서 단일 LD655 형광단의 평균 광자 수를 기반으로 각 뉴클레오솜 궤적에서 표지된 H4 사본의 수를 추정하고 뉴클레오솜 유전자좌가 우세하게(>75%) 1개 또는 2개의 표지된 H2A 사본을 포함하고 있음을 보여주었으며(그림 1E), 이들이 주로 공간적으로 분리된 단핵소체로 로드되었다는 개념과 일치합니다. 다른 더 밝은 병소에는 표지된 H4의 복사본이 3개 이상 포함되어 있으며, 이는 회절 한계 내에 있는 여러 뉴클레오솜을 나타낼 수 있습니다.

뉴클레오솜 형성은 또한 더 많은 DNA가 히스톤 옥타머를 감싸면서 OTs의 위치가 일정하게 유지될 때 테더를 따라 장력의 증가에 의해 모니터링되었습니다(그림 1B, 하단). Nap1이 없는 경우, 히스톤 옥타머는 여전히 DNA를 결합할 수 있지만 OT 위치가 유지될 때 관련 장력이 일정하게 유지되었기 때문에 대부분 감싸지 않은 상태로 남아 있습니다(그림 1F). DNA에 대한 히스톤 옥타머의 비특이적 결합은 Nap1의 존재 하에서도 발생할 수 있습니다. 또 다른 실험에서는 Cy3 표지 H2A를 포함하는 뉴클레오솜을 형성하기 위한 동일한 프로토콜이 수행되었으며, 이는 LD655 표지 H4(그림 1G)로 수행된 것과 유사한 결과를 산출했으며, 이는 온전한 옥타머가 뉴클레오솜으로 조립되었음을 나타냅니다.

4단계(그림 2A)에 설명된 설정을 사용하여 테더 거리가 증가함에 따라 시간이 지남에 따라 뉴클레오솜 해제를 키모그래프에서 시각화했습니다(그림 2B). 이전에 히스톤 옥타머는30,31 풀린 후에도 DNA에 묶인 상태로 남아 있는 경우가 많으므로 형광 궤적은 높은 장력에서도 종종 지속된다고 보고되었습니다. 뉴클레오솜 언래핑(nucleosome unwrapping)은 관련 FD 곡선에서도 모니터링되었습니다(그림 2C). FD 곡선의 정량화 가능한 특징은 뉴클레오솜(들)이 풀리는 힘(그림 2C 삽입물의 "전이 F" 참조)뿐만 아니라 히스톤 옥타머(그림 2C 삽입물의 "ΔL" 참조)에서 방출된 DNA의 길이를 포함하며, 이는 ~24nm의 배수로 존재하며, 개별 뉴클레오솜27의 DNA의 내부 회전의 독립적인 언래핑과 일치하며, 30입니다. 이러한 파라미터는 각 테더에 형성된 뉴클레오솜의 수를 추정하거나 뉴클레오솜 역학의 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 이와 같이, 기계적 당김 실험에서 얻어진 내회전 파열의 수는 단량체 강도를 기반으로 각 뉴클레오솜 궤적에서 라벨링된 H4 사본의 추정 수와 비교되었으며, 이는 수치가 대체로 일관됨을 보여주었습니다(그림 2D-G에 표시된 예). 그러나, 그림 1F와 같이 샘플에서 H4 단백질의 ~ 70 % 라벨링 효율과 DNA에 대한 잔류 Nap1 독립적 인 히스톤 결합으로 인해 완벽하게 일치하지 않는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 예상대로 Nap1 결합 베어 DNA 테더(히스톤 없음)를 늘리면 힘에 의한 전이가 생성되지 않으며(그림 2H), 이는 Nap1 단독으로 DNA를 크게 왜곡하지 않음을 나타냅니다.

5 단계 (그림 3A)에서 설명 한 설정을 사용하여 링커 히스톤 H1과 염색질 간의 결합은 염색질 테더를 따라 녹색 형광 초점의 출현으로 시각화되었습니다 (그림 3B). 특히, H1 결합 뉴클레오솜은 시간이 지남에 따라 정지해 있는 것처럼 보이는 이중 색상 궤적( 그림 3B의 흰색 화살표 참조)을 생성했습니다. 또한, 뉴클레오솜이 없는 DNA 영역에 걸쳐 확산되는 H1 궤적이 관찰되었습니다( 그림 3B의 녹색 별 참조).

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그림 1: Nap1 매개 in situ nucleosome 형성. (A) Nap1 매개 현장 뉴클레오솜 형성 프로토콜(3단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 한 쌍의 비드를 ch. 1에 광학적으로 포획하고, ch. 2에서 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 단일 λ DNA 분자를 비드 사이에 연결했습니다. 그런 다음 테더를 DNA 전체에 걸쳐 뉴클레오솜의 실시간 형성을 위해 LD655 표지된 히스톤 옥타머(빨간색) 및 Nap1을 포함하는 ch. 4로 이동했습니다. (B) LD655-H4 표지된 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표적인 2D 스캔(왼쪽) 및 카이모그래프(오른쪽). 관련 힘 판독값(하단)은 OT 위치가 일정하게 유지될 때 테더가 ch. 4로 이동하면 즉시 힘이 증가하며, 이는 뉴클레오솜 래핑을 나타냅니다. 더 밝은 궤적은 ~300nm의 회절 한계 내에 위치한 여러 개의 인접한 뉴클레오솜을 의미합니다. (C) LD655-H4를 포함하는 뉴클레오솜의 1단계 광퇴백 이벤트(흰색 화살표)를 보여주는 키모그래프의 예. (D) LD655-H4를 포함하는 뉴클레오솜의 2단계 광표백 이벤트(흰색 화살표)를 보여주는 키모그래프의 예. (E) 형광 강도에서 추정된 궤적당 LD655-labeled H4 수의 상대 주파수. (F) Nap1이 없는 경우 히스톤 옥타머로 결합된 테더의 대표 키모그래프. 관련 힘 판독 값 (하단)은 히스톤 옥타머가 DNA를 결합하더라도 변하지 않습니다. (G) Cy3-H2A 표지된 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표 키모그래프. 관련 힘 판독값(하단)은 테더가 ch. 4(옥타머 및 Nap1 포함)로 이동하자마자 힘이 증가함을 보여주며, 이는 OT 위치가 일정하게 유지될 때 뉴클레오솜이 형성되기 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 뉴클레오솜 풀림 분석법. (A) 언래핑 뉴클레오솜 프로토콜(4단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 뉴클레오솜을 함유하는 DNA 테더를 단백질이 없는 이미지 버퍼를 포함하는 ch. 3으로 이동하여 비드 간 거리를 늘리고 뉴클레오솜을 풀었습니다. (B) 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표적인 키모그래프는 비드 간 거리를 점차적으로 증가시켜 높은 힘으로 당겨졌습니다. 하단 비드로 향하는 형광 강도의 감소는 DNA가 라인 스캐닝 초점에서 약간 기울어졌기 때문일 수 있습니다. (C) 8-37 pN 사이에서 발생하는 내부 회전 언래핑의 힘 유도 전이를 보여주는 관련 FD 곡선. 삽입물은 풀린 거리(개별 뉴클레오솜의 DNA 내부 회전에 대한 ΔL = ~24nm)와 전이 힘(전이 F)을 기록하고 추가로 분석할 수 있는 전이의 예를 확대하여 보여줍니다. 이 테더의 경우 26개의 뉴클레오솜이 풀렸고 테더는 카이모그래프의 흰색 점선으로 표시된 것처럼 ~65pN에서 파열되었습니다. (D,E) 예: LD655-H4 뉴클레오솜 함유 테더는 궤적당 H4의 수가 형광 강도를 통해 추정되고(카이모그래프, D에 표시됨) 래핑된 뉴클레오솜의 수는 힘에 의한 거리 변화의 크기(관련 힘-거리 곡선, E에 표시)를 통해 추정됩니다. (에프,지) (D,E)와 같은 또 다른 예입니다. (H) DNA 테더(n = 5)는 Nap1만 포함하는 채널에서 배양된 후 높은 힘으로 당겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 단백질-염색질 상호 작용 시각화. (A) 염색질 프로토콜에 대한 단백질 결합 시각화(5단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 뉴클레오솜을 함유하는 DNA 테더를 10nM의 Cy3-표지된 링커 히스톤 H1(녹색)을 함유하는 ch. 5로 이동시켰다. (B) 뉴클레오솜 함유 DNA 테더에 결합하는 H1의 대표적인 2색 키모그래프. H1-뉴클레오솜 공동 국소화 이벤트는 흰색 화살표로 표시됩니다. 결합되지 않은 뉴클레오솜 궤적은 자홍색 화살표로 표시됩니다. 벌거벗은 DNA에 확산되는 H1 분자는 녹색 별표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

설명된 프로토콜은 시약 및 시간을 최소화하고 임의의 (잠재적으로 네이티브) DNA 서열을 따라 샤페론 의존성 뉴클레오솜 형성을 가능하게 하는 것을 포함하여 뉴클레오솜 재구성을 위한 여러 이점을 제공합니다. 또한, in situ 분석법은 더 간단한 실험 워크플로우를 가능하게 하고 뉴클레오솜 역학 및 단백질-염색질 상호 작용의 단일 분자 분석으로 편리하게 전환할 수 있습니다. 반면에, 이 접근법의 한계는 DNA를 따라 뉴클레오솜 포지셔닝을 지시할 수 없고(강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열이 통합된 경우에도) DNA 테더당 형성되는 뉴클레오솜의 수를 정밀하게 제어할 수 없다는 것입니다(이는 실험 워크플로우를 표준화하여 경험적으로 조정할 수 있음). 실제로, 이 방법을 선택하는 사람들은 워크플로우 용이성을 높이고 시약 요구 사항을 낮추기 위해 뉴클레오솜 위치 및 밀도를 정밀하게 제어하는 것을 포기하며, 그 선택은 각 특정 실험에 따라 다릅니다. 또한, DNA의 바깥쪽 회전은 테더의 긴 길이(~48.5kbps) 및 완충 조건(32)으로 인해 현재 프로토콜에서 해결되지 않는다는 점에 유의한다. DNA의 외부 회전 및 뉴클레오솜 간 적층에 대한 정보를 얻기 위해, 사용자는 DNA 길이를 줄이고 더 높은 밀도의 뉴클레오솜을 DNA에 로드하는 것을 선택할 수 있으며, 및/또는 염 투석 방법을 사용하여 규칙적인 링커 길이로 분리된 강력한 위치 서열에 뉴클레오솜을 배치할 수 있습니다. 마지막으로, DNA에 대한 히스톤 옥타머의 비특이적 결합이 발생할 가능성이 있습니다. 따라서 결과를 해석할 때 형광 신호와 힘 신호를 모두 고려하는 것이 중요합니다.

현재 프로토콜의 한 가지 중요한 측면은 사용자가 히스톤 옥타머에 대한 높은 형광 표지 속도를 달성하여 전부는 아니더라도 대부분의 뉴클레오솜을 시각적으로 검출할 수 있도록 하는 것입니다. 또 다른 중요한 측면은 사용자가 뉴클레오솜 및 기타 관심 단백질과 호환되는 이미징 채널에 적합한 완충액을 선택했는지 확인하는 것입니다. 프로토콜에 대한 사용자 특정 수정에는 다른 히스톤에 대한 형광단 접합(이 방법을 사용하여 표지된 H3 또는 H2B를 형성하는 예에 대해서는 보고서33,34 참조), 대체 형광단 선택, 다양한 서열 및 길이의 DNA 테더 통합, 형광단의 수명을 연장하기 위해 산소 제거 시스템 추가, 다른 비드 크기 선택, 및 대체 DNA-비드 접합 시스템(예: digoxigenin-anti-digoxigenin 항체 결합)을 활용합니다.

요약하면, 설명된 방법은 생물학에서 다양한 크로마틴 중심 질문을 연구하는 데 쉽게 사용할 수 있는 뉴클레오솜 함유 테더를 생성하기 위한 편리하고 다양한 접근 방식을 smCFFM에 제공합니다. 적용 가능한 연구 분야에는 히스톤 변이체 및 번역 후 변형에 의해 조절되는 염색질 역학, 염색질 결합 단백질의 생물물리학적 관여 및 역학, 생체 분자 응축과 같은 뉴클레오솜 유도 고차원 조립 공정 35,36,37,38이 포함됩니다.

공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

G. N. L. C.는 수상 번호 F31MH132306에 따라 NIH(National Institutes of Health) 산하 국립 정신 건강 연구소(National Institute of Mental Health)의 지원을 인정합니다. S. L.은 Robertson Foundation, International Rett Syndrome Foundation 및 NIH(수상 번호 R01GM149862)의 지원을 받습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x HR 버퍼N/AN/A30 mM  트리스  아세테이트 pH 7.5, 20 mM 마그네슘 아세테이트, 50 mM 염화칼륨, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (인산염 완충 식염수)N/AN/A137 mM 염화나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 10 mM 인산나트륨 이염기성, 1.8 mM 인산칼륨 단염기성 
아세트산, 빙하Millipore SigmaAX0074-6트리스 아세테이트를 만드는 데 사용
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
비오틴-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
비오틴-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
소 혈청 알부민Millipore SigmaA9418-50G용해 H2O에서 0.22 um 필터를 통해 실행
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051냉각 에틸 알코올이 있는 탁상용 원심분리기
, PureMillipore Sigma459844
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)밀리포어 시그마E9884H2O에서 0.5m까지
인간 히스톤 옥타머(H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/A재조합 히스톤 단백질과 표지 돌연변이를 보유한 단백질은 앞서 설명한 바와 같이 사내에서 정제하였다(참고문헌 33, 34, 35, 36 참조). 간단히 말해서, 재조합 히스톤은 BL21 (De3) pLySS 세포 (Promega)에서 발현되었다. 개재체는 초음파 처리 후 분리되었고, 히스톤은 변성 조건에서 추출되었습니다. 히스톤을 완충액 A(7M 요소, 10mM 트리스 하이드로클로라이드 pH 8.0, 100mM 염화나트륨, 1mM EDTA 및 5mM 2-메르캅토에탄올)에 투석하고, 용액을 Q Sepharose Fast Flow(Cytiva)로 로드된 중력 컬럼에 첨가했습니다. 그런 다음 흐름을 SP Sepharose Fast Flow(Cytiva)가 로드된 중력 기둥에 첨가하고, 600mM 염화나트륨이 보충된 완충액 A를 첨가하여 히스톤을 기둥에서 용출시켰습니다. 표지 돌연변이(H4, L50C; H2A, K119C)를 정제한 다음 20:1 염료 대 단백질 몰 비율을 사용하여 말레이미드 기능성 염료(Cytiva, Lumidyne)를 통해 원하는 형광단에 접합했습니다(참조 문헌 33, 34 참조). 히스톤 옥타머는 변성 조건에서 각 야생형 또는 형광단 표지 히스톤의 동일한 몰 비율을 첨가하여 조립하고, 2M 염화나트륨을 함유하는 고염 완충액으로 투석한 다음, 앞서 설명한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피로 정제했습니다(참조 36, 37 참조). 대안적으로, 개별 히스톤 단백질과 기성품 히스톤 옥타머를 상업적으로 구입할 수 있습니다(예: 에피피퍼). 
이미지 버퍼N/AN/A20 mM 트리스 염산염 pH 8.0, 100 mM 염화나트륨
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methylation-free λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)N/A/A자체 제작 정제 재조합 단백질(ref. 38 참조),
LUMICKS C-Trap DymoLUMICXN/A이중 트랩 구성, 제조업체에서 제공하는 기기의 표준 재료
마그네슘 아세테이트 용액Millipore Sigma63052-100MLHR 버퍼를 만드는 데 사용
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SKlenow Fragment 키트에 포함
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GH2O에 용해하고 0.22 um 필터를 통과
칼륨Millipore SigmaP3911PBS 및 HR 버퍼를 만드는 데 사용
인산칼륨 단염기성Millipore SigmaP0662PBS
S. cerevisiae Nap1N/A/ANap1을 만드는 데 사용: 앞서 설명한 바와 같이 사내에서 정제하였다(참고문헌 33, 34 참조). 대안적으로, Nap1은 상업적으로 구매될 수 있다(예를 들어, Active Motif).
아세트산 나트륨Millipore 시그마241245H2O에 용해 3m
염화나트륨Millipore SigmaS9888PBS 및 이미지 버퍼를 만드는 데 사용
인산나트륨 이염기성Millipore SigmaS9763PBS
SPHERO 비오틴 코팅 입자 (3.0-3.4 µ m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계Fisher ScientificND2000NanoDrop 분광 광도계
Tris BaseFisher ScientificBP152-500H2O에 용해하고 적절한 pH로 조정; 이미지 버퍼 및 트리스 아세테이트를 만드는 데 사용
는 , N 염화 N

참고문헌

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