방법 논문

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

2.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

2024년 5월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

초록

적응 면역 반응은 병원체와 이물질에 반응하여 혈액, 림프 및 조직을 통해 이동하는 T 세포의 능력에 의존합니다. T 세포 이동은 케모카인, 케모카인 수용체 및 접착 분자를 포함한 환경 및 국소 면역 세포의 많은 신호 입력의 조정이 필요한 복잡한 과정입니다. 또한 T 세포 운동성은 활성화 상태, 전사 환경, 접착 분자 발현 등을 변경할 수 있는 동적 주변 환경 단서의 영향을 받습니다. 생체 내에서는 겉으로 보기에 서로 얽혀 있는 것처럼 보이는 요인들의 복잡성으로 인해 T 세포 이동에 기여하는 개별 신호를 구별하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 매우 특정한 환경 조건에서 실시간으로 T 세포 이동을 평가하기 위해 T 세포 분리에서 컴퓨터 지원 분석에 이르기까지 일련의 방법을 제공합니다. 이러한 조건은 이동을 조절하는 메커니즘을 규명하고, T 세포 동역학에 대한 이해를 높이고, 동물 실험을 통해 얻기 어려운 강력한 기계론적 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 개선된 치료법을 개발하는 데 중요합니다.

서론

T 세포는 적응형 항원 특이적 면역 반응의 주요 효과인자입니다. 집단 수준에서 T 세포는 이질적이며, 뚜렷한 특수 기능을 가진 세포 하위 집합으로 구성됩니다. 중요한 것은 CD8+ T 세포가 면역 체계의 주요 세포 용해 효과인자로, 감염되거나 기능 장애가 있는 세포를 직접 제거한다는 것입니다1.

성숙한 CD8+ T 세포는 조직에 상주하며 항원을 찾기 위해 혈액과 림프관을 순환합니다. 감염 중에는 T 세포에 혈액이나 조직에 항원이 제시되고 비장이나 가장 가까운 배수 림프절로 빠르게 배출되어 생산적인 면역 반응을 시작합니다. 어느 경우에나, T 세포는 활성화되고, 클론 확장을 겪으며, 림프계가 혈액 속으로 들어가도록 내버려 둔다. 이 과정에서 세포내 신호전달은 림프 귀환 수용체(lymphatic homing receptor)의 하향 조절과 조직 특이적 이동에 필수적인 수많은 인테그린 수용체(integrin receptor)와 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 상향 조절을 부여한다2. 궁극적으로, T 세포가 감염 부위로 직접 이동하는 것은 인테그린(integrin)과 케모카인(chemokine) 신호전달을 포함하는 환경적 신호의 수렴에 의해 주도됩니다.

케모카인은 크게 두 가지로 분류할 수 있습니다: (1) 분화, 생존 및 기초 기능에 필수적인 항상성 신호와 (2) 화학주성에 필요한 CXCL9, CXCL10, CCL3와 같은 염증 신호. 일반적으로 케모카인은 인테그린 발현1을 활성화하는 것 외에도 화학주성(chemotaxis)으로 알려진 방향성 이동을 촉진하는 신호 구배를 생성합니다. 화학주성은 미세하게 조절되고 매우 민감하며, T 세포는 특정 방향이나 위치로 유도할 수 있는 구배의 작은 변화에 반응할 수 있습니다.

이러한 T 세포 관련 요인 외에도 이동은 세포외 기질(ECM) 조성 및 밀도에 의해서도 영향을 받습니다. ECM은 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함한 단백질의 조밀한 네트워크로 구성되어 있으며, 이들은 T 세포의 접착 인테그린 수용체에 대한 골격을 제공합니다. 인테그린(Integrins)은 다양한 막관통 단백질군으로, 각 단백질은 고도로 전문화된 결합 도메인과 다운스트림 신호 효과를 가지고 있습니다. T 세포 표면에서 인테그린 수용체의 동적 발현은 변화하는 환경에 빠르게 적응할 수 있도록 합니다3. 중요한 것은 인테그린이 ECM과 세포 내 세포골격 액틴 네트워크를 연결하여 T 세포 이동에 필요한 추진력을 생성한다는 것입니다.

요약하면, 이동 패턴은 면역 세포 표현형 또는 환경 신호에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 생물학적 과정은 T 세포, 주변 세포 및 국소적으로 감염된 조직의 표면에서 사이토카인, 케모카인 및 인테그린의 발현에 의해 엄격하게 조절됩니다. 생체 내에서, 이러한 이동 메커니즘은 복잡할 수 있으며, 여러 가지 부가적 신호(additive signal)4에 의해 발생할 수 있다. 이러한 복잡성으로 인해 겉보기에 서로 맞물려 있는 것처럼 보이는 변수 간의 인과 관계를 설정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 특정 케모카인 신호에 대한 반응 및 T 세포 인테그린과 ECM 결합 단백질 간의 상호 작용과 같은 T 세포 이동의 특정 측면을 연구하기 위한 몇 가지 시험관 내 접근 방식이 있습니다. 이 프로토콜은 2차원 공간에서의 체외 이동 분석과 지정된 T 세포 이동을 분석하기 위한 계산 분석 도구를 사용하여 쥐 CD8+ T 세포를 분리하고 활성화하는 방법을 다룹니다. 이러한 방법은 문헌에 기술된 일부 다른 세포 이동 분석법과 같이 정교한 재료나 장치를 필요로 하지 않기 때문에 사용자에게 유리합니다. 이러한 방법으로 생성된 세포 이동 데이터는 생체 내에서 정보에 입각한 추가 조사를 가능하게 하는 단순한 방식으로 면역 반응의 증거를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

동물 프로토콜은 로체스터 대학의 동물 자원에 관한 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구의 마우스는 로체스터 대학 동물 시설의 병원체가 없는 공간에서 유지되었습니다. 본 연구에는 6-12주(15-30g)의 수컷/암컷 C57BL/6마리 마우스가 사용되었습니다. 마우스 조직 분리는 손을 가리는 장갑과 코와 입을 가리는 안면 마스크가 있는 벤치탑 또는 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행할 수 있습니다. 모든 세포 배양 및 플레이트 준비는 생물안전 작업대에서 수행해야 합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. CD8+ T 세포 정제 및 활성화

  1. 재료 준비
    1. CD8+ T 세포의 음성 선택: 각각 anti-CD4 및 anti-MHCII를 생성하는 하이브리도마 세포주 GK1.5 및 M5/114 항체의 상층액에서 negative selection 배지를 준비합니다. 상층액을 1:1 비율로 혼합하고 여과한 다음 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관합니다(각 항체의 >0.5μg/총 세포 100만 개). 또는 상용 CD8+ T 세포 분리 키트를 사용할 수 있습니다.
    2. T 세포 활성화: 1x DPBS(칼슘 및 마그네슘 제외) 항체에 500μL의 CD3(10μg/mL) 및 CD28(16μg/mL) 항체를 비조직 배양(TC) 처리된 24웰 플레이트에 추가하고 플레이트 결합을 보장하기 위해 4°C에서 밤새 보관합니다.
      참고: 항체 및 단백질은 일반 TC 처리된 것보다 TC를 처리하지 않은 배양 플레이트/접시를 더 잘 코팅하므로 TC를 처리하지 않은 배양 플레이트가 T 세포 생성에 사용됩니다.
  2. 70μm 세포 여과기를 접시에 넣어 10cm 배양 접시(또는 이에 상응하는 것)를 준비하고 2mL의 R9 배지를 필터에 분배합니다(R9 배지: 10% FBS, 1% 항생제-항진균제, 20mM HEPES 완충액, 1% MEM 비필수 아미노산, 50μM β-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640x).
  3. 실험 설계에 의해 결정된 적절한 유전적 배경, 성별, 연령 및 체중을 가진 마우스를 얻습니다.
  4. CO2 를 사용한 후 자궁 경부 탈구를 사용하거나 지역 동물 관리 및 사용 프로토콜에 의해 정의되고 기관에서 승인한 적절한 안락사 전략을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
  5. 마우스를 누운 자세로 놓고 네 팔다리를 모두 몸에 수직으로 뻗은 다음 마우스 해부 T 핀 또는 이와 동등한 핀을 사용하여 발판에 발판을 고정합니다. 마우스 수술용 해부 가위로 복부 하복부의 피부층을 통해 표재성 중앙을 절개하고 턱까지 직선(~8cm)으로 자릅니다. 복막 내벽에서 피부를 분리하여 림프절을 노출시킵니다. 몸통에서 피부를 수직으로 펴고 핀으로 고정합니다5.
    1. 뭉툭한 집게(또는 표준 마우스 수술 해부 키트에서 선호되는 유형)를 사용하여 경추, 축, 상완 및 서혜부 림프절을 양측으로 부드럽게 절제합니다. 1.2단계에서 준비한 세포 여과기로 옮깁니다.
    2. 복막을 열고 비장을 제거합니다. 1.2단계에서 준비한 세포 여과기로 옮깁니다.
    3. 쥐 사체를 적절한 생물학적 위험 용기에 버리십시오.
  6. 1.2단계에서 2mL의 R9 배지를 사용하여 70μm 세포 여과기에 기계적 파괴에 의한 2차 림프 조직의 단세포 현탁액을 준비합니다. 조직 파괴 도구를 시계 방향 및 반시계 방향으로 반복적으로 1/2바퀴 돌립니다.
    참고: 루어 락 주사기의 플런저 끝(3mL 또는 10mL)은 조직을 분쇄하고 균질화하는 데 효과적입니다. 대체 재료는 사용자의 재량에 따라 사용할 수 있습니다.
  7. 세포, 주사기 끝, 여과기 및 배양 접시를 7mL의 배지로 세척하고 여과기가 똑바로 유지되도록 하여 단일 세포 현탁액에 존재할 수 있는 더 큰 조직 조각 또는 세포 응집체가 전달되지 않도록 합니다.
  8. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  9. 실온(20°C)에서 270 x g으로 5분 동안 세포를 펠렛하고 상층액을 디캔팅합니다.
  10. 500μL의 용해 완충액을 1분 동안 첨가하여 적혈구를 제거합니다. 9.5mL의 R9 배지로 희석하고 270 x g(20°C)에서 5분 동안 회전합니다. 상층액을 디캔팅합니다.
  11. 항-MHCII 및 항-CD4를 포함하는 이전에 제조된 음성 선택 배지 10mL에 펠릿을 현탁시킵니다(단계 1.1.1). 실온(20°C)에서 30분 동안 락합니다.
  12. 세포를 270 x g 에서 5분 동안 펠릿하고 상층액을 디캔팅합니다. R9 배지 10mL로 3회 세척합니다.
  13. 동시에 15mL 원뿔형 튜브에서 7mL의 배지에 200μL의 양 항쥐 IgG 비드를 세척합니다. 튜브를 자석에 놓고 매체를 제거한 다음 세탁 단계를 두 번 반복합니다. 비드를 7mL의 R9 배지에 재현탁시킵니다.
  14. 270 x g (20 °C)에서 5분 동안 세포를 펠릿하고 상층액을 디캔팅한 다음 1.13단계에서 7mL의 비드 현탁액에 펠릿을 재현탁시킵니다. 실온(20°C)에서 45분 동안 흔들어 놓습니다.
  15. 마그네틱 비드 고갈(magnetic bead depletion)을 통해 CD8+ T 세포를 농축합니다. 원뿔형 튜브를 뚜껑 없이 자석에 직접 올려 3분 동안 항체/비드 결합 세포를 제거합니다. CD8+ 세포는 유지되어야 합니다. 튜브가 여전히 자석에 있는 상태에서 혈청학적 피펫 또는 이와 동등한 것을 사용하여 세포 현탁액을 수집하고 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 270 x g (20 °C)에서 5분 동안 원심분리하고 매체에서 3번 세척합니다.
  16. 플레이트 바닥 표면에 직접 피펫팅하지 않고 사전 코팅된 활성화 플레이트(1.1.2단계)를 1x DPBS로 두 번 세척합니다.
  17. 선택 사항: 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 림프구 분리를 수행합니다.
    1. 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액 바닥에 2mL의 림프구 분리 배지를 부드럽게 추가합니다. 900 x g 에서 낮은 가속 및 감속으로 10분(실온에서) 원심분리합니다.
      참고: 살아있는 세포는 배지와 분리 매체(중간 백색층)의 계면에서 분리됩니다. 죽은 세포는 튜브 바닥에서 펠릿으로 만들어지며 끝에서 버려질 수 있습니다.
    2. 살아있는 림프구가 포함된 중간층을 새 튜브로 옮기고 실온에서 270 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅합니다.
  18. 펠릿을 10U/mL 재조합 마우스 IL-2와 함께 12mL의 배지에 재현탁시킵니다. 비 TC 처리된 24웰 플레이트에서 웰당 1mL를 플레이트하고 밤새 37°C로 옮깁니다.

2. 활성화된 CD8+ T 세포 리프팅

  1. 4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하는 표준 탁상용 광학 현미경을 사용하여 세포를 시각화합니다.
    참고: 활성화된 T 세포는 비활성화된 T 세포에 비해 더 크고 둥글거나 길쭉해 보이며 웰 전체에 조밀한 세포 클러스터가 있어야 합니다.
  2. 활성화된 세포를 들어 올리려면 1mL 피펫으로 세포를 파괴하고 플레이트 가장자리에서 잘 섞이도록 합니다. 세포를 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
    참고: 활성화된 세포는 더 끈적거리며 더 활발한 피펫팅이 필요합니다.
  3. R9 배지 1mL로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 제거합니다. 필요한 경우 한 번 더 반복합니다. 270 x g (20 °C)에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
  4. 1.17-1.18단계와 같이 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 림프구 분리를 수행합니다.
  5. non-TC 6-well plate에서 IL-2와 함께 R9 배지에서 3-4일마다 살아있는/죽은 세포를 제거하여 T 세포를 유지합니다.
    참고: T 세포는 초기 활성화 동안 작은 치수의 웰에서 더 잘 증식하는데, 이는 T 세포-T 세포 접촉 또는 T 세포 유래 용해성 인자가 활성화를 돕기 때문일 수 있습니다. 빠른 T 세포 증식은 배양 후 24-48시간 이내에 배양 배지를 황색으로 만듭니다. 이 시점에서 세포를 들어 올려 세포에 공급하기에 충분한 신선한 배양 배지(일반적으로 웰당 5mL)가 있는 더 큰 웰(코팅되지 않은, 비TC 6-웰 플레이트)로 옮깁니다. 고갈된 매체는 노란색 매체 색상 변경이 표시될 때마다 또는 3-4일마다 새 매체로 교체하십시오.

3. 유리 접시의 준비

  1. 4°C에서 하룻밤 동안 300μL/cm2 Protein A(0.1mg/mL)로 코팅하여 유리 세포 이동 챔버 또는 플레이트를 준비하고 다음 단계로 이동하기 전에 접시에 분배하고 디캔팅하여 1x DPBS로 두 번 세척합니다.
  2. 이동 챔버 또는 플레이트를 300 μL/cm2 재조합 마우스 ICAM-1 또는 VCAM-1 Fc 키메라(0.1-2.75 mg/mL)와 재조합 마우스 케모카인(0.1-10 μg/mL)으로 실온에서 2-3시간 동안 코팅합니다. 피브로넥틴(fibronectin), 마우스 콜라겐 IV(mouse collagen IV) 및 마우스 E-cadherin과 같은 다른 인테그린 리간드는 4°C에서 하룻밤 동안 2.5-10μg/mL로 챔버를 직접 코팅하도록 렌더링됩니다.
    1. 접시에 디스펜싱하고 셀을 추가하기 직전에 디캔팅하여 1x DPBS로 챔버를 두 번 세척합니다.
      참고: T 세포는 활성화, 분화, 감작 및 프라이밍 상태에 따라 다양한 농도의 인테그린 리간드 및 케모카인에서 다르게 이동할 수 있습니다. 다양한 농도에서 세포 이동을 분석하는 것이 강력히 권장됩니다.
  3. T 세포를 암세포와 같은 다른 세포와 공동 배양하는 경우 이미징 시작 24시간 전에 부착 세포를 유리 코팅된 플레이트에 플레이트하여 암세포의 T 세포 사멸을 실시간으로 측정합니다.

4. 세포의 준비

  1. 선택 사항: 37°C에서 15분 동안 또는 제조업체의 프로토콜에 따라 1x DPBS에서 1 x 10 7 세포당 1 x 107 세포당 1μg/mL의 원하는 세포 추적기 염료를 사용하여 T 세포 및 부착 세포를 염색합니다.
  2. 혈구계 또는 이와 동등한 것을 사용하여 세포를 계수합니다.
  3. 37 °C 챔버에서 1-5 g/L 포도당이 보충된 Leibovitz의 L-15 배지에 있는 플레이트 1 x 105 CD8+ T 세포(또는 원하는 양).
    알림: L-15 매체는 CO2-중탄산나트륨 시스템 없이 사용하도록 제조되었습니다. 유리 염기성 아미노산, 인산염 완충액 및 갈락토스를 사용하여 완충되어 pH 수준을 유지합니다.
  4. 선택 사항: 인테그린 블로킹을 수행합니다.
    1. 인테그린(1-10 μg/mL, anti-mouse CD11a(M17/4), anti-mouse CD18(M18/2), anti-mouse VLA-4(9C10)에 대한 차단 항체로 T 세포를 10분 동안 사전 배양하고 동일한 항체가 있는 상태에서 크롤링할 수 있도록 합니다.

5. 타임랩스 현미경

  1. 비디오 현미경 검사를 수행합니다.
  2. T 세포의 경우, 10-60분 동안 10-60초마다 명시야 및 형광 이미지를 획득하거나 원하는 획득 설정을 획득합니다.
    참고: T 세포 이동은 온도에 민감하며 마우스 T 세포 이동을 위한 최적의 온도는 37°C입니다. 이 프로토콜이 사용하는 온도 제어 시스템은 가열 시스템이 부착된 밀폐형 및 절연 현미경 데크로 구성됩니다. 이미징 챔버는 이미징 데크에 있습니다. 이 챔버의 둘레에는 이미징 중에 일관된 열과 습도를 허용하는 증류수로 채워진 우물이 있습니다. 마이크로웰은 이미징 챔버의 중앙에 위치합니다.

6. T 세포 이동에 대한 소프트웨어 지원 분석

  1. Volocity 소프트웨어를 사용하여 T 세포 이동을 평가할 수 있습니다.
    1. Volocity를 열고 새 이미지 시퀀스를 만듭니다.
    2. 모든 타임랩스 비디오 현미경 동영상을 선택하여 Volocity의 파란색 영역으로 이동합니다.
    3. 대비 향상 도구를 사용하여 연구자가 원하는 설정으로 밝기와 대비를 조정합니다.
    4. 이미지 크기 확인: 20x의 경우 0.325μm, 10x의 경우 0.65μm.
    5. 순서: 시점을 설정합니다(예: 20분 동안 15초마다 이미지를 촬영하는 경우 81개 이미지, 분당 4개).
    6. 측정 탭에서 모든 시점을 선택 취소합니다.
    7. 강도를 사용하여 물체를 찾고 막대를 밀어 피크의 바로 오른쪽에 오도록 합니다.
    8. 크기별로 개체 제외: 직경이 10μm보다 작고 100μm보다 큰 모든 셀은 셀 파편 또는 비세포 입자를 제외합니다. 기록 시간의 20% 미만 동안 이동하는 T 세포는 제외합니다(각 연구자의 정의에 따라 다를 수 있음).
    9. 정적 개체를 무시 합니다(확인란).
    10. 끊어진 tract를 자동으로 결합 합니다(확인란).
    11. 최단 경로를 20μm 이하로 설정합니다.
    12. 셀 이동 추적은 시간이 지남에 따라 동일한 셀의 위치를 연결하는 선입니다. 추적 알고리즘이 각 프레임의 세그멘테이션을 통해 개별 개체가 감지되는 위치를 감지하여 추적하고 있는지 확인하고 개체가 프레임 간에 일치하는지 확인합니다.
    13. [Measurements] > [Save Protocol] > [Name New Protocol]을 선택하여 새 프로토콜을 저장합니다.
    14. 측정 탭에서 모든 시점 측정을 클릭합니다.
    15. 시간 범위(높음에서 낮음)별로 트랙을 정렬합니다.
    16. 조사관이 정의한 대로 양호한 추적이 있는 모든 셀에 대한 추적 ID 번호를 기록합니다. 자동 세포 추적 후에는 잘못 식별되거나 끊어진 추적을 제외하기 위해 각 세포 추적에 대한 수동 평가가 필요합니다. 추적 결과가 잘못된 셀은 제외합니다.
    17. 파일을 쉼표로 구분된 텍스트로 내보내고 원하는 분석 소프트웨어로 데이터를 전송합니다.
      참고: 기본 매개변수: 속도(μm/min), 변위(순 이동, μm), 트랙 길이(총 경로 길이, μm) 및 구불구불한 지수(MI; 순 변위/트랙 길이. MI = 1은 완전히 직선 선형 트랙을 나타냄).
  2. 이미지 J를 사용하여 수동 추적을 수행합니다.
    1. 플러그인을 열고 추적 및 수동 추적을 선택합니다. 매개변수를 설정합니다 - 시간 간격, x/y 보정(픽셀 크기) 및 z 보정(수동 추적 모드에서). 트랙 추가를 클릭하고 첫 번째 시점에서 하나의 셀을 선택한 다음 모든 시점까지 계속하여 개별 셀 추적을 시작합니다. 그런 다음 트랙 종료를 클릭합니다. 관심 있는 모든 셀에 대해 이 작업을 반복합니다.
      알림: 세포 추적을 위한 또 다른 도구인 Trackmate는 ImageJ 플러그인을 통해 사용할 수 있는 자동 추적 소프트웨어입니다.

결과

T 세포 활성화의 확인은 유세포 분석을 통해 달성할 수 있으며, 쥐 T 세포에서 활성화의 표준 마커인 CD69 및 CD44의 발현 증가를 확인할 수 있습니다6. 또한 T 세포 집단의 순도는 CD3+ CD8+ T 세포에 대한 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 >90 % CD8+ T 세포 집단을 생성합니다.

T 세포 이동은 연구자의 요구에 맞게 재현 가능하고 조정 가능한 소프트웨어 지원 세포 추적 프로그램으로 평가할 수 있습니다. 실험 효과를 결정하는 데 사용되는 몇 가지 기본 매개변수에는 세포 속도(세포가 얼마나 빨리 이동하는지 결정하기 위해 주어진 시간당 이동 길이), 변위(이동 거리, 세포가 이동하는 거리를 결정하기 위한 시작점에서 끝점까지의 직선), 추적 길이(이동 거리, 세포가 이동하는 거리를 결정하기 위한 이동 경로의 총 길이)가 포함됩니다. 및 구불구불한 지수(MI는 이동의 직진도를 결정하기 위해 0과 1 사이, 1 = 직선). 이러한 파라미터는 CXCL12가 있는 ICAM-1 코팅 유리를 따라 기어다니는 미성숙 및 활성화된 CD8+ T 세포의 이동 차이를 평가하는 데 사용됩니다(그림 1). 활성화된 CD8+ T 세포에서 naive에 비해 평균 속도, 변위 및 구불구불한 지수가 증가했으며, 이는 활성화된 T 세포가 이동 능력이 증가했음을 나타냅니다. 유사하게, 세포 이동 패턴에 대한 다양한 케모카인의 영향은 이러한 방법으로 설명할 수 있습니다. 예를 들어, 활성화된 CD8+ T 세포는 CXCL12가 있을 때 이동이 증가하지만 CCL2 또는 CCL22는 나타나지 않으며, 이동은 용량 의존적 방식으로 포화 농도로 증가합니다(그림 2). 또한 소프트웨어 지원 세포 추적을 통해 개별 세포 이동의 특성을 분석할 수 있으므로 개별 리간드가 T 세포 거동에 미치는 영향을 이해할 수 있습니다. 대표적인 세포 트랙은 그림 3에서 볼 수 있습니다.

이러한 데이터를 종합해 볼 때, (1) 개별 세포 단위로 세포 이동을 추적하고, (2) 활성화 상태와 다양한 케모카인 및 접착 분자의 존재 여부에 따라 CD8+ T 세포의 이동 차이를 구별할 수 있음을 확인함으로써 현재 방법의 효능을 뒷받침합니다. 이 분석은 복잡한 신호 전달 메커니즘을 해부하고 세포 유형별 방식으로 특정 신호의 생물학적 기여도를 추가로 다룰 수 있는 집중적인 생체 내 실험에 대한 정보를 제공하는 데 중요한 단계입니다.

figure-results-1
그림 1: naive 및 activated CD8+ T 세포 이동에 대한 In vitro 분석. Naive(나이브) 또는 CD3/CD28-활성화된 마우스 CD8+ T 세포는 ICAM-1과 CXCL12에서 10분 동안 이동하도록 허용하였다. 세포 이동의 속도, 변위 및 사행(mewinding) 지수는 타임랩스 현미경과 Volocity를 사용하여 분석했습니다. 각 그룹에는 36개의 개별 T 세포(평균 ± SEM)가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 활성화된 CD8+ T 세포의 케모카인 의존성 이동을 위한 In vitro 분석. CD3/CD28 활성화 마우스 CD8+ T 세포는 ICAM-1과 지시된 케모카인에서 이동할 수 있었습니다. 20분 동안 50μm 이상 크롤링하는 세포 수의 비율(전체의 백분율)은 시야에서 결정되었습니다. 단일 분석으로 >10개의 세포를 분석했습니다(n = 그룹당 3개의 분석은 SEM을 평균±). 대조군과 비교하여 쌍을 이루지 않은 t-검정, *p< 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 20분 동안 ICAM-1과 CXCL12에서 활성화된 CD8+ T 세포의 이동 경로. 각 컬러 선은 세포 지점에서 반대 방향으로 각 T 세포의 이동 경로를 나타냅니다. 이 특정 분석에서 38개 세포 중 24개가 상당한 길이(적어도 우리의 정의에 따르면 세포 너비의 거리)로 이동했습니다. T 세포는 서로 다른 거리로 이동했는데, 이는 각 세포가 서로 다른 활성화 또는 프라이밍 상태에 있었음을 나타냅니다. 모든 이동하는 세포는 표면이 균일하게 코팅된 조건에서 서로 다른 방향으로 움직였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

생체 내 수렴 신호의 생물학적 영향을 이해하는 것은 어렵고 해석하기도 쉽지 않습니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 고도로 정의되고 생물학적으로 유의미한 조건에서의 T 세포 이동을 이해하기 위한 합리적인 방법을 제공한다. 이러한 조건은 연구자의 재량에 따라 지정할 수 있으며 다양한 T 세포 집단, 활성화 상태 및 세포 표현형의 요구에 맞게 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 또한, 많은 리간드와 수용체는 이러한 정의된 항체 차단(7,8) 및 리간드 코팅된 유리 절차(8,9,10)를 통해 조사할 수 있습니다. 이 기술은 또한 공학적 면역 세포11,12를 개발하기 위한 중요한 플랫폼이었습니다.

프로토콜의 중요한 단계에는 2차 림프 조직의 분리, T 세포의 활성화, 유리 이미징 접시의 코팅 및 데이터 분석이 포함됩니다. 경험이 없는 눈에는 조직에 박혀 있는 림프절을 식별하고 추출하기 어려울 수 있습니다. 이것은 연습으로 극복할 수 있습니다. T 세포를 분리하고 정제한 후에는 활성화 단계를 통해 끈적끈적한 세포가 생성되며, 제대로 들어올리지 않으면 수율이 낮아질 수 있습니다. 이것은 우물을 넉넉하고 조심스럽게 씻음으로써 피할 수 있습니다. 유리 접시는 관심 리간드로 적절하게 코팅하고 세포를 추가하기 전에 세척해야 합니다. 이렇게 하면 세포가 부착할 수 있는 견고한 단백질 층을 사용할 수 있으며 과도한 시약이 생물학을 방해하지 않도록 할 수 있습니다. 생리학적 pH 및 염 농도에서 단백질 A-유리 표면 결합 및 Fc-단백질 A 결합은 완충액을 부드럽게 붓고 디캔팅할 때 씻겨 내려가지 않을 만큼 충분히 강합니다. 배지에 잔류 단백질(있는 경우)은 독성을 일으키지 않지만, 결합되지 않은 리간드가 고농도인 경우 결합된 리간드와의 세포 상호 작용을 방해할 수 있습니다. 코팅된 유리를 몇 번 헹구면 이 가능성을 배제할 수 있습니다. 마지막으로, 연구자들이 세포 동작과 형태에서 미묘한 차이조차 감지할 수 있도록 하는 사용자 친화적인 상용 및 비상용 소프트웨어가 많이 존재합니다. 소프트웨어가 범할 수 있는 오류를 배제하기 위해 분석된 결과를 수동으로 확신시키는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다.

T 세포 정제 및 활성화 방법은 in vivo 관찰을 요약하기 위해 적절한 세포 상태 및 표현형을 얻기 위해 연구자의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 다양한 세포 유형 및 상태를 사용하여 감염 및 면역 반응의 다양한 기전을 다룰 수 있다 7,8,9,10,11,13, 조직 특이적 조건에서 미성숙 및 기억 T 세포 행동 및 프라이밍 및 모집과 같은 기억 반응의 다양한 측면을 다루는 것이 포함된다14. 이 방법은 세포 간 접촉 시간 및 지속 시간 7,9, 항원 제시 9,13 및 표적 세포 사멸6을 포함한 세포 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 다양한 세포 유형과의 공동 배양에 사용할 수 있습니다. 추가적인 리포터 및 라벨을 사용하여 세포 내 구조7, 과립15, 세포 사멸6 등을 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜은 단순화되고 고도로 정의된 조건에서의 관찰을 기반으로 추가적인 in vivo 실험을 안내하는 훌륭한 도구입니다. 세포 운동성의 체외 평가는 매우 환원적일 수 있지만 복잡한 생물학적 활동을 분해하는 데 중요한 단계입니다. 이러한 실험의 결과를 통해 연구자는 생리학적으로 보다 관련성이 높고 표적화된 방식으로 생체 내 작업에 접근할 수 있습니다.

이 방법의 단순성은 또한 주요 제한 사항을 나타냅니다. in vivo 활동을 대표하지만, 모든 결과는 예를 들어 intra-vital multiphoton 현미경을 사용하여 추가로 확인할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 brightfield microscope 및/또는 epifluorescence microscope를 사용하여 디지털 카메라를 현미경 시스템에 통합하거나 스코프의 대물렌즈에 별도로 장착하여 연구실에서 완전히 사용할 수 있는 가장 간단한 방법 중 하나입니다. 반면에 체외 면역 세포 이동의 고급 분석을 위한 더 많은 옵션이 있습니다. 첫째, 면역 세포는 종종 생물학적 시스템의 케모카인 구배에 의해 주도됩니다. 케모카인 구배(chemokine gradient) 하에서 면역 세포 거동을 분석하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 한 가지 간단한 방법은 특별히 설계된 슬라이드를 사용하는 것입니다(재료 표 참조). 이 채널형 웰 시스템은 바닥이 인테그린 리간드로 코팅되어 있을 때 정적 케모카인 그래디언트에서 면역 세포 이동을 분석할 수 있습니다. 면역 세포 화학주성에 대한 다른 간단한 분석법으로는 케모카인16을 방출하는 마이크로피펫 팁으로의 세포 이동에 대한 시간 경과 현미경 검사, 아가로스 분석17 및 지그몬드 챔버18이 있습니다. 제어된 chemokine gradients에서 보다 정교한 이동 분석을 위해서는 미세유체 gradient 발생기가 있는 맞춤형 슬라이드가 필요합니다19,20. 둘째, 면역 세포는 다양한 메커니즘을 사용하여 고유한 물리적 조건에서 이동할 수 있으며, 때로는 리간드에 대한 인테그린 의존적 접착을 사용하지 않고도 이동할 수 있습니다. 1차원의 시험관 내 이동 분석은 인테그린 리간드 코팅의 유무에 관계없이 수행될 수 있으며 모세관 혈관(21,22)에서 면역 세포의 운동성을 재현합니다. 또 다른 옵션은 세포(25,26)의 간질 이동의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위해 3차원 공간(23,24)에서 세포 이동 분석이다. 전반적으로, 우리는 역동적인 세포 이동 이벤트를 연구하기 위한 간단하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 방법을 설명했습니다.

공개 사항

저자는 모든 연구 및 원고 준비가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

감사의 글

우리는 시간이 지남에 따라 이러한 프로토콜의 개발에 기여한 Kim Lab의 이전 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 대표 데이터는 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States 및 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States에 의해 가능했습니다. 이 간행물은 Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award의 보조금 번호 T32 GM135134 덕분에 부분적으로 가능했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 접시Corning353003또는 동급
15mL 원추형 튜브ThermoFisher339650또는 동급
1x DPBSGibco14190144칼슘 및 마그네슘 미포함
6웰 플레이트, 비-TC 처리Corning3736또는 동급
70 µ m cell strainerFisherScientific352350또는 동급
ACK 용해 완충액ThermoFisherA1049201또는
동급 Allegra 6KR 원심분리기ThermoScientificsorvall 16R(tx400 3655 로터 및 버킷 포함또는
동급 베타 메르캅토에탄올SigmaM3148또는 동급
CellTrace VioletThermoFisherC34571또는 동급
원심분리기ThermoScientificSorvall, ST 16R또는 동급
의 콜라겐(IV),코닝, 354233또는 동급
DeltaT 배양 접시, .17mm 두께의 투명 유리Bioptechs,04200417C
Dynabeads Sheep, anti-Rat IgG, Invitrogen11035
DynaMag 15, MagnetThermoFisher Scientific12301D또는 동급
, Easy sep 마우스 T 세포 분리 키트, 줄기 세포19851
FBS,SigmaAldrichF2442-500ML또는 동급
의 Fibronectin, SigmaAldrich10838039001또는 동급
Fijihttp://fiji.sc/weblink
, 필터 큐브,Nikon 또는 Olympus
GK1.5ATCC, TIB-207
HEPES,ThermoFisher15630080또는 동급
HQ, CCD 카메라, CoolSNAP또는 동급
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ 자동 추적 플러그인http://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ 수동 추적 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html플러그인 weblink
L-15다양한재료 참조매체 레시피: Leibovitz' 포도당 1-5g/L가 보충된 페놀 레드(Gibco)가 없는 L-15 배지
Liebovitz의 L-15 배지, 페놀 레드없음 ThermoFisher21083027
Luer Lok 일회용 주사기FisherScientific 14-955-459또는 동급
림프구 분리 배지Corning25-072-CI또는 동급
M5/114ATCCTIB-120
MEM 비필수 아미노산ThermoFisher11140050또는 이에 상응하는
현미경 가열 시스템Okolabokolab.com맞춤형 디자인 가능
Millicell EZ slideMilliporeC86024
Mojosort 마우스 CD8+ Naï ve T 세포 분리 키트Biolegend480043
마우스 E-cadherinR& D 시스템8875-EC-050또는 동급
마우스 외과 해부 키트, Fisher Scientific13-820-096또는 동급
NIS 요소,NikonSoftware
non-TC 24wpCorning353047또는 동급
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher15140122또는 동급
단백질 AThermoFisher Scientific또는 동급
R9다양한참조 재료매체 레시피: RPMI 1640x에 10% FBS, 1% 항생제-항진균제(Gibco), 20mM HEPES 완충액(Gibco), 1% MEM 비필수 아미노산(Gibco), 50 μ M β-메르캅토에탄올 (Sigma-Aldrich)
재조합 마우스 ICAM-1 Fc 키메라R& D 시스템796-IC-050또는 동급
재조합 마우스 IL2Biolegend575410또는 동급
RPMI, 1640x, ThermoFisher11875093또는 동급
T 핀Fisher ScientificS99385또는 동급
TE2000-U 현미경Nikon또는 동급
다양한 재조합 마우스 케모카인R& D 시스템또는 동급
VCAM-1 Fc 키메라R& D systems643-VM-050또는 동급
VolocityPerkinElmer소프트웨어
, , , ) 의 , 의 , , , , , , 의 , , , , , 의 , 의 의 , 의 , 의

참고문헌

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

재인쇄 및 허가

태그

TCD8 T
일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.