이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.
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방법 논문
합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템은 합성 세포의 상향식 조립을 용이하게 하기 위해 널리 사용되어 왔습니다. 그것은 Central Dogma의 핵심 기계의 호스트 역할을 하며, 다양한 인공 세포 모방 시스템의 통합 및 조립을 위한 최적의 섀시로 서 있습니다. 합성 세포 제조에 자주 사용됨에도 불구하고 특정 응용 분야에 대한 맞춤형 및 강력한 CFPS 시스템을 구축하는 것은 여전히 사소한 과제로 남아 있습니다. 이 방법 논문에서는 합성 전지를 구성하는 데 일상적으로 사용되는 CFPS 시스템에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 세포 추출물, 템플릿 준비 및 형광 리포터 단백질을 활용한 일상적인 발현 최적화를 포함하여 CFPS 시스템 준비의 주요 단계를 포함합니다. 또한 단층 액적, 이중 에멀젼 소포 및 지지된 지질 이중층 위에 위치한 챔버와 같은 다양한 마이크로 구획 내에 CFPS 시스템을 캡슐화하여 대표적인 결과를 보여줍니다. 마지막으로, 서로 다른 환경에서 이러한 CFPS 시스템을 성공적으로 조립하는 데 필요한 중요한 단계와 조건을 설명합니다. 우리는 우리의 접근 방식이 지속적으로 확장되는 합성 세포 커뮤니티 내의 다양한 실험실 간에 우수한 작업 관행을 확립하는 데 도움이 될 것으로 기대하며, 이를 통해 합성 세포 개발 분야의 발전을 가속화할 것으로 기대합니다.
서론
합성 또는 인공 세포의 합성은 학제 간 연구에서 매우 두드러진 분야로 부상하여 합성 생물학, 화학 및 생물 물리학 분야의 과학자들로부터 상당한 관심을 끌고 있습니다. 이 과학자들은 최소한의 살아있는 세포 1,2,3을 구축한다는 공통의 목표로 뭉쳐 있습니다. 이 분야의 급속한 성장은 재조합 DNA 조작4, 생체 모방 물질5, 무세포 단백질 합성(CFPS) 방법7을 포함한 구획화를 위한 미세 가공 기술6과 같은 중요한 기술의 상당한 발전과 보조를 맞추고 있습니다. CFPS 시스템은 전사 및 번역을 위한 필수 세포 메커니즘을 포괄하며, 다기능 인공 세포의 개발 및 통합을 위한 기본 프레임워크를 제공합니다.
CFPS 기술은 합성 세포 조립에 자주 사용되지만, 다양한 합성 세포 시스템 조립을 위한 견고하고 맞춤화된 CFPS 시스템을 개발하는 것은 여전히 복잡....
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프로토콜
1. 추출물 준비
- 글리세롤 스톡의 E. coli BL21(DE3) 균주를 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트에 스트리킹하고 37°C에서 최소 15시간 동안 배양합니다.
- 갓 준비된 LB 플레이트의 단일 콜로니를 Luria Bertani(LB) 배지 50mL 플라스크에 접종하여 하룻밤 전배양을 준비합니다.
- 500mL의 2xYTPG 배지에 5mL의 프리배양을 3L 당황한 Erlenmeyer 플라스크에 접종합니다. 37 °C에서 격렬한 쉐이크 (220 rpm에서 250 rpm 사이)로 성장시키고 중간 로그 단계 (OD600 ~ 3)에 도달하면 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포 배양액을 차가운 얼음물에 10분 동안 넣고 8,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
참고: 이 단계에서 2xYTPG 배지의 포도당은 특정 응용 분야에 대해 생략할 수 있습니다 9,12. - 생성된 세포 펠릿을 35mL의 사전 냉각된 S30 완충액 A에 재현탁시킨 다음 8,000×....
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결과
세포 추출물 및 T7 RNA 중합효소의 새로운 배치마다 CFPS 시스템의 최적 성능을 보장하기 위해 Mg2+ 및 K+ 농도 모두에 대한 기본 스크리닝을 수행하는 것이 좋습니다. 슈퍼폴더 GFP의 형광은 그림 1A,B와 같이 다양한 조건에서 CFPS 시스템의 전체 수율을 나타내는 지표 역할을 할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 구획에 걸친 CFPS 시스템의 병렬 수율 비교가 그림 1C에 나와 있으며, 이는 잠재적으로 sucrose46의 영향으로 인해 GUV가 약간 감소하긴 하지만 캡슐화된 CFPS 시스템에서 일관된 성능을 보여줍니다. 또한 CFPS 반응은 액적(그림 2), GUV(그림 3) 및 SLB(
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토론
이 원고는 수중(water-in-oil) 방울, GUV 및 SLB를 포함한 합성 세포 플랫폼 전반의 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 사용하도록 설계된 수정된 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 간략하게 설명합니다. 단백질 중심의 합성 세포 시스템을 구축하기 위한 원료 추출물로 표준 대장균 재조합 단백질 발현 숙주 균주인 BL21(DE3)을 활용했습니다. 이 접근법은 서로 다른 구획에 걸쳐 약 0.5mg/mL의 단백질을 생성했습니다. 다른 맞춤형 추출물 소스 균주를 사용할 수 있지만, 이러한 시스템은 주로 특정 유형의 단백질 또는 대사 활성에 최적화되어 있으며, 이는 일반적인 단백질 발현에 적합하지 않을 수 있습니다. 최근 정량적 질량 분석 분석의 발전으로 특히 다양한 준비 조건에서 세포 용해물48,49의 단백질체 분석.......
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공개 사항
저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언한다.
감사의 글
M. Y.는 중국 장쑤성의 대학원 연구 및 실습 혁신 프로그램(Postgraduate Research & Practice Innovation Program)의 자금 지원을 인정합니다(Grant No. KYCX22_2803). L.K.는 중국 장쑤 고등교육기관의 자연과학 연구(보조금 번호 17KJB180003), 중국 장쑤 사범대학 자연과학 재단(보조금 번호 17XLR037), 중국 장쑤 고등교육기관의 우선 학술 프로그램 개발, 중국 장쑤성 특별 임명 교수 프로그램의 지원에 감사드립니다.
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재료
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| 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(나트륨염)(DOPS) | 아반티 | 840035P | |
| 1,4 디티오트레이톨(DTT) | 시그마-알드리치 | 1.11474 | |
| 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) | 아반티 | 850457P | |
| 3,5-사이클릭 AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| 50 mL 튜브 | Eppendorf | Eppendorf 튜브 바이오 기반 | |
| 50% 과산화수소 | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| 아세테이 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 한천 분말 | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| Alanin | 시그마-알드리치 | A4349 | |
| 아미콘 교반 세포 | 머크밀리포어 | UFSC05001 | |
| 암모늄 아세테이트(NH4OAc) | 시그마-알드리치 | A7262 | |
| 아르기닌 | 시그마-알드리치 | A4474 | |
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| 아스파타트 | 시그마-알드리치 | A5474 | |
| ATP | Roche | 11140965001 | |
| Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
| Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
| 배플 삼각 플라스크 | Shuniu | 250 mL, 1000mL | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Roche | 10711454001 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | Eppendorf Tubes 3810X | |
| Centrifugetube rack | Eppendorf | 0030119819 | |
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| Coverslip | Thermo Scientific | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
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| 배양 접시 | Huanqiu | 90mm | |
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| 전기 가열 대기 온도 경운기 | Yiheng 기기 | DHP-9602 | |
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| 불소화 오일 | Suzhou CChip 과학 기기 | 2%HFE7500 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | 47612 | |
| French Press | G.Heinemann | HTU-DIGI-Press | |
| 포도당 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
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| 구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물(GTP) | 로슈 | 10106399001 | |
| 헤페스 | 시그마-알드리치 | H3375 | |
| HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
| Histidin | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| 이소류신 | Sigma-Aldrich | I5281 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
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| Leucin | Sigma-Aldrich | L6914 | |
| Lysin | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| 마그네슘 아세테이트 사수화물(Mg(OAc)2) ) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methionin | Sigma-Aldrich | M8439 | |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5424 R | |
| 미네랄 오일 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems | Bio-Rad | 1645050 | |
| Multipurpose Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 핵산 및 단백질 UV 분석 측정 | IMPLEN | NanoPhotometer N60 | |
| Transfection 등급 플라스미드용 NucleoBond Xtra Maxi 키트 DNA | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
| Nunc-Immuno MicroWell 96웰 폴리스티렌 플레이트 | Sigma-Aldrich | P8616 | |
| PCR Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| 페닐알라닌 | - 시그마 - 알드리치 | P8740 | |
| 포스 포엔 피루뱃 (PEP) | GLPBIO | GC44635 | |
| PMSF | 시그마 - 알드리치 | PMSF - RO | |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG 8000) | 시그마 - 알드리치 | 89510 | |
| 칼륨 아세테이트 (KOAc) | 시그마 - 알드리치 | P5708 | |
| 염화칼륨 ( KCl) | 시그마-알드리치 | P9541 | |
| 글루타민산칼륨(K-글루타메이트) | 시그마-알드리치 | G1501 | |
| 수산화칼륨(KOH) | 시그마-알드리치 | 221473 | |
| 프롤린 | 시그마-알드리치 | P8865 | |
| 피루브산 키나아제(PK) | 시그마-알드리치 | P9136 | |
| 세린 | 시그마-알드리치 | S4311 | |
| 셰이커 | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | 시그마 - 알드리치 | S5886 | |
| 수산화 나트륨 (NaOH) | 시그마 - 알드리치 | S5881 | |
| 설탕 | 알라딘 | S112226 | |
| 황산 | 시그마 알드리치 | 339741 | |
| 주사기 필터 | Jinteng | 0.45 μ m | |
| 시험관 | Shuniu | 20 mL | |
| TGX FastCast 아크릴아미드 키트, 12% | Bio-Rad | #1610175 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| 트레오닌 | Sigma-Aldrich | T8441 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| 트립톤 | 시그마-알드리치 | T7293 | |
| 트립토판 | , 시그마-알드리치 | T8941 | |
| 티로신 | , 시그마-알드리치 | T8566 | |
| UTP, 트리소듐 염(UTP) | 알라딘 | U100365 | |
| 순환 수계가 있는 진공 펌프 | 정저우, Greatwall, Scientific, 산업 및 무역 Co.Ltd | SHB- | |
| Valin | Sigma-Aldrich | V4638 | |
| Vortex Mixers | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
| 정수 시스템 | MerckMillipore | Direct 초순수(Type 1) | |
| 효모 추출물 | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | 444203 |
참고문헌
- Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like art....
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