방법 논문

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

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DOI:

10.3791/66626

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2024년 4월 19일

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

초록

CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템은 합성 세포의 상향식 조립을 용이하게 하기 위해 널리 사용되어 왔습니다. 그것은 Central Dogma의 핵심 기계의 호스트 역할을 하며, 다양한 인공 세포 모방 시스템의 통합 및 조립을 위한 최적의 섀시로 서 있습니다. 합성 세포 제조에 자주 사용됨에도 불구하고 특정 응용 분야에 대한 맞춤형 및 강력한 CFPS 시스템을 구축하는 것은 여전히 사소한 과제로 남아 있습니다. 이 방법 논문에서는 합성 전지를 구성하는 데 일상적으로 사용되는 CFPS 시스템에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 세포 추출물, 템플릿 준비 및 형광 리포터 단백질을 활용한 일상적인 발현 최적화를 포함하여 CFPS 시스템 준비의 주요 단계를 포함합니다. 또한 단층 액적, 이중 에멀젼 소포 및 지지된 지질 이중층 위에 위치한 챔버와 같은 다양한 마이크로 구획 내에 CFPS 시스템을 캡슐화하여 대표적인 결과를 보여줍니다. 마지막으로, 서로 다른 환경에서 이러한 CFPS 시스템을 성공적으로 조립하는 데 필요한 중요한 단계와 조건을 설명합니다. 우리는 우리의 접근 방식이 지속적으로 확장되는 합성 세포 커뮤니티 내의 다양한 실험실 간에 우수한 작업 관행을 확립하는 데 도움이 될 것으로 기대하며, 이를 통해 합성 세포 개발 분야의 발전을 가속화할 것으로 기대합니다.

서론

합성 또는 인공 세포의 합성은 학제 간 연구에서 매우 두드러진 분야로 부상하여 합성 생물학, 화학 및 생물 물리학 분야의 과학자들로부터 상당한 관심을 끌고 있습니다. 이 과학자들은 최소한의 살아있는 세포 1,2,3을 구축한다는 공통의 목표로 뭉쳐 있습니다. 이 분야의 급속한 성장은 재조합 DNA 조작4, 생체 모방 물질5, 무세포 단백질 합성(CFPS) 방법7을 포함한 구획화를 위한 미세 가공 기술6과 같은 중요한 기술의 상당한 발전과 보조를 맞추고 있습니다. CFPS 시스템은 전사 및 번역을 위한 필수 세포 메커니즘을 포괄하며, 다기능 인공 세포의 개발 및 통합을 위한 기본 프레임워크를 제공합니다.

CFPS 기술은 합성 세포 조립에 자주 사용되지만, 다양한 합성 세포 시스템 조립을 위한 견고하고 맞춤화된 CFPS 시스템을 개발하는 것은 여전히 복잡한 과제로 남아 있습니다. 현재, 원핵생물 및 진핵생물 모델 유기체8에서 파생된 수많은 CFPS 시스템을 사용할 수 있으며, 각각은 합성 세포 합성의 특정 응용 분야에 특화되어 있습니다. 전사 및 번역의 중심적인 역할 외에도 CFPS 시스템은 주요 구성 요소와 관련 준비 절차가 다양합니다. 세포 추출물, RNA 중합효소, 템플릿 준비 방법 및 완충액 조성의 차이를 포함하는 이러한 변화는 주로 최대 단백질 수율을 위해 시스템을 집중적으로 최적화한 연구 그룹이 추구하는 뚜렷한 개발 궤적 때문입니다.

CFPS 시스템의 다양한 구성 요소 중에서 세포 추출물은 전사 및 번역을 위한 중요한 효소 풀이며, 따라서 CFPS 성능의 핵심 결정 요인입니다9. 대장균(E. coli) 기반 CFPS는 가장 잘 알려진 원핵 생물이라는 지위 때문에 가장 일반적으로 사용되는 시스템입니다. 또한, Ueda의 연구 그룹에서는 개별적으로 정제된 단백질과 리보솜으로 구성된 완전히 재구성된 CFPS 시스템인 PURE10을 개발했으며, 이는 명확한 백그라운드가 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다. 오늘날, 대장균 기반 CFPS 시스템조차도 특히 extrac11 및 제조 방법(12,13), RNA 중합효소(14,15), 에너지 원(16,17) 및 완충 시스템(18,19)의 소스 균주 측면에서 다양 해졌습니다. 가장 자주 사용되는 균주에는 A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 및 Rossetta223과 같은 K12 및 B 균주 유도체와 유전자 변형 균주가 포함됩니다.

초기에는 RNase 및 단백질 분해 효소 활성이 감소된 E. coli 균주를 선택하여 mRNA 안정성과 새로 합성된 재조합 단백질의 안정성을 향상시켜 최종 단백질 수율을 증가시켰습니다24. 그 후, 대장균 추출물은 글리코실화(glycosylation)25, 인산화(phosphorylation)26 및 지질화(lipidation) 27을 포함한 특정 번역 후 변형(post-translational modification)을 촉진하도록 조작되어 위의 번역 후 변형(posttranslational modifications)을 달성하도록 개발되었습니다. 또한, 분자 샤페론(molecular chaperons) 28 및 화학적 안정제와 같은 일련의 첨가제가 표적 단백질의 접힘을 돕기 위해 통합되어 CFPS 시스템의 다양화에 기여했습니다. 높은 진행성으로 알려진 박테리오파지 T7 RNA 중합효소는 주로 전사에 사용되지만 SP629와 같은 다른 중합효소도 활용되었습니다. E. coli 내인성 RNA 중합효소는 sigmafactors 30을 활용하는 유전 회로의 프로토타이핑에 적용되었습니다. 마지막으로, 다양한 에너지 전구체(31,32,33)와 다양한 염 및 완충 성분(19,34,35)이 생산성을 향상시키기 위해 체계적으로 최적화되었다.

CFPS 시스템 자체 외에도 캡슐화 방법과 구획화 재료도 성공적인 합성 셀 조립에 필수적입니다. CFPS 반응을 성공적으로 캡슐화하기 위해 개발된 다양한 시스템에는 계면활성제 안정화 물/오일 방울, 지질/폴리머 및 하이브리드 단층 소포(직경이 50nm에서 수 μm에 이르는 범위) 및 평면 지지 지질 이중층이 포함됩니다. 그러나 CFPS 시스템의 복잡한 분자 함량으로 인해 캡슐화의 성공률은 특정 사례, 특히 소포 형성에 따라 달라집니다. CFPS의 캡슐화의 성공률과 효율성을 향상시키기 위해, 액적과 소포 모두의 형성을 용이하게 하기 위해 다양한 미세유체 칩이 개발되었다(36). 그럼에도 불구하고 추가 칩과 장치를 설정해야 합니다.

이 프로토콜은 재조합 단백질 생산에 일반적으로 사용되는 숙주인 BL21(DE3) 균주를 활용하는 E. coli CFPS 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 리포터 단백질을 사용한 세포 추출물 준비, 템플릿 준비 및 표준 발현 최적화에 대한 자세한 설명을 포함합니다. 또한, 단층 액적, 이중 에멀젼 소포 및 지지된 지질 이중층 위에 위치한 챔버를 포함한 다양한 마이크로 구획 내에 CFPS 시스템을 캡슐화하여 달성한 모범적인 결과를 제시합니다. 마지막으로, 우리는 뚜렷한 환경적 맥락에서 이러한 CFPS 시스템을 성공적으로 구축하기 위해 필수적인 중추적인 절차적 요소와 필수 조건에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 추출물 준비

  1. 글리세롤 스톡의 E. coli BL21(DE3) 균주를 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트에 스트리킹하고 37°C에서 최소 15시간 동안 배양합니다.
  2. 갓 준비된 LB 플레이트의 단일 콜로니를 Luria Bertani(LB) 배지 50mL 플라스크에 접종하여 하룻밤 전배양을 준비합니다.
  3. 500mL의 2xYTPG 배지에 5mL의 프리배양을 3L 당황한 Erlenmeyer 플라스크에 접종합니다. 37 °C에서 격렬한 쉐이크 (220 rpm에서 250 rpm 사이)로 성장시키고 중간 로그 단계 (OD600 ~ 3)에 도달하면 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포 배양액을 차가운 얼음물에 10분 동안 넣고 8,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
    참고: 이 단계에서 2xYTPG 배지의 포도당은 특정 응용 분야에 대해 생략할 수 있습니다 9,12.
  4. 생성된 세포 펠릿을 35mL의 사전 냉각된 S30 완충액 A에 재현탁시킨 다음 8,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
  5. 1.4단계를 두 번 반복합니다.
    알림: 셀 펠릿은 즉시 사용하지 않을 경우 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
  6. S30 완충액 B에 최종 펠릿을 재현탁시키고(예: 세포 펠릿 1g당 1.1mL의 S30 완충액 B 사용) 17,000psi에서 프렌치 프레스를 한 번 통과하여 세포를 파괴합니다.
    1. 프렌치 프레스를 사용하려면 사용 설명서에 따라 셀 현탁액을 프렌치 프레스 금속 붕괴 챔버로 옮겨 모든 구성 요소가 조립되고 붕괴 챔버의 하단 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오.
    2. 조립된 붕괴 챔버를 유압 플랫폼으로 옮기고 안전 잠금 장치를 고정합니다.
    3. 유압 펌프를 켜고 중단을 시작하십시오.
    4. 배출 밸브를 제어하여 셀 현탁액이 배출 튜브에서 새로운 50mL 튜브로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다. 효율적인 중단을 보장하기 위해 유속을 조정하십시오(이상적으로는 한 번에 한 방울씩). 압력을 하한인 15,000psi 이상으로 유지하십시오.
  7. 생성된 용해물을 30,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 원심분리를 한 번 반복하고 상층액을 수집합니다. 채취한 상층액에 0.3 부피의 배양 전 완충액을 추가하고 37°C에서 80분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
    참고: 사전 배양 완충액을 사용하면 최종 수율을 높일 수 있지만, 빈 유출수(사전 배양 완충액 없이)도 효율성을 향상시킬 수 있다고 보고되었으며, 이는 해당 소스 변형률에 따라 다릅니다(37,38).
  8. 생성된 유출 혼합물을 2L의 S30 완충액 C에 대해 2시간 동안 투석하고, 투석 완충액을 2L의 신선한 S30 완충액 C로 한 번 교환하고, 4°C에서 밤새 투석한다39.
    참고: 야간 투석의 두 번째 단계는 약 3시간으로 단축할 수 있습니다.
  9. 투석된 샘플과 원심분리기를 30,000× 4 °C에서 30분 동안 채취합니다. 상층액과 분취액을 적절한 부피로 모으고 액체 질소에서 즉시 급속 동결합니다.
    참고: 냉동 샘플은 효율성 손실 없이 -80°C에서 최소 6개월에서 1년 동안 보관할 수 있습니다.

2. T7 RNA 중합효소

  1. pAR1219 플라스미드를 BL21(DE3) 스타 대장균 유능한 세포로 형질전환40.
  2. 하룻밤 배양액 10mL를 1L의 LB 배지(100μg/mL 암피실린 함유)에 접종합니다. OD600 이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37°C에서 세포를 성장시킵니다.
  3. 최종 농도 1mM IPTG를 추가하여 유도를 시작합니다. 추가로 5시간 동안 세포를 유도하고 4°C에서 15분 동안 8,000× g 에서 원심분리하여 수확합니다. 세포 펠릿을 -80 °C에서 최대 몇 주 동안 보관하십시오.
  4. 세포 펠릿을 T7 완충액 A 30mL에 재현탁시키고 15,000psi에서 French Press를 한 번 통과하여 세포를 파괴합니다. 4°C에서 30분 동안 20,000× g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  5. 이전 단계의 상층액에 스트렙토마이신 황산염을 한 방울씩 추가하여 최종 농도 4%(w/v)에 도달합니다. 얼음 위에서 잠시 배양한 후 20,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  6. 0.45μm 필터 멤브레인을 통해 상층액을 여과하고 여과된 샘플을 자동 액체 크로마토그래피 시스템을 통해 10개의 컬럼 부피의 T7 완충액 B로 사전 평형화된 강력한 음이온 교환 컬럼(40mL의 컬럼 부피)에 로드합니다.
  7. 로드된 컬럼을 50 컬럼 부피의 T7 버퍼 B로 세척하고 저염(50mM NaCl) 및 고염(500mM) T7 버퍼 C 혼합물 10 컬럼 부피로 샘플을 용리하여 ~3mL/분41의 유속에서 50 - 500mM의 NaCl 선형 농도 구배를 설정합니다.
  8. 피크 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석합니다.
    참고 : T7 중합 효소는 ~ 100 kDa에서 우세한 밴드를 나타내며 상당한 양의 불순물이 여전히 SDS-PAGE 겔에 나타납니다.
  9. T7 중합효소를 함유한 분획을 모으고 하룻밤 동안 2L의 T7 완충액 C에 대해 투석합니다.
  10. 글리세롤을 첨가하여 최종 농도 10%에 도달하고 생성된 혼합물을 한외여과42에 의해 3-4mg/mL의 최종 농도로 농축합니다.
    알림: 농축 과정에서 침전물이 나타나면 즉시 중지하고 원심분리로 침전물을 제거하십시오.
  11. 글리세롤 농도를 50%로 조정합니다. 부분 표본 및 급속 분석은 액체 질소로 샘플을 동결합니다. -80 °C에서 장기간 보관하십시오.
    참고: 작은 부분 표본도 효율 손실 없이 -20°C에서 최소 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. 완충액 준비

  1. 사용 하루 전에 표 1 에 표시된 대로 버퍼를 준비하십시오.

4. 템플릿 디자인 및 준비

  1. 관심 유전자를 T7 promoter 기반 벡터로 클로닝하거나 관심 유전자를 포함하는 선형 PCR 산물을 생성합니다.
    참고: 디자인 원칙에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.
  2. plasmid extraction kit를 사용하여 하룻밤 배양에서 plasmid를 준비합니다.
    참고: 이소프로판올 침전 단계와 70% 에탄올을 사용한 세척 절차가 포함된 플라스미드 키트를 선택하는 것이 좋습니다.
  3. 마이크로 부피 분광 광도계로 측정한 대로 건조된 DNA를 소량의 초순수에 200μg/mL에서 500μg/mL 사이의 농도로 용해시킵니다.
  4. 선택 사항: 선형 PCR 산물에서 단백질을 직접 발현합니다.
    참고: 이 경우 PCR 정제 단계가 필요합니다.

5. Mg2+ 및 K+ 최적화

  1. 표 2에 표시된 바와 같이 Mg2+ 농도 스크리닝 또는 표 3에 나타난 바와 같이 K+ 농도 스크리닝을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
  2. 마스터 혼합물을 개별 마이크로분리 튜브 또는 V자형 96웰 플레이트로 옮깁니다.
  3. 정확한 부피의 Mg2+ 또는 K+ 원액을 개별 마이크로퓨지 튜브 또는 V자형 96웰 플레이트에 피펫팅하고 초순수로 CFPS 반응을 완료합니다. 최소 2시간 동안 반응을 배양합니다.
    알림: V자형 96웰 플레이트를 사용하는 경우 증발을 방지하기 위해 플레이트를 플라스틱 덮개로 밀봉하십시오.
  4. 반응 혼합물 2μL를 꺼내 플레이트 리더로 형광 측정을 위해 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 여기 /방출: 485/528, 게인: 50, 판독 높이: 7.00mm 설정으로 형광판 리더를 사용합니다. 그러나 정제된 형광 단백질을 사용하여 특정 보정 곡선을 생성하도록 플레이트 리더를 조정해야 합니다.

6. 캡슐화

  1. 작은 물방울
    1. 계면활성제 함유 불소화유(HFE7500에서 2% PFPE-PEG) 또는 광유에 지질을 용해시켜 지질-광유 용액을 제조합니다(단계 6.2.1 참조)
    2. 표 4의 해당 시약 2-18을 결합하여 총 100μL의 CFPS 반응을 준비합니다. 1.5mL 튜브에 미리 준비한 오일 500μL에 CFPS 반응을 첨가한 다음 튜브를 튜브 랙에 50배 세게 문질러 미세한(유중수) 방울을 형성합니다. 30°C에서 튜브를 배양하여 반응을 수행합니다.
      참고: 간단한 미세유체역학 칩도 균일한 액적을 생성하는 데 사용할 수 있습니다43.
  2. 거대 단층 소포(GUV)
    1. 지질-미네랄 오일 용액 준비
      1. 4mL 유리 바이알에 클로로포름 57μL를 넣은 다음 18μL의 25mg/mL 1-팔미토일-2-올레오일-글리세롤-3-포스포콜린(POPC) 지질을 첨가하여 클로로포름 지질 용액을 형성하여 최종 농도 8mM(최종 농도가 비슷한 다른 지질 사용)을 달성합니다.
        참고: 이 혼합 단계는 서로 다른 지질의 균일한 혼합을 보장하기 위한 것입니다.
      2. 아르곤 흐름에서 클로로포름을 15분 동안 증발시킨 다음 진공 상태에서 1시간 동안 더 증발시킵니다.
      3. 생성 된 건조 지질을 1,500 μL의 미네랄 오일에 용해시켜 최종 농도 400 μM에 도달합니다. 혼합물을 실온에서 밤새 배양합니다.
    2. 계면 지질층 형성
      1. 500μL의 외부 용액( 표 5 참조)을 1.5mL 튜브에 넣고 250μL의 지질-미네랄 오일 용액을 외부 용액 위에 천천히 층을 이룹니다. 안정적인 계면 지질층을 형성하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 내부 용액의 준비
      1. 표 6의 모든 시약을 혼합하여 프리너 용액을 형성하고 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오. 표 4에 나열된 시약 16-18로 T7RNAP, S30 추출물 및 DNA 템플릿을 프리너 용액에 첨가하여 내부 용액을 완성합니다.
        주의: 캡슐화된 슈크로스 농도를 250mM 이상으로 증가시키면 cell-free translation이 억제될 수 있다44.
    4. GUV의 형성
      1. 500 μL의 지질 미네랄 오일이 들어있는 1.5 mL의 새 튜브에 50 μL의 내부 용액을 추가하고 피펫을 빠르게 위아래로 피펫팅하고 세게 소용돌이칩니다.
      2. 튜브를 얼음 위에 10분 동안 그대로 두고 20단계에서 1.5mL 튜브의 오일 상 상단에 6.2.2μL의 에멀젼 혼합물을 천천히 추가합니다.
      3. 800 × g 에서 원심 분리 (100 × g 에서 1000 × g 범위의 원심 분리 속도 사용)에서 4 ° C에서 10 분 동안 튜브 바닥에서 GUV가 형성되는 것을 관찰합니다.
        참고: 더 높은 특정 원심분리 속도를 사용할 수 있습니다. 그러나, 원심분리 속도가 형성된 GUVs(45)의 크기에 영향을 미칠 수 있다고 생각할 수 있다.
      4. 상부 오일상을 제거합니다.
      5. 튜브 바닥에서 30μL의 GUV를 조심스럽게 흡입합니다. 채취한 GUV를 30°C에서 배양합니다.
        참고: 최적의 배양 온도는 단백질에 따라 다릅니다.
      6. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(LSM)을 사용하여 형광 단백질의 발현을 모니터링할 수 있습니다.
  3. 지원되는 지질 이중층(SLB)
    1. SLB 챔버 준비
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 커버슬립은 각 커버 슬라이드 중앙에 황산 7방울과 50% 과산화수소 2방울을 추가합니다. 커버슬립의 반응물을 최소 45분 동안 배양합니다. 초순수로 철저히 헹굽니다.
      2. 자외선 램프(365nm) 아래에서 경화된 광학 접착제를 사용하여 10분 동안 절단된 0.5mL 미세분리 튜브를 세척된 커버슬립에 부착하여 재구성 챔버를 형성합니다.
    2. SLB 형성
      1. 80 mol % 1,2- dioleoyl-sn- 글리세롤 -3- 포스 포 콜린 (DOPC), 19.95 몰 % 1,2- 디오 레오일 -sn- 글리세롤 -3- 포스 포 -L- 세린 (DOPS) 및 0.05 몰 % Atto488-DOPE (1,2- 디올레오일 -sn-글리세로 -3- 포스포에탄올 아민 = DOPE)를 용해시키고 클로로포름에 혼합하고 약한 질소 흐름으로 건조시키고 1 시간 동안 진공 처리하여 용매를 완전히 제거합니다.
      2. SLB 완충액 A에서 건조된 지질막을 재수화하여 최종 지질 농도가 4mg/mL가 되도록 합니다.
      3. 결과 샘플이 투명해질 때까지 소용돌이치고 초음파 처리합니다.
      4. 4mg/mL의 SUV를 130μL의 SLB 버퍼 A로 희석하고 75μL의 현탁액을 미리 형성된 반응 챔버로 옮긴 다음 37°C의 열 블록에서 1분 동안 배양합니다. 150μL의 SLB 버퍼 A를 반응 챔버에 추가하여 2분 동안 추가로 배양합니다.
      5. CFPS 반응을 위해 0.4%(w/v) BSA로 S30 완충액 C로 완충액을 교환하기 전에 2mL의 SLB 완충액 B(MgCl2가 없는 SLB 완충액 A)로 챔버를 세척하고 챔버 내부에 100μL의 완충액을 남겨 형성된 SLB가 건조되는 것을 방지합니다.
      6. 잔류 S30 버퍼 C를 제거하고 CFPS 반응 혼합물을 SLB 챔버에 조심스럽게 추가합니다. 30°C에서 챔버를 배양하고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 발현을 모니터링합니다.

결과

세포 추출물 및 T7 RNA 중합효소의 새로운 배치마다 CFPS 시스템의 최적 성능을 보장하기 위해 Mg2+ 및 K+ 농도 모두에 대한 기본 스크리닝을 수행하는 것이 좋습니다. 슈퍼폴더 GFP의 형광은 그림 1A,B와 같이 다양한 조건에서 CFPS 시스템의 전체 수율을 나타내는 지표 역할을 할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 구획에 걸친 CFPS 시스템의 병렬 수율 비교가 그림 1C에 나와 있으며, 이는 잠재적으로 sucrose46의 영향으로 인해 GUV가 약간 감소하긴 하지만 캡슐화된 CFPS 시스템에서 일관된 성능을 보여줍니다. 또한 CFPS 반응은 액적(그림 2), GUV(그림 3) 및 SLB(그림 4) 상단에 성공적으로 캡슐화되었습니다.

그림 2A 는 오일 용액이 난류가 될 때 분명한 에멀젼 방울의 형성을 보여줍니다. 녹색/적색 형광 단백질(GFP 및 mCherry)의 발현은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 캡처했습니다. 그림 3 은 간단한 에멀젼 전달 공정을 통해 GUV 내에서 CFPS 반응을 캡슐화하는 데 성공한 것을 보여줍니다. 빨간색 채널은 라벨링된 지질을 나타냅니다. 녹색 채널은 상위 폴더 GFP의 표현을 보여주었습니다. 노란색 채널은 불활성 형광 염료를 나타냅니다. 그림 4A 는 CFPS 반응이 증착될 수 있는 SLB 챔버를 보여줍니다. 이 챔버 내에서 유리 커버슬립 위에 SLB를 형성하고 CFPS 반응 혼합물을 사전 성형된 SLB 위에 배치하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 통한 이미징을 가능하게 했습니다. 그림 4B에서 볼 수 있듯이 SLB는 녹색으로 표시된 라벨링된 지질로 시각화되었으며, mCherry와 융합된 발현된 작은 GTPase Cdc42는 자홍색으로 표시되었습니다. mCherry-Cdc42의 현장 발현은 현미경으로 가역적 멤브레인 표적화 공정과 함께 관찰할 수 있었습니다. 그러나, 사용된 CFPS 시스템은 최근 간행물47에 자세히 설명된 바와 같이 프레닐화 기계로 보완되었습니다.

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그림 1: CFPS 시스템의 최적화 및 비교. CFPS 시스템에 대한 (A) Mg2+ 농도 및 (B) K+ 농도를 대량으로 스크리닝합니다. (C) 다양한 구획에서 단백질 발현 수율을 보여주는 막대 차트. 슈퍼폴더 GFP의 형광은 플레이트 리더 또는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 측정한 CFPS 시스템의 수율을 결정하는 데 사용되었습니다. 약어: CFPS = cell-free protein synthesis; GFP = 녹색 형광 단백질; sfGFP = 상부 폴더 GFP; GUV = 거대 단층 소포; SLB = supported lipid bilayer(지원되는 지질 이중층). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 액적에서의 무세포 단백질 합성. (A) 계면활성제 안정화 유중수(water-in-oil) 방울에서 캡슐화된 CFPS 반응의 사진. (B) 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화된 액적에 캡슐화된 (C) mCherry 및 (D) 슈퍼폴더 GFP의 CFPS의 명시야 및 (C,D) 형광 이미지. Superfolder GFP는 녹색으로 표시됩니다. mCherry는 자홍색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: CFPS = cell-free protein synthesis; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: GUV의 무세포 단백질 합성. (A) GUV의 캡슐화된 CFPS 반응 사진. (비-디) POPC GUV 내에 캡슐화된 CFPS의 형광 이미지로, 슈퍼폴더 GFP를 표현합니다. (B) 지질 이중층은 빨간색으로 표시된 0.05% 표지된 Atto647N-DOPE 지질, (C) 노란색으로 표시된 불활성 염료, (D) 상부폴더 GFP로 표시되었습니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: CFPS = cell-free protein synthesis; GFP = 녹색 형광 단백질; GUV = 거대 단층 소포; POPC = 1-팔미토일-2-올레오일-글리세롤-3-포스포콜린; DOPE = 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: SLB 상부에 있는 작은 GTPase 단백질-Cdc42의 무세포 단백질 합성. (A) 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화한 SLB에서 Cdc42의 막 표적화 및 RhoGDI 종속 막 추출의 재구성에 대한 개략도. 프레닐화 기계는 프레닐화효소-농축 추출물을 통해 구현되었으며, 이는 다른 곳에서 자세히 설명되었습니다. 47. (B) SLB 상부에 있는 반응 혼합물의 사전 및 사후 프레닐화에 대한 직교도. (씨,디) (C) 멤브레인 타겟팅 및 (D) 멤브레인 추출 중 멤브레인(분홍색) 및 용액(검은색)에 대한 mCherry-Cdc42 강도의 시계열. 스케일 바 = 10 μm. (A-D)는 Kai et al.47에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 버퍼 목록. 참고: 사용 직전에 β-메르캅토에탄올과 DTT를 첨가하십시오. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: Mg2+ 농도 스크리닝을 위한 피펫팅 계획. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: K+ 농도 스크리닝을 위한 피펫팅 방식. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 내부 용액 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 외부 용액 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 6: 프리너 용액 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 원고는 수중(water-in-oil) 방울, GUV 및 SLB를 포함한 합성 세포 플랫폼 전반의 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 사용하도록 설계된 수정된 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 간략하게 설명합니다. 단백질 중심의 합성 세포 시스템을 구축하기 위한 원료 추출물로 표준 대장균 재조합 단백질 발현 숙주 균주인 BL21(DE3)을 활용했습니다. 이 접근법은 서로 다른 구획에 걸쳐 약 0.5mg/mL의 단백질을 생성했습니다. 다른 맞춤형 추출물 소스 균주를 사용할 수 있지만, 이러한 시스템은 주로 특정 유형의 단백질 또는 대사 활성에 최적화되어 있으며, 이는 일반적인 단백질 발현에 적합하지 않을 수 있습니다. 최근 정량적 질량 분석 분석의 발전으로 특히 다양한 준비 조건에서 세포 용해물48,49의 단백질체 분석에 대한 파일럿 연구가 촉진되었습니다.

이러한 연구에서 통찰력을 얻었음에도 불구하고 식별된 단백질 요인과 CFPS 시스템의 전반적인 성능 간의 정량적 상관 관계를 확립하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 격차는 주어진 추출물 배치의 성능을 정량적으로 평가하는 방법에 대한 답을 얻지 못했습니다. 또한, 보고된 다른 소스 균주에 대한 체계적이고 병렬적인 비교는 없었습니다. 이 연구에서는 바이오매스 생산을 촉진하기 위해 2xYPTG 배지를 활용했으며, 이는 전사를 위해 내인성 RNA 중합효소를 사용할 때 2xYPT로 전환하는 데 권장되는 전략입니다. T7 중합효소를 추출물 전처리 절차45에 통합할 수 있다는 제안에도 불구하고, 당사는 높은 배치 간 변동을 줄이기 위해 S30 추출물 및 T7 RNA 중합효소에 대한 별도의 전처리 프로토콜을 선택했습니다.

표적 단백질의 생산은 본질적으로 중앙 전사/번역 과정과 연결되어 있습니다. 적절한 템플릿 디자인과 순도는 성공적인 cell-free 발현을 위해 매우 중요합니다. 플라스미드 템플릿 외에도 PCR에 의해 생성된 선형 이중 가닥 DNA를 사용할 수 있어 스크리닝 및 고처리량 응용 분야에 적합합니다. E. coli의 in vivo 발현을 위한 기존의 템플릿 설계와 달리, E. coli cell-free 시스템의 템플릿 설계는 발현 유도를 고려할 필요 없이 단순화됩니다. cell-free expression template의 유일한 필수 요소는 T7 regulatory sequence입니다. 그러나 일부 경우에는 표적 유전자의 5' 염기서열이 해당 전사된 mRNA에 의해 형성된 2차 구조에 따라 번역 시작에 영향을 미칠 수 있습니다. 리보솜 결합 부위가 전사된 mRNA의 안정적인 줄기 고리 내에 위치하면 번역 시작이 크게 방해를 받아 전반적인 발현이 저하될 수 있습니다. 마찬가지로, 연속적인 희귀 코돈은 발현을 방해할 수 있으므로 in vivo 연구와 유사하게 최적화해야 합니다. 이는 코돈 최적화(50) 및 mRNA 2차 구조 예측(51) 전용 오픈 소스 서버를 통해 달성될 수 있다.

완충 시스템과 관련하여, 우리는 실험 설정에서 크레아틴 포스페이트와 크레아틴 키나아제가 보충된 아세테이트 완충액을 에너지 재생원으로 활용했습니다. 이 설정은 적당한 발현 수준과 상대적으로 빠른 동역학을 생성했는데, 이는 크레아틴 인산염을 사용하여 크레아틴 키나아제에 의해 촉매된 단일 단계 에너지 재생 반응에 기인합니다. 일부 연구자들은 글루타메이트 완충 시스템으로 전환하여 세포 환경(52)과 더 가깝다는 점을 언급했지만, 현재 프로토콜로는 단백질 발현 수율에서 중요한 차이를 관찰하지 못했습니다. 그러나, 최근의 단백질체 분석은 추출물 처리 방법과 결합된 상이한 완충 시스템이 최종 발현 수율에 영향을 미칠 수 있음을 나타냈다19. 에너지 전구체와 관련하여, 비용 효율성과 향상된 발현 수율을 달성하기 위해 수많은 연구 그룹에 의해 다양한 기판이 조사되었습니다53,54. 제시된 CFPS 시스템의 맥락에서, 크레아틴 포스페이트와 크레아틴 키나아제는 의도적으로 선택되었습니다. 이 선택은 단일 단계 반응을 통해 달성할 수 있는 에너지 재생의 효율성과 추출물에서 유전된 내인성 효소와의 간섭이 없기 때문에 동기가 부여되었습니다. 결과적으로, 이 구성은 다양한 마이크로 컴파트먼트 환경에 적합한 간단하면서도 견고한 시스템을 구축합니다.

제시된 결과에서 알 수 있듯이, 우리는 세 가지 뚜렷한 미세구획에서 성공적인 단백질 발현을 입증했습니다: 반불소화 오일에 의해 안정화된 오일 내 수분 방울, 에멀젼 전달을 통해 형성된 GUV 및 지지된 지질 이중층 상에서. 다양한 micro-compartment에서 단백질 발현의 다양성은 합성 세포 구성을 위한 CFPS 시스템의 견고성을 강조합니다. 이러한 캡슐화 방법 중 에멀젼 방울 기술은 CFPS 시스템을 캡슐화하는 매우 간단한 접근 방식이었으며 교반 또는 와류만 필요했습니다. 그러나 이러한 액적은 불안정한 수계로 인해 불안정한 경향이 있으며, 이러한 한계는 오일 단계에 지질 또는 계면활성제를 첨가하여 해결할 수 있습니다. 안정화된 기름 속의 수중 방울의 실용성에도 불구하고 세포막으로 분리된 두 개의 수성 구획으로 구성된 자연 세포 환경을 완전히 복제하지는 않습니다. 액적 대신 1미크론을 초과하는 크기의 거대 단층 소포(GUV)를 설정하여 세포를 보다 밀접하게 모방했습니다. CFPS 시스템은 이러한 소포의 지질 이중층 내에 캡슐화되어 다양한 합성 세포 시스템(55)을 위한 전사 및 번역 기계를 제공하였다.

이중 에멀젼이라고도 하는 에멀젼 전사는 무용제 방법에 비해 가벼운 준비 공정과 상대적으로 높은 캡슐화 효율로 인해 CFPS 반응을 캡슐화하는 일반적인 기술로 두드러집니다. 그러나, 이중 에멀젼 소포의 생성은 간단한 원심분리 단계에서부터 미세유체 보조 에멀젼 전달의 사용에 이르기까지 다양할 수 있으며, 각 방법은 다른 곳에서 요약된 바와 같이 관련 장점 및 단점을 가지고 있습니다(36). GUV 내에서 CFPS 시스템을 성공적으로 캡슐화하려면 삼투압을 조정하고 유수 계면을 가로지르는 데 적절한 힘을 가해야 합니다. 여기에 설명된 에멀젼 전달 방법은 가장 간단하고 특정 실험실 장비가 필요하지 않지만 생성된 GUV의 효율성과 균질성은 배치마다 다를 수 있습니다. 더욱이, 모든 에멀젼 이송 방법은 형성된 이중층 계면의 루멘 내의 잔류 오일을 처리해야 하며, 이는 추가적인 오일 제거 단계(56)를 필요로 하며, 이는 키네틱 프로젝트에서 문제를 제기할 수 있다.

마지막으로, SLB(Supported Lipid Bilayer) 위에서 CFPS의 성공적인 발현을 보여주었으며, 이는 지질 생체막 환경 인근에서 단백질 합성이 필요한 프로젝트에 유용한 접근 방식을 제공합니다. 제시된 CFPS 시스템의 활용을 통해 세포 극성에 중요한 중심 단백질 분자인 Cdc4247의 가역적 막 표적화 과정을 특성화하는 데 성공적인 응용 분야를 입증했습니다. 요약하면, 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 관찰되는 일관된 매체 발현 수율과 고유한 견고성은 다양한 합성 세포 시스템 구성에서 이 CFPS 시스템의 잠재력을 강조합니다. 이 기능은 다양한 단백질 중심 모델을 포함하도록 더욱 확장될 수 있으며, 궁극적으로 최소 세포의 실현을 향해 나아갈 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언한다.

감사의 글

M. Y.는 중국 장쑤성의 대학원 연구 및 실습 혁신 프로그램(Postgraduate Research & Practice Innovation Program)의 자금 지원을 인정합니다(Grant No. KYCX22_2803). L.K.는 중국 장쑤 고등교육기관의 자연과학 연구(보조금 번호 17KJB180003), 중국 장쑤 사범대학 자연과학 재단(보조금 번호 17XLR037), 중국 장쑤 고등교육기관의 우선 학술 프로그램 개발, 중국 장쑤성 특별 임명 교수 프로그램의 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)아반티850375P
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(나트륨염)(DOPS)아반티840035P
1,4 디티오트레이톨(DTT)시그마-알드리치1.11474
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)아반티850457P
3,5-사이클릭 AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL 튜브EppendorfEppendorf 튜브 바이오 기반
50% 과산화수소Sigma-Aldrich516813
아세테이Sigma-AldrichA6283
한천 분말Sigma-Aldrich05040
Alanin시그마-알드리치A4349
아미콘 교반 세포머크밀리포어UFSC05001
암모늄 아세테이트(NH4OAc)시그마-알드리치A7262
아르기닌시그마-알드리치A4474
아스파라긴시그마-알드리치A0884
아스파타트시그마-알드리치A5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
배플 삼각 플라스크Shuniu250 mL, 1000mL
소 혈청 알부민(BSA)Roche10711454001
원심분리기EppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rackEppendorf0030119819
화학발광 및 상피 형광 이미징 시스템UvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
크레아틴 키나아제(CK)로슈10127566001
크레아틴 인산염(CP)시그마-알드리치10621714001
배양 접시Huanqiu90mm
시스테인시그마-알드리치C5360
시티딘 5'-트리포스페이트 디소듐 염(CTP)알라딘C101487
투석막스펙트럼표준 RC 튜빙 MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. 사이클 퓨어 키트Omega Bio-TekD6492-01
전기 가열 대기 온도 경운기Yiheng 기기DHP-9602
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)바이오샤프
형광판 판독기BioTekSynergy 2
불소화 오일Suzhou CChip 과학 기기2%HFE7500
Folinic acidSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
포도당Sigma-AldrichG7021
글루타마트시그마-알드리치G5667
글루타민시그마-알드리치G5792
글리세롤시그마-알드리치G5516
글리신시그마-알드리치G7126
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물(GTP)로슈10106399001
헤페스시그마-알드리치H3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
이소류신Sigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
마그네슘 아세테이트 사수화물(Mg(OAc)2) )Sigma-AldrichM5661
염화마그네슘(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
마이크로 원심분리기Eppendorf5424 R
미네랄 오일Sigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
핵산 및 단백질 UV 분석 측정IMPLENNanoPhotometer N60
Transfection 등급 플라스미드용 NucleoBond Xtra Maxi 키트 DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96웰 폴리스티렌 플레이트Sigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
페닐알라닌- 시그마 - 알드리치P8740
포스 포엔 피루뱃 (PEP)GLPBIOGC44635
PMSF시그마 - 알드리치PMSF - RO
폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG 8000)시그마 - 알드리치89510
칼륨 아세테이트 (KOAc)시그마 - 알드리치P5708
염화칼륨 ( KCl)시그마-알드리치P9541
글루타민산칼륨(K-글루타메이트)시그마-알드리치G1501
수산화칼륨(KOH)시그마-알드리치221473
프롤린시그마-알드리치P8865
피루브산 키나아제(PK)시그마-알드리치P9136
세린시그마-알드리치S4311
셰이커ZhichushakersZQZY-AF8
염화나트륨 (NaCl)시그마 - 알드리치S5886
수산화 나트륨 (NaOH)시그마 - 알드리치S5881
설탕알라딘S112226
황산시그마 알드리치339741
주사기 필터Jinteng0.45 μ m
시험관Shuniu20 mL
TGX FastCast 아크릴아미드 키트, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
트레오닌Sigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
트립톤시그마-알드리치T7293
트립토판, 시그마-알드리치T8941
티로신, 시그마-알드리치T8566
UTP, 트리소듐 염(UTP)알라딘U100365
순환 수계가 있는 진공 펌프정저우, Greatwall, Scientific, 산업 및 무역 Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
정수 시스템MerckMilliporeDirect 초순수(Type 1)
효모 추출물Sigma-Aldrich70161
β-메르캅토에탄올Sigma-Aldrich444203
트 1100027, , , , , , , ,

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