Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

요약

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

초기의 후각 감각 경험은 초파리 청소년 뇌에서 극적인 시냅스 사구체 리모델링을 유도하며, 이는 경험적으로 용량 의존적이고, 시간적으로 제한되며, 짧고 잘 정의된 결정적 기간에만 일시적으로 가역적입니다. 뇌 회로 시냅스 연결성 리모델링의 방향성은 후각 감각 뉴런의 반응 수용체 부류에 작용하는 특정 냄새 물질에 의해 결정됩니다. 일반적으로 각 뉴런 클래스는 단일 냄새 수용체만 발현하고 단일 후각 시냅스 사구체를 자극합니다. 초파리(Drosophila ) 유전자 모델에서, 후각 사구체의 전체 배열은 냄새 반응성과 행동 출력에 의해 정확하게 매핑되었습니다. 에틸 부티레이트(EB) 냄새 물질은 VM7 사구체를 자극하는 Or42a 수용체 뉴런을 활성화합니다. 생애 초기의 임계 기간 동안, EB 경험은 Or42a 후각 감각 뉴런에서 용량 의존적 시냅스 제거를 주도합니다. 투여된 EB 냄새 물질에 노출된 일정 기간을 통해 청소년 뇌의 경험 의존적 회로 연결성 가지치기를 조사할 수 있습니다. 더듬이엽 시냅스 사구체의 공초점 현미경 이미징은 시냅스 수와 신경 분포 부피의 정량화를 제공하는 Or42a 수용체 기반 형질전환 마커로 수행됩니다. 정교한 Drosophila genetic toolkit은 뇌 회로 리모델링을 매개하는 세포 및 분자 메커니즘의 체계적인 해부를 가능하게 합니다.

서론

어린 시절 동안 유년기의 뇌 회로를 개조하는 것은 동물이 태어나는 매우 가변적이고 예측할 수 없는 환경에 맞게 대규모 시냅스 연결성 변화를 일으킬 수 있는 마지막 기회를 나타냅니다. 가장 풍부한 동물 그룹인 곤충은 진화적으로 보존된 근본적인 임계시기 리모델링 메커니즘¹을 공유합니다. 임계 기간은 감각 입력의 시작과 함께 시작되고, 연결성을 최적화하기 위해 가역적인 회로 변화를 보이고, 안정화 힘이 추가 리모델링에 저항할 때 닫힙니다². 곤충은 특히 후각 감각 정보에 의존하며 잘 정의된 후각 임계 기간을 보여줍니다. 초파리(Drosophila)는 청소년 뇌에서 이러한 경험 의존적 임계 기간을 조사하기 위한 우수한 유전 모델을 제공합니다. 에클로젼 후 처음 몇 일 동안의 냄새 경험은 개별적으로 식별된 시냅스 사구체에서 현저한 회로 연결성 변화를 주도합니다 ^3,4. 리모델링의 방향은 특정 투입 냄새 경험에 따라 다릅니다. 일부 냄새 유발 물질은 폐색 (dpe) 후 몇 일 동안 시냅스 사구체 부피를 증가시키는 반면^,3,5,6,7 다른 냄새 물질은 0-2 dpe 임계 기간 동안 시냅스를 빠르게 제거하여 신경 분포 부피 ^8,9,10을 감소시킵니다. 특히, 에틸 부티레이트(ethyl butyrate, EB) 냄새 경험은 이 생애 초기의 임계 기간 동안에만 Or42a 후각 수용체 뉴런의 용량 의존적 시냅스 가지치기를 촉진한다⁸. 시냅스 제거는 임계 기간 내에 EB 냄새 주입을 조절함으로써 완전히 되돌릴 수 있지만 임계 기간이 끝나면 영구적이 됩니다. 이 후각 경험에 의존하는 시냅스 가지치기는 청소년 뇌 회로 리모델링의 기저에 있는 시간적으로 제한된 메커니즘을 설명할 수 있는 귀중한 실험 시스템을 제공합니다.

여기에서는 생애 초기 결정적 기간 동안 Or42a 수용체 후각 감각 뉴런의 EB 경험 의존적 시냅스 가지치기를 유도하고 분석하는 데 사용되는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 더듬이엽 VM7 사구체의 Or42a 시냅스 말단이 Or42a 프로모터(Or42a-mCD8::GFP)¹¹에 직접 융합되거나 Gal4/UAS 이진 발현 시스템(Or42a-Gal4가 UAS-mCD8::GFP를 구동)¹²을 사용하여 막 테더링된 mCD8::GFP 마커를 형질전환으로 구동함으로써 특이적으로 표지될 수 있음을 보여줍니다. 개별 Or42a 뉴런 시냅스는 형광 태그 어레이(예: Bruchpilot::RFP)⁸ 또는 초구조적 시냅스 분석을 위한 전자 밀도 신호(예: miniSOG-mCherry)⁸에 융합된 시냅스전 활성 영역 마커의 표적 형질전환 발현을 사용하여 유사하게 표지할 수 있습니다. Or42a 시냅스 말단은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 투과 전자 현미경의 조합으로 이미징할 수 있습니다. 우리는 Or42a 시냅스 사구체 가지치기가 EB 용량에 따라 달라지며 시간 지정된 냄새 경험의 농도에 따라 확장됨을 보여줍니다. 매개체로 사용되는 미네랄 오일에 용해된 EB 냄새 물질의 비율은 다양할 수 있으며, 발달 단계에 있는 동물에서 냄새 물질에 노출되는 시간도 다양할 수 있습니다. 마지막으로, VM7 신경 분포 형광 강도 및 부피를 측정하여 시냅스 사구체 가지치기 정도를 분석하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 시냅스 수는 또한 표지된 시냅스 반점을 계산하고 투과 전자 현미경⁸을 사용하여 시냅스 초구조 매개변수를 측정함으로써 정량화할 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 표시된 프로토콜은 청소년 임계 기간 동안 초파리 후각 회로 시냅스 연결성 가지치기를 매개하는 세포 및 분자 메커니즘의 체계적인 해부를 가능하게 하는 강력한 접근 방식입니다. 이 연구에서 설명한 일반적인 냄새 노출 설정은 이전 연구에서 다른 냄새를 사용하고 다른 사구체를 분석하는 데 사용되었습니다 ^3,7.

프로토콜

1. 냄새 노출

1. 가는 붓을 사용하여 40-50마리의 발달 단계에 있는 동물을 pharate dark pupae(25°C에서 번데기 후 90+ 시간)로 분류하여 표준 옥수수 가루 당밀 식품이 들어 있는 25mm x 95mm 폴리스티렌 초파리 바이알로 분류합니다(그림 1A).
2. Drosophila 바이알 끝에 미세한 스테인리스 스틸 와이어 메쉬를 놓아 파리를 격리하는 동시에 공기 흐름을 원활하게 합니다. 테이프로 감싼 투명 필름으로 철망 캡을 Drosophila 바이알 측면에 고정합니다.
3. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 100% 미네랄 오일 1mL를 넣거나(차량 제어) 에틸 부티레이트(EB) 냄새제를 다른 튜브의 미네랄 오일에 용해시켜 원하는 농도(예: 15%(150μL) 또는 25%(250μL))를 생성합니다.
4. 차량 제어 또는 냄새가 나는 마이크로 원심분리기 튜브를 밀폐된 3700mL Glasslock 용기에 똑바로 세웁니다. 테이프를 사용하여 Drosophila 바이알과 함께 냄새 챔버 중앙에 튜브를 단단히 고정합니다(그림 1B).
5. 스테이지된 Drosophila pharate 번데기 바이알이 들어있는 밀봉된 차량 제어 및 EB 냄새 챔버를 12시간/12시간 명암주 주기로 가습(70%), 온도 제어(25°C) 인큐베이터에 넣습니다.
6. 냄새 챔버에 4시간 노출된 후 새로 닫힌 파리를 제거하고 20-25마리의 파리를 갓 만든 냄새 물질이 있는 챔버의 신선한 초파리 바이알로 빠르게 옮깁니다(그림 1A, B). 닫히지 않은 번데기는 버리십시오.
7. 인큐베이터의 밀폐된 냄새 챔버에 파리를 총 24시간 동안 보관하십시오. 더 긴 취취제 투여를 위해 24시간마다 갓 만든 취취제 챔버에서 파리를 새로운 Drosophila 바이알로 빠르게 이송하십시오.
8. 즉각적인 뇌 박리 및 면역세포화학 처리를 준비하기 위해 발달 단계에 있는 파리를 70% 에탄올 접시에 1분 동안 담가 마취시킵니다.

2. 뇌 해부

1. 라벨링을 통해 바이알을 차량 제어(100% 미네랄 오일만 해당) 또는 EB 노출(% EB)로 표시하고 뇌 절개 및 후속 처리의 전체 기간 동안 이러한 지정을 유지합니다. 각 유전자형/냄새 상태에 대해 10-20마리의 동물을 처리합니다.
2. 겸자를 사용하여 마취된 파리 한 마리를 갓 만든 인산염 완충 식염수(PBS)¹³가 담긴 작은 접시에 옮깁니다. 파리를 PBS에 담그고 파리를 완전히 잠근 상태에서 전체 뇌 해부를 계속합니다.
3. 양손에 가늘고 (#5) 날카로운 집게를 놓고 플라이 복부 쪽을 위로 놓고 한 집게로 위쪽 흉부를 잡고 다른 집게로 아래의 머리를 잡습니다. 뇌에 침투하지 않도록 주의하십시오.
4. 양손으로 반대 방향으로 부드럽게 당겨 몸의 나머지 부분에서 머리를 제거합니다. 머리는 흉부에서 쉽게 분리되어야 합니다. 해부를 위해 격리된 머리를 그대로 둡니다(그림 1C).
5. 이전에 흉부를 잡기 위해 사용한 집게를 주둥이의 반대쪽 아래로 밀어 넣습니다. 외골격 큐티클을 반대 방향으로 부드럽게 당겨 눈 사이를 찢어 뇌를 드러내도록 합니다.
6. 당길 때 뇌 시신경엽이 외골격과 함께 분리될 수 있습니다. 이를 방지하려면 외골격 큐티클을 제거하면서 두 개의 겸자를 천천히 꾸준히 잡아당깁니다(그림 1C, 가운데).
7. 머리에서 외골격 표피를 계속 제거합니다. 외골격의 모든 부분이 제거되었는지 확인합니다. 뚱뚱한 몸체와 돌출된 기관을 포함하여 뇌에 부착된 모든 조직을 제거합니다.
8. 달라붙는 것을 방지하기 위해 P20 피펫 팁을 PBS + 0.2% Triton-X 100(PBST)으로 헹굽니다. 해부 직후 뇌를 뚜껑이 있는 튜브에 담긴 고정 용액(4% 파라포름알데히드(PFA) + 4% 자당)으로 옮깁니다(그림 1C,D).

3. 뇌 면역세포화학(Brain immunocytochemistry)

1. 엔드 투 엔드 회전으로 실온(RT)에서 30분 동안 뇌를 고정합니다. 뇌를 튜브에 유지하면서 피펫을 제거하고 위험한 고정액을 적절하게 폐기하십시오. PBS로 고정된 뇌를 3번 빠르게 세척합니다(그림 1D).
2. 뇌는 회전 후 튜브의 뚜껑에 끼어 있는 것을 종종 볼 수 있습니다. 모든 이식에서 지속적인 위험인 우발적인 뇌 손실을 방지하려면 액체를 피펫팅하는 동안 해부 현미경을 사용하십시오.
3. 항체 라벨링을 준비하기 위해 PBST + 1% 소 혈청 알부민(BSA) + 0.5% 정상 염소 혈청(NGS)에서 RT에서 1시간 동안 고정 뇌를 일정한 종단 간 회전으로 차단합니다(그림 1D).
4. 블록을 제거하고 선택한 1차 항체를 PBST + 0.2% BSA + 0.1% NGS에 적절하게 희석하여 뇌를 배양합니다. 일정한 회전으로 4 ° C에서 밤새 (14-16 시간) 뇌를 배양합니다.
   참고: 사용된 항체의 예: 시냅스 사구체를 표지하기 위한 쥐 항-CadN(희석 1:50)¹⁴ 및 Or42a-mCD8::GFP를 표지하기 위한 닭 항-GFP(1:1000)⁸.
5. 1차 항체를 피펫팅합니다. PBST로 각각 20분씩 3번씩 뇌를 세척합니다. 일정한 회전으로 RT에서 2시간 동안 0.2% BSA + 0.1% NGS로 PBST에 희석된 2차 항체로 뇌를 배양합니다.
   참고: 또는 4 °C에서 밤새(14-16시간) 뇌를 배양합니다. PBST에서 0.2% BSA + 0.1% NGS로 항체를 희석합니다. 2차 항체: 488 goat anti-chicken (1:250) and 546 goat anti-rat (1:250).
6. 2차 항체를 피펫팅합니다. PBST로 각각 20분씩 3번씩 뇌를 세척합니다. PBS로 20분 동안 뇌를 씻어 마무리합니다(그림 1D).
7. 유리 현미경 슬라이드(75mm x 25mm)를 준비합니다. 두 개의 얇은 양면 접착 테이프 스트립을 슬라이드에 ~25mm 간격으로 추가합니다. 이것은 뇌를 부수는 것을 방지하기 위한 스페이서를 제공합니다.
8. 뇌를 장착하기 위해 두 테이프 스트립 사이에 ~10-15μL의 장착 매체를 피펫팅합니다. PBST로 미리 헹궈진 P20 피펫 팁을 사용하여 라벨이 부착된 브레인을 현미경 슬라이드에 옮깁니다(그림 1E).
9. 뇌가 이식되면 가는 붓을 사용하여 정렬하고 더듬이엽이 위쪽을 향하도록 합니다. 더듬이 로브를 포함할 아치형 혹이 있는 면을 찾으십시오.
10. 뇌의 방향이 제대로 잡히면 유리 커버슬립(No. 1.5H)으로 덮어 커버슬립이 테이프에 단단히 고정되었는지 확인합니다. 그런 다음 커버슬립의 측면을 추가 장착 매체로 채웁니다(그림 1E).
11. 커버슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 완전히 건조시킨 다음 후속 이미징을 위해 냉장고에 보관합니다.

4. 공초점 이미징

1. 이미징 전에 모든 뇌 슬라이드를 유전자형과 경험 상태 모두에 대해 블라인드 블라인드 하여 나중에 해독할 수 있도록 슬라이드에 암호화된 레이블을 표시합니다.
2. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하십시오. 여기에 표시된 모든 이미지에는 Zeiss 510 META 현미경이 사용되었습니다(그림 1F).
3. 사용된 형광단에 적합한 레이저 라인을 사용하십시오. 여기서는 Argon 488 및 HeNe 543 레이저를 사용하여 더듬이엽 시냅스 사구체 및 Or42a 후각 감각 뉴런 이미징을 수행합니다(그림 2).
4. 두 채널 모두에 대한 최적의 게인과 오프셋을 결정하며, 이상적으로는 두 채널 모두에 대한 게인 <750 및 오프셋 ≈0을 유지합니다. 이는 배경을 제한하면서 신호 대 잡음비가 최적이 되도록 하기 위해 수행됩니다.
5. 이미징을 뇌 중앙에 배치합니다. 이미징 시 VM7 사구체는 절개 중 식도를 제거한 후 뇌 중앙의 왼쪽 구멍에 근접하게 존재합니다(그림 2A).
   알림: VM7 사구체는 항상 식도 입구에 가깝습니다. 그러나 정확한 위치와 크기는 뇌 박리와 장착 차이에 따라 약간 다르므로 이미징 시 이 점을 고려해야 합니다.
6. 이미징 해상도(imaging resolution)와 optical slice 두께를 선택합니다. 여기서는 1024 x 1024 해상도와 0.37μm의 Z-스택 슬라이스 두께가 사용됩니다.
7. 더듬이 로브를 통해 전체 공초점 Z-stack 투영을 수행하여 VM7 사구체의 전체 Or42a 뉴런 신경 분포를 캡처합니다.

5. 시냅스 측정

1. 유전자형/조건맹 영상을 Fiji(1.54f)에 불러옵니다. 이미지 > 색상 > 채널 분할을 클릭하여 레이저 라인 채널을 분할합니다.
2. Or42a 후각 감각 채널에서 Z-스택 전체를 스크롤하여 형광이 시작되고 끝나는 위치를 식별하여 Or42a 신경 분포가 포함된 슬라이스를 확인합니다.
3. Image > Stacks > Z Project > Sum Slices를 클릭하고 원하는 범위를 입력하여 Or42a 뉴런 신경을 포함하는 슬라이스만 포함하는 합계 슬라이스 투영법을 만듭니다.
4. 피지에서는 상단 표시줄의 올가미 도구를 클릭하여 VM7 사구체의 Or42a 뉴런 신경 분포의 윤곽을 추적하여 각 뇌 쪽 사구체를 독립적으로 처리합니다(그림 3).
5. 둘레에 Z-stack 슬라이스의 수와 각 슬라이스의 두께를 곱하여 VM7 시냅스 사구체 신경 분포 부피를 얻습니다. 시냅스 수를 정량화하기 위해 최대 값 찾기 도구를 최대 스택 찾기 매크로와 함께 사용하여 윤곽이 표시된 영역^8,15에서 시냅스 점을 계산할 수 있습니다.

결과

그림 1 은 후각 경험에 따른 임계 기간 냄새 노출 및 뇌 영상 방법에 대한 워크플로우를 보여줍니다. 이 프로토콜은 에클로젼 직전에 pharate dark pupae의 연령 일치로 시작합니다(그림 1A). 번데기를 4시간 동안 냄새 챔버에 넣은 다음 새로 닫힌 성체를 차량 제어 또는 투여된 EB 냄새 챔버에서 새 바이알로 뒤집습니다(그림 1B). 우리는 일반적으로 24시간 동안 냄새 물질에 노출되지만 어떤 기간이든 가능합니다. 냄새에 노출된 후 뇌 절개는 흉부에서 머리를 제거한 다음 미세한 집게로 큐티클 외골격을 제거하는 것으로 시작됩니다(그림 1C). 분리된 뇌는 이미징을 방해할 수 있는 관련 조직을 청소한 다음 즉시 PBS에서 4% 파라포름알데히드와 4% 자당으로 고정합니다. 30분의 짧은 고정은 뇌 조직의 좋은 무결성을 위해 충분합니다. 면역세포화학적 프로토콜은 1시간 블록(예: BSA, NGS)으로 시작하여 1차 항체(예: anti-GFP, -CadN)에서 하룻밤 동안 배양한 다음 2차 항체에서 2시간 동안 잠깐 배양합니다(그림 1D). 라벨이 부착된 뇌는 더듬이엽을 가장 잘 촬영할 수 있도록 뇌 등쪽 표면이 위로 향하게 하여 밀봉된 커버슬립 아래의 유리 슬라이드에 장착됩니다(그림 1E). 모든 샘플은 유전자형과 경험 조건 모두에 대해 맹검되어 나중에 해독할 수 있도록 슬라이드에 코딩된 지정을 표시합니다. 63x 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경은 중추 뇌 더듬이 엽을 이미지화하는 데 사용됩니다(그림 1F). 사용되는 형광단에 가장 적합한 레이저 라인(예: Argon 488 및 HeNe 543)을 선택하여 주변 사구체의 맥락에서 VM7의 Or42a 후각 감각 뉴런 신경 분포를 이미지화합니다.

VM7 사구체에서 Or42a 뉴런 신경 분포의 전체 Z-stack 투영을 캡처하기 위해 최적의 게인, 오프셋, 이미징 해상도 및 광학 슬라이스 두께를 선택하는 것이 중요합니다. 비교할 모든 유전자형과 경험 조건은 동일한 현미경 설정으로 이미징됩니다. Z-stack은 주로 신경 분포 볼륨 ^7,14에 의해 평가되는 경험 종속 변화와 함께 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 처리됩니다. 체적 측정을 계산하는 방법에는 두 가지가 있습니다. ImageJ 올가미 함수를 사용하여 신경 분포 영역을 슬라이스 단위로 계산한 다음 각 값에 각 슬라이스의 두께(μm^)8,9를 곱합니다. 다른 하나는 합계 슬라이스 Z-투영을 사용하고 Z-스택 슬라이스 수에 슬라이스 두께를 곱하여 평균 볼륨을 결정합니다. 두 방법 모두 일관된 결과를 제공합니다. 부피 측정 외에도 형광 강도는 VM7 glomeruli¹⁶의 최대 강도 투영으로 평가할 수도 있습니다. 모든 픽셀의 가중치 합계는 ImageJ 합계 슬라이스 최대 투영을 통해 평가되며, 각 강도 수준의 픽셀 수를 합산하여 전체 강도 ^8,9를 계산합니다. 배경은 동일한 크기의 사구체 외 영역을 정량화하여 뺄 수 있습니다. 이 빼기 방법은 시간이 더 많이 걸리지만 각 뇌 샘플에서 다양한 수준의 배경 항체 라벨링을 고려하여 신경 분포 형광 강도 값의 보다 대표적인 정량화를 생성하기 때문에 더 정확합니다. 강도 측정은 Z-스택 내에서 18-30개의 광학 슬라이스(0.37 μm/슬라이스)의 일반적인 범위에서 이루어지며, 각 브레인⁽¹⁶)에 대해 평균화된다. 거의 모든 경우에서 신경 분포 형광 강도 및 부피 측정은 일관된 결과를 제공합니다.

모든 측정 방식에서 대표적인 결과는 흔들리지 않습니다. 생애 초기의 EB 냄새 경험은 Or42a 뉴런 신경 분포의 상당한 손실을 초래합니다. VM7 사구체는 정밀하게 매핑된 다른 더듬이엽 후각 사구체(그림 2A) 중에서 크기, 모양 및 위치에 의해 신뢰할 수 있게 식별될 수 있으며, 항신경 cadherin(CadN)을 사용한 사구체 표지와 결합된 Or42a-mCD8::GFP 멤브레인 라벨의 표적 발현에 의해 식별될 수 있습니다. 그림 2B). 냄새를 맡는 차량 제어(미네랄 오일)에 시간 동안 노출되면 Or42a 뉴런 신경 분포가 처리되지 않은 정상 동물과 구별할 수 없게 됩니다. 그럼에도 불구하고, 폐폐 후 처음 몇 일 동안(dpe) EB 냄새 경험은 시냅스 사구체 가지치기를 유발합니다(그림 2C). 이 가지치기 메커니즘은 짧은 초기의 임계 기간^(critical period ^8,10)에 전적으로 국한되어 있다. 우리는 일반적으로 24시간 냄새 노출을 사용하여 VM7 사구체 시냅스 가지치기와 그에 따른 청소년 초파리 뇌의 신경 분포 부피 감소를 평가합니다. 냄새 나는 차량 제어 장치(미네랄 오일)에 24시간(0-1 dpe) 노출되면 양쪽 뇌 반구 더듬이엽의 VM7 시냅스 사구체(흰색 점선 원)에서 정상적이고 조밀한 Or42a-mCD8::GFP 신경 분포(녹색)가 유지됩니다(그림 2D, 왼쪽). 현저한 대조적으로, 미네랄 오일에 용해 된 25 % EB 냄새 물질에 24 시간 노출 (0-1 dpe)은 Or42a-mCD8 :: GFP 신경 분포 (녹색)의 강한 가지 치기와 시냅스 사구체 부피의 손실을 초래합니다 (그림 2D, 오른쪽). 이러한 결과는 시각적으로 명확하고 일관되게 명확합니다. 이 냄새 경험 프로토콜의 가장 큰 속성 중 하나는 뇌 영상 결과의 선명도이며, 이는 또한 간단한 신경 분포, 형광 강도 및 부피 정량화에 매우 적합합니다.

이 냄새 경험 프로토콜의 주요 장점은 임계 기간 시냅스 가지치기 동안 시간적 제한 및 냄새 용량 의존적 메커니즘 연구에 활용할 수 있다는 것입니다. VM7 사구체에서 EB 구동 Or42a 뉴런 시냅스 제거를 위해 리모델링 메커니즘은 주로 초기 유년기(0-2 dpe)로 제한되며, 가장 높은 EB 노출 수준⁸에서 경미한 조절을 제외하고는 성숙기(7-9 dpe)에서 감지할 수 있는 경험 의존적 시냅스 가지치기가 없습니다. 이러한 시간적 제한은 임계 기간을 정의하며, 이 타이밍 메커니즘을 이해하는 것이 중요한 목표입니다. 이 프로토콜의 또 다른 특징은 경험 의존적 시냅스 가지치기(experience-dependent synaptic pruning)가 EB 용량 의존적(EB dose-depended)이라는 것입니다(그림 3). EB 냄새 물질이 0% 인 냄새 물질 차량 제어 장치(미네랄 오일)에 시간 동안 노출되면 VM7 시냅스 사구체의 정상적인 Or42a 신경 분포가 발생하며, 이는 처리되지 않은 동물과 구별할 수 없습니다. Or42a 뉴런 신경 분포 3차원 부피를 계산하면 정상적인 청소년 뇌의 전형적인 크기(2260 μm³; 그림 3A, 왼쪽). 대표적인 결과는 EB 냄새 농도가 증가하면 점진적으로 더 큰 시냅스 사구체 가지치기를 유발한다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 15% EB 냄새 물질에 24시간(0-1 dpe)을 노출시키면 명확하고 일관된 신경 손실이 발생합니다(그림 3A, 가운데). 3D 신경 분포 부피의 정량화는 차량 제어 장치에 비해 현저한 감소를 보여줍니다(760 μm³ 대 2260 μm³). 25% EB 냄새 물질에 24시간 노출(0-1 dpe)하면 훨씬 더 많은 신경 손실이 발생합니다(281 μm³; 그림 3A, 오른쪽). 이러한 EB 냄새 농도 범위에 대한 대표적인 정량화는 형광 강도(그림 3B) 및 신경 분포 부피(그림 3C)에 대해 일관된 결과를 보여줍니다. 이러한 용량 의존성은 시냅스 가지치기를 예방하는 수단을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 더 낮은 냄새 노출로 가지치기를 강화하여 증가된 시냅스 사구체 리모델링을 입증할 수 있습니다. 일부 선행 연구에서는 이 프로토콜과 함께 다른 냄새 물질을 사용하여 사구체 부피를 증가시키는 반대 효과를 보여주었다¹⁰. 임계 기간에 EB 냄새 물질에 노출되면 항상 눈에 띄고 쉽게 감지할 수 있는 시냅스 사구체 가지치기가 발생합니다.

그림 1: Drosophila juvenile brain의 냄새 노출 연구 흐름도. (A) Pharate dark pupae (25 ° C에서 번데기 후 90 + 시간)를 수집하여 냄새 챔버에 넣습니다. 냄새가 나는 조건에서는 4 시간 동안 에클로전이 허용되고 어린 파리는 신선한 바이알로 옮겨집니다. (B) 연령에 맞는 파리는 차량 제어(100% 미네랄 오일) 또는 에틸 부티레이트(EB; 미네랄 오일의 경우 % v/v) 경험 조건으로 나뉩니다. 가는 철망(삽입)은 냄새 물질에 접근할 수 있도록 합니다. 파리는 일반적으로 추가로 20시간 동안 노출되어 총 24시간 동안 노출되며, 폐폐 후 0-1일(DPE)이 됩니다. (C) 파리는 먼저 머리를 제거하여 해부한 다음 미세한 집게를 사용하여 큐티클 외골격을 섬세하게 제거하고 어린 뇌를 분리합니다. 고립된 뇌는 주변의 모든 조직과 돌출된 기관을 제거합니다. (D) 고립된 뇌는 고정되고 차단된 다음 1차 및 2차 항체에서 순차적으로 배양됩니다. 일반적으로 사용되는 항체의 범위에는 더듬이엽 시냅스 사구체를 드러내는 일반 막 프로브와 Or42a 후각 감각 뉴런을 위한 특정 막 프로브가 포함됩니다. (E) 라벨이 부착된 뇌는 밀봉된 커버슬립 아래에 테이프 스페이서가 있는 유리 현미경 슬라이드의 장착 매체에 배치됩니다. 올바른 뇌 방향(등쪽 표면이 위로)은 더듬이엽의 최적 이미징을 위해 중요합니다. (F) 레이저 스캐닝 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 뇌를 이미지화합니다. 모든 샘플은 이미징 및 후속 정량화 분석 전에 유전자형 및 경험 조건에 대해 블라인드 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 냄새 경험 의존적 임계 기간 시냅스 사구체 가지치기. (A) 더듬이엽(AL) 후각 사구체가 정확하게 매핑되어 있습니다. 몇 가지 대표적인 시냅스 사구체가 표시됩니다. Or42a 수용체 후각 감각 뉴런(OSN) 계열은 VM7 사구체를 특이적으로 자극합니다. (B) Or42a-mCD8::GFP 태그가 붙은 뉴런(녹색)은 모든 AL 시냅스 사구체(자홍색)의 N-Cadherin(CadN) 항체 표지를 통해 뇌의 왼쪽(L)과 오른쪽(R)에 있는 쌍을 이루는 VM7 사구체를 조밀하게 신경 분포시킵니다. 플라이 라인은 w¹¹¹⁸입니다. 또는42a-mCD8::GFP/+. (C) 차량 제어 조건(100% 미네랄 오일, 왼쪽) 및 청소년 임계 기간 동안 에틸 부티레이트 노출(미네랄 오일의 % EB v/v, 오른쪽)에서 VM7 시냅스 사구체의 Or42a OSN 신경 분포의 개략적인 그래픽 표현. 경험에 의존하는 신경 분포 가지치기는 시냅스가 제거되고 축삭이 손실되어 신경 분포량이 감소하는 초기 EB 노출에서만 발생합니다. (D) 한 쌍의 VM7 시냅스 사구체의 Or42a OSN 신경 분포의 대표적인 공초점 이미지(점선 흰색 윤곽선 원; Or42a-mCD8::GFP, 녹색) 오일 차량 제어(왼쪽) 및 24시간(0-1 dpe) 동안 25% EB 노출(오른쪽) 후. EB 냄새 경험은 시냅스 가지치기와 신경 분포 부피의 손실을 유발합니다. 이 경험 의존적 메커니즘은 시간적으로 제한되며 폐쇄 후 처음 며칠 동안 잘 정의된 후각 결정적 기간 내에서만 일시적으로 되돌릴 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: EB 용량 의존적 시냅스 사구체 신경 분포 형광 강도 및 부피 정량화. (A) 0-1 dpe에서 냄새 차량 미네랄 오일 컨트롤(0% EB, 왼쪽), 15% EB(가운데) 또는 25% EB(오른쪽)에 노출된 VM7 시냅스 사구체(녹색)에서 Or42a-mCD8::GFP 표지된 신경 분포. 아래: 사구체 신경 분포가 윤곽선으로 표시된 동일한 이미지(흰색 원)와 3차원 신경 분포 부피가 계산되었습니다. 차량 제어는 Or42a 뉴런에 의한 VM7 시냅스 사구체 신경 분포를 가지고 있어 처리되지 않은 동물과 구별할 수 없습니다. 15%의 EB 냄새 물질 노출에 대한 임계 기간 경험은 명백한 시냅스 사구체 가지치기를 초래하며, 이 경우 3차원 신경 분포 부피가 66% 감소합니다. 더 높은 수준의 25% EB에 노출되면 가지치기가 더 커지며 이 경우 시냅스 사구체 부피가 거의 90% 손실됩니다. 따라서 냄새 경험이 증가함에 따라 용량 의존적 가지 치기를 이미지 할 수 있습니다. (B) 0-1 dpe에서 냄새 차량 제어 (오일, 녹색), 15 % EB (중간, 주황색) 또는 25 % EB (오른쪽, 검은 색)에 노출 된 VM7 시냅스 사구체 내 Or42a-mCD8 :: GFP 표지 형광 강도의 대표 결과. (C) 동일한 임계 기간 냄새 노출 조건에서 VM7 사구체 3차원 신경 분포 볼륨의 대표 결과. 산점도는 평균이 SEM을 ±하는 모든 개별 데이터 점을 표시합니다. 유의성은 p≤0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***) 및 p ≤ 0.0001 (****)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 냄새 노출 및 뇌 영상 프로토콜은 생애 초기의 중요한 기간 동안 경험 의존적 후각 감각 뉴런 시냅스 사구체 가지치기를 안정적으로 유도하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 후각 회로 리모델링을 탐구하기 위해 이 치료 패러다임을 활용한 초기 연구는 폐막 후 2^일째에 냄새 노출을 시작했습니다 ^3,4,5. 대조적으로, 우리는 성체 폐쇄 이전에 pharate 번데기에서 냄새 노출을 시작하고 대부분의 리모델링이 폐쇄 후 처음 24시간 이내에 발생한다는 것을 발견했습니다 ^8,9. 따라서 이 냄새 유발 물질 노출 프로토콜의 필수 단계는 에클로젼 전에 단계적 어두운 번데기를 냄새 챔버에 넣는 것입니다(그림 1). 이것은 번데기 냄새 유발 물질 노출 자체를 위한 것이 아니라 성체 배출 즉시 냄새 유발 물질 노출을 보장하기 위한 것입니다. 우리는 빡빡한 시간적 창 내에서 연령을 동기화하고 냄새 노출 시간의 차이를 피하기 위해 병기 결정 후 4시간 후에 폐쇄된 청소년 성인을 선택했습니다. 이러한 조기 경험 간격은 EB 후각 습관화가 폐쇄 후 단 2일 후에 닫힌다는 것을 보여주는 최근 연구와 일치한다¹⁰. 그러나 임계 기간(예: 0-1일 대 1-2일) 내 냄새 노출 시기 차이의 결과는 잘 특성화되지 않았습니다. Or42a 후각 감각 뉴런은 더듬이엽의 VM7 사구체를 선택적으로 신경 자극하며, 이는 정확한 사구체 지도와 표적 신경 분포 표지를 기반으로 쉽게 식별할 수 있습니다(예: Or42a-mCD8::GFP; 그림 2). 임계 기간 동안 EB 냄새 물질 노출은 Or42a 프로모터 발현 또는 리포터 수준을 변경하지 않습니다⁸. 시간 제한 냄새 노출은 Or42a 수용체 뉴런에서 순차적인 시냅스 제거 및 축삭 신경 분포 손실을 유발합니다. 이 가지 치기는 초기 임계 기간 (0-2 dpe) 내에 완전히 되돌릴 수 있지만 냄새 환경의 변화가 더 이상 신경 분포를 변경하지 않는 성인 성숙기 (7-9 dpe)에는 되돌릴 수 없습니다. 이 감각 경험 의존 메커니즘의 엄격한 시간적 제약은 이 분야에서 가장 두드러진 질문이다. 만기에 임계시기와 같은 가소성을 다시 열기 위한 많은 시도가 이루어지고 있습니다. 여기에 제공된 프로토콜은 조사를 위한 강력한 수단입니다.

여기에 설명된 냄새 노출 및 뇌 영상 프로토콜의 용이성은 광범위한 접근성과 광범위한 적응성을 허용합니다. 냄새 노출 경험 시작, 종료 및 기간은 모두 전적으로 조사자의 재량에 달려 있어 임계 기간 특성, 리모델링 가역성 및 임계 기간과 같은 가소성의 재개에 대한 표적 연구를 허용합니다. 마찬가지로, 냄새 경험의 강도는 용량 의존적 시냅스 사구체 가지치기 연구를 위해 쉽게 조작할 수 있습니다(그림 3). 중요한 것은 더 낮은 EB 농도(예: 15% EB)를 사용하는 연구를 사용하여 시냅스 사구체 리모델링의 속도 또는 범위를 향상시킬 수 있는 조작을 테스트할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 결과는 낮은 EB 수준(예: 15%)에서 시냅스 가지치기가 더 높은 EB 수준(예: 25%)과 구별할 수 없음을 보여줄 수 있습니다. 다양한 조작에서 결과를 냄새 유발 차량 제어의 일관된 신경 분포 및 25% EB에서 발생하는 강력한 시냅스 사구체 가지치기와 비교할 수 있습니다(그림 3). 이 방법의 한 가지 한계는 냄새 물질 노출이 전적으로 용해된 냄새 물질의 휘발성에 의존한다는 것입니다. 온도 및 상대 습도와 같은 다양한 요인이 냄새 노출 효과에 영향을 미친다⁸. 부취제 챔버의 파리 밀도는 예를 들어 파리 유래 부취 물질의 생산을 통해 부취 물질 노출에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 바이알 당 20-25 파리 이하의 밀도가 권장됩니다. 매우 강한 시냅스 사구체 가지치기를 유도하는 데 필요한 냄새 농도는 자연에서 일반적으로 경험하는 것보다 높을 수 있습니다^10,17. 더 낮은 냄새 농도에서 시냅스 제거를 분석하려면 훨씬 더 높은 해상도의 이미징 기술이 필요합니다. 그러나 현재 프로토콜은 다양한 조작에 대해 일관되고 신뢰할 수 있는 연구를 허용합니다.

이 냄새 노출 및 뇌 영상 프로토콜에는 엄청난 이점이 있습니다. 초파리(Drosophila)는 광범위하고 정교한 유전자 툴킷에 기반을 둔 매우 유리한 동물 모델로, 임계시기 후각 회로 리모델링에서 유전자-환경 상호 작용에 대한 광범위한 연구를 위해 체계적으로 활용될 수 있습니다. 여기에 표시된 예로는 Or42a-Gal4 형질전환 드라이버 라인, UAS-mCD8::GFP 멤브레인 마커 및 Or42a-mCD8::GFP 직접 융합이 있습니다. Or42a 직접 융합을 사용한 시냅스 사구체 가지치기와 Gal4/UAS 간접 라벨링 접근법 ^8,9 사이에는 구별할 수 있는 차이점이 없습니다. Or42a-Gal4 드라이버는 표적 후각 수용체 뉴런을 조작하고 VM7 신경 분포의 경험 의존적 변화를 시각화할 수 있는 기능을 제공하는 반면, 직접 융합 라인은 다른 세포 표적 조작을 위해 이진 UAS-Gal4 형질전환 시스템을 확보합니다. 광범위한 Drosophila toolkit의 다른 많은 돌연변이 및 유전자 변형 계통을 사용하여 시냅스 가지치기를 매개하는 세포, 후각 경험 정보를 전달하는 세포 간 신호 경로, 표적 시냅스 제거에 필요한 세포 내 기계 식별을 포함하여 시간 제한 및 경험 의존적 메커니즘을 테스트할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 후각 경험 의존적 뇌 회로 리모델링을 주도하는 많은 메커니즘에 대한 체계적인 조사를 가능하게 합니다. 이 냄새 유발 물질 노출 및 뇌 영상 프로토콜은 또한 중요한 시기별 후각 경험 행동 수정, 유전자 및 약학적 조작을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 성숙 시 중요한 시기와 같은 가소성의 재개방을 가능하게 할 수 있으며 시냅스 사구체 가지치기를 넘어 후각 회로 가소성의 다른 측면을 가능하게 할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
냄새 노출용
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
에틸 부티레이트	Sigma Aldrich	E15701
마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	05-408-129
미네랄 오일	시그마 Aldrich	M3516
냄새 챔버	Glasslock
페인트 브러쉬	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
와이어 메쉬	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	157-8	4%
페트리 접시	Fisher Scientific	08-757-100B
인산염 완충 식염수	Thermo Fisher Scientific	70011-044
1x 설탕으로	Fisher Scientific	BP220-1
실가드	전자 현미경 과학	24236-10
트리톤-X 100	피셔 사이언티픽;	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 염소 항닭	Invitrogen	A11039
546 염소 항쥐	Invitrogen	A11081
소 혈청 알부민	Sigma Aldrich	A9647
치킨 안티-GFP	Abcam	13970
커버슬립	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
양면 테이프	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	전자 현미경 과학	17984-25
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
매니큐어	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
컨포칼/분석
어떤 컴퓨터/노트북
컨포칼 현미경	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
피지 소프트웨어	피지		버전 2.14.0/1.54f