대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정은 적절한 뇌 기능에 매우 중요하며, 조절 장애는 출생 후 신경 발달 및 정신 장애를 초래할 수 있습니다. 실제로 이러한 질병의 원인이 되는 많은 유전자가 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으므로 이러한 돌연변이가 세포 역학에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 이러한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 뇌 절편에서 이동하는 뉴런과 신경교 전구 세포의 타임 랩스 이미징 기술을 소개합니다. 세포는 자궁 전기천공법 (in utero electroporation)을 사용하여 형광 단백질로 표지되며, 이는 높은 신호 대 잡음비로 심실 영역에서 이동하는 개별 세포를 시각화합니다. 또한, 이 in vivo 유전자 전달 시스템을 사용하면 발현 또는 knockdown/knockout 벡터의 동시 전기천공을 통해 주어진 유전자에 대한 Gain-of-Function 또는 Loss-of-function 실험을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고정된 뇌에서는 절대 얻을 수 없는 정보인 개별 세포의 이동 행동과 이동 속도를 분석할 수 있습니다.
서론
대뇌피질(cerebral cortex)이 발달하는 동안, 외측심실(lateral ventricle)을 둘러싸고 있는 팔심실영역(pallial ventricular zone, VZ)에 있는 (정점) 요사상교세포(radial glia)는 먼저 뉴런을 생성하고, 그 다음에는 일부 주기가 겹치는 신경교세포(glial progenitor)를 생성한다1. 뉴런은 또한 VZ에 인접한 뇌실하 영역(SVZ)의 중간 전구 세포 또는 기저 요골 아교세포에서 생성되며, 둘 다 (정점) 요골 아교세포 2,3에서 유래합니다. 마우스에서 요골 신경교세포는 배아 일(E) 12-14일에만 뉴런을 생성하고, E15-16에는 뉴런과 신경교 전구세포를, E17 이후에는4.의 신경교세포를 생성합니다. 이러한 배아 단계에서 생성된 신경교세포(glial progenitor)의 주요 집단은 우선적으로 성상교세포(astrocyte)로 분화하지만, 일부 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화하기도 한다5. 이 단계에서 생성된 뉴런과 성상세포(astrocyte) 전구세포는 뇌 표면으로 이....
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프로토콜
본 연구는 발달 연구소, 아이치 발달 장애 센터(#2019-013) 및 게이오 대학(A2021-030)의 동물 보호 및 사용 위원회의 승인과 지침에 따라 수행되었습니다. 시간 제한 임신 ICR(야생형) 마우스를 상업적으로 수득하였다( 재료 표 참조). 이동하는 세포와 혈관 사이의 관계를 관찰하기 위해 내피 세포가 DsRed22를 발현하는 Flt1-DsRed 마우스를 사용했습니다. 수컷 Flt1-DsRed 마우스를 암컷 ICR 마우스와 교배시켰다(두 마우스 모두 8-24주의 연령이었다). 모든 동물은 샘플링 할 때까지 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 수용되고 조작되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 자궁 electroporation에서
- 시판되는 2x HBS에 동일한 양의 오토클레이브수를 첨가하여 HEPES 완충 식염수(HBS) 용액을 준비합니다.
- 마취제에는 두 가지 옵션이 있습니다. 이소플루란(흡입) 및 MMB(주사). MMB를 사용하는 경우 다음과 같이 준비합니다. 0.75mL의 오토클레이브수에 0.75mL의 ....
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결과
pallial VZ의 방사형 신경교세포는 E14까지는 뉴런만 생성하고, E15 및 E16에서는 뉴런과 신경교세포를 모두 생산합니다. 뉴런과 신경교세포의 이동 거동을 동시에 관찰하기 위해 뉴런 특이적 프로모터인 Tα1 promoter27과 성상교세포에서 우선적으로 활성화되는 human glial fibrillary acidic protein(hGFAP) 프로모터28을 사용하여 각각 EGFP(enhanced GFP) 및 RFP로 라벨링했습니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 이동 중에 세포 분열을 반복하여 세포의 플라스미드를 희석시킵니다. 이를 피하기 위해, donor plasmid (pPB) 및 transposase expression vector (pCAG-hyPBase)로 구성되는 transposon 벡터 시스템을 사용하였다29,30
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토론
이 프로토콜은 pallial(cortical) VZ에서 유래한 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 도입했습니다. VZ에서 이동하는 세포를 라벨링하기 위해 우리는 자궁 전기천공법(utero electroporation)을 사용했는데, 이 경우 바이러스 벡터 매개 라벨링보다 더 높은 신호 대 잡음비로 개별 세포를 명확하게 라벨링했습니다. 자궁 전기천공법(utero electroporation)에 사용하여, 어떤 조합으로든 모든 유형의 벡터를 살아있는 배아의 요골 신경교세포(신경줄기세포)에 쉽게 도입할 수 있습니다. 뉴런(neuron)과 신경교세포(glial progenitor)는 서로 다른 promoter를 사용하여 선택적으로 표지할 수 있습니다. in utero electroporation에 의해 도입된 plasmid의 복제 수가 많기 때문에 GFP 발현 벡터와 발현 벡터 및 knockdown/knockout 벡터와 같은 관심 유전자와 관련된 다양한 벡터의 동시 전기천공을 통해 gain-.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
Tα1 프로모터는 P. Barker와 F.D. Miller의 선물입니다. Dcx 프로모터는 Q. Lu의 선물입니다. hGFAP-Cre는 Albee Messing의 선물입니다. PiggyBac transposon 벡터 시스템은 Sanger Institute에서 제공했습니다. Flt1-DsRed 마우스는 M. Ema (Shiga University)에 의해 제공되었다. 이 연구는 JSPS KAKENHI(JP20H05688 타바타에게 보조금 번호 JP21K07309, K. 나카지마에게 JP22K19365)와 다케다 과학 재단, 교육 연구 진흥을 위한 게이오 기주쿠 후쿠자와 기념 기금, K. 나카지마에 게이오 기주쿠 학술 개발 기금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 흡인기 튜브 어셈블리 | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
| 컨포칼 현미경 | 니콘 | A1RHD25 | 긴 작동 거리 렌즈 장착 (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| 배양실 | Tokken | TK-NBCMP | 맞춤형 |
| Electroporator | NEPA 유전자 | NEPA21 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 가스 혼합 | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| 유리 베이스 접시 | Iwaki | 3910-035 | 유리 베이스의 직경은 27mm |
| 유리 모세관 | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| 히터 유닛 | Tokken | TK-0003HU20 | 후드 및 히터를 포함한 맞춤 제작 |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | Albee Messing ImageJ |
| https://imagej.net/ij/ | |||
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| 저융온 아가로스 | Lonza | 50100 | |
| Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| 마이크로인젝터 | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | pCMV-hyPBase(Sanger Institute의 기증품)로부터의 hyPBase cDNA를 pCAGGS의 CAG 프로모터(J. Miyazaki의 기증품)의 다운스트림에 삽입하였다. | ||
| pDcx-Dre | Dcx4kbEGFP70(Q. Lu의 선물)의 Dcx 프로모터를 pCAG-NLS-HA-Dre34(Pawel Pelczar, Addgene #51272의 선물)의 CAG 프로모터와 교환했습니다. | ||
| 페니실린 + 스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 플라스미드 정제 키트 | |||
| Connie Cepko, Addgene #13769의 선물) 및 TurboRFP cDNA(Evrogen, FP232)를 pPB-CAG.EBNXN(Sanger Institute의 선물)의 클로닝 부위에 삽입했습니다. | |||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | pEGFP-N1 (Clontech, U55762)의 합성 rox 부위, 합성 DIO 카세트 및 EGFP cDNA를 역방향으로 포함하는 서열은 pPB-CAG.EBNXN (Sanger Institute의 선물)의 복제 부위에 삽입되었습니다. 시퀀스는 추가 파일에 제공됩니다. | ||
| 끌어당기는 사람 | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | 플러그인 ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| 봉합 바늘 | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 서클 봉합사 14mm |
| 봉합사 | Nazme C-23-B2 | 실크 크기 5-0 | |
| 시간 임산부 ICR (와일드 타입) 마우스 | 일본 SLC | ICR 마우스 | |
| TrackMate | |||
| https://imagej.net/plugins/trackmate/index 핀셋 전극 | BEX 또는 NEPA 유전자 | CUY650P5 | |
| 티&알파; | EGFP cDNA를 T&alpha의 다운스트림에 삽입하였다; 플라스미드 253의 프로모터 1개(P. Barker 및 F.D.Miller의 선물) | ||
| 진동 마이크로톰 | Leica 또는 Zeiss | 진동 블레이드 마이크로톰 VT1000S 또는 Hyrax V50. |
참고문헌
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric d....
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