방법 논문

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

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DOI:

10.3791/66631

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2024년 3월 8일

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

이 논문에서

요약

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

초록

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정은 적절한 뇌 기능에 매우 중요하며, 조절 장애는 출생 후 신경 발달 및 정신 장애를 초래할 수 있습니다. 실제로 이러한 질병의 원인이 되는 많은 유전자가 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으므로 이러한 돌연변이가 세포 역학에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 이러한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 뇌 절편에서 이동하는 뉴런과 신경교 전구 세포의 타임 랩스 이미징 기술을 소개합니다. 세포는 자궁 전기천공법 (in utero electroporation)을 사용하여 형광 단백질로 표지되며, 이는 높은 신호 대 잡음비로 심실 영역에서 이동하는 개별 세포를 시각화합니다. 또한, 이 in vivo 유전자 전달 시스템을 사용하면 발현 또는 knockdown/knockout 벡터의 동시 전기천공을 통해 주어진 유전자에 대한 Gain-of-Function 또는 Loss-of-function 실험을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고정된 뇌에서는 절대 얻을 수 없는 정보인 개별 세포의 이동 행동과 이동 속도를 분석할 수 있습니다.

서론

대뇌피질(cerebral cortex)이 발달하는 동안, 외측심실(lateral ventricle)을 둘러싸고 있는 팔심실영역(pallial ventricular zone, VZ)에 있는 (정점) 요사상교세포(radial glia)는 먼저 뉴런을 생성하고, 그 다음에는 일부 주기가 겹치는 신경교세포(glial progenitor)를 생성한다1. 뉴런은 또한 VZ에 인접한 뇌실하 영역(SVZ)의 중간 전구 세포 또는 기저 요골 아교세포에서 생성되며, 둘 다 (정점) 요골 아교세포 2,3에서 유래합니다. 마우스에서 요골 신경교세포는 배아 일(E) 12-14일에만 뉴런을 생성하고, E15-16에는 뉴런과 신경교 전구세포를, E17 이후에는4.의 신경교세포를 생성합니다. 이러한 배아 단계에서 생성된 신경교세포(glial progenitor)의 주요 집단은 우선적으로 성상교세포(astrocyte)로 분화하지만, 일부 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화하기도 한다5. 이 단계에서 생성된 뉴런과 성상세포(astrocyte) 전구세포는 뇌 표면으로 이동하여 피질판(cortical plate, 미래의 대뇌피질 회백질)으로 들어갑니다. VZ에서 피질판으로의 신경 세포 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 뉴런은 먼저 SVZ 또는 중간 영역과 겹치는 다극 세포 축적 영역(MAZ) 바로 위의 다극 형태를 채택하여 여러 얇은 돌기를 격렬하게 확장 및 수축하고 천천히 이동(다극 이동)합니다(다극 이동)6,7. 약 24시간 후, 뉴런은 양극성 형태로 변형되어 두꺼운 선행 돌기를 뇌 표면 쪽으로 확장하고 얇은 후행 돌기를 뒤로 확장하고, 요골 아교세포에서 pial 표면까지 확장되는 방사형 돌기를 골격으로 사용하여 뇌 표면을 향해 선형으로 이동하는데, 이를 운동 모드 2,8이라고 합니다. 운동 모드의 뉴런은 항상 피질판의 가장 바깥쪽 표면에 도달하기 때문에 가장자리 영역 바로 아래의 선행 뉴런을 통과하기 때문에 뉴런은 피질판 9,10,11에서 생년월일에 의존하는 안팎으로 정렬됩니다.

대조적으로, 성상교세포(astrocyte) 전구세포는 중간 영역(intermediate zone)과 피질판(cortical plate)으로 빠르게 이동하며 빈번한 방향 변화를 겪습니다. 이러한 이동 행동은 신경 세포의 이동과는 완전히 다르며, 불규칙한 이동(erratic migration)이라고 불린다5. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 또한 혈관 유도 이동(bloodvessel-guided migration)이라고 불리는 과정에서 혈관을 따라 이동합니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 이러한 이동 모드 사이를 전환하여 피질판(cortical plate) 5,12에 도달합니다. 성상세포(astrocyte)의 위치가 생산 날짜에 의해 엄격하게 결정되는 것은 아니지만, 일찍 태어난 성상교세포(astrocyte)가 피질판의 표피부에 정착하는 경미한 경향이 관찰되었다5. 흥미롭게도, 대뇌피질판에 정착한 성상세포는 배아 단계에서 생성되어 결국 원형질 성상세포로 분화하는 반면, 출생 후에 생성된 성상세포는 활발하게 이동하지 않고 백질에 남아 섬유성 성상세포로 분화한다5. 성상세포(astrocytic) 아형의 이러한 병기 의존적 사양이 어떻게 발생하는지는 불분명하다.

신경 발달 및 정신 장애에 관여하는 유전자를 포함하여 신경 세포 이동에 관여하는 유전자의 수가 점점 더 많이 확인되고 있습니다13,14. 따라서 이러한 유전자의 돌연변이가 이동하는 뉴런의 행동에 미치는 영향을 밝히는 것이 중요합니다. 앞서 언급했듯이 뉴런 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 타임랩스 관찰은 주로 영향을 받는 단계(세포 주기 종료, 다극-양극 전이, 이동 속도 등)를 직접 결정할 수 있습니다. 그러나 성상세포의 사양, 이동 및 위치의 기저에 있는 분자 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. 성상교세포(astrocyte)가 뇌 발달 중 시냅토형성(synaptogenesis)15과 혈액뇌장벽(blood-brain barrier) 형성에 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때16, 성상세포의 발달 결함은 신경발달 장애를 초래할 수 있다. 성상교세포 전구세포에 대한 타임랩스 연구는 이러한 분자 메커니즘과 정신 질환과의 관계를 명확히 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 대뇌 피질 VZ 유래 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 제공합니다. 신경 세포 이동을 관찰하기 위한 유사한 비디오 프로토콜이 이미 발표되었다17. 여기에서는 뉴런과 성상교세포 전구세포를 모두 이동하는 방법을 설명합니다. 이들 세포를 녹색 및 적색 형광 단백질(GFP 및 RFP)과 같은 형광 단백질로 라벨링하기 위해, 적절한 성분을 함유하는 플라스미드 혼합물 을 적절한 단계 18,19,20,21에서 자궁 내 전기천공법에 의해 대뇌 피질 VZ로 도입한다. 조작된 배아는 원하는 단계에서 제거되고, 뇌는 잘게 쪼개져 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 타임랩스 관찰에 사용됩니다. 이동 속도, 방향 및 기타 행동은 고정된 뇌 샘플로는 다루지 않지만 이 방법을 사용하여 검사할 수 있습니다. in utero electroporation을 사용하면 expression 및 knockdown/knockout 벡터를 형광 단백질 벡터와 동시에 쉽게 전달할 수 있으므로 특정 유전자에 대한 Gain-of-Function 및 Loss-of-Function 연구를 수행할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 발달 연구소, 아이치 발달 장애 센터(#2019-013) 및 게이오 대학(A2021-030)의 동물 보호 및 사용 위원회의 승인과 지침에 따라 수행되었습니다. 시간 제한 임신 ICR(야생형) 마우스를 상업적으로 수득하였다( 재료 표 참조). 이동하는 세포와 혈관 사이의 관계를 관찰하기 위해 내피 세포가 DsRed22를 발현하는 Flt1-DsRed 마우스를 사용했습니다. 수컷 Flt1-DsRed 마우스를 암컷 ICR 마우스와 교배시켰다(두 마우스 모두 8-24주의 연령이었다). 모든 동물은 샘플링 할 때까지 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 수용되고 조작되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 자궁 electroporation에서

  1. 시판되는 2x HBS에 동일한 양의 오토클레이브수를 첨가하여 HEPES 완충 식염수(HBS) 용액을 준비합니다.
  2. 마취제에는 두 가지 옵션이 있습니다. 이소플루란(흡입) 및 MMB(주사). MMB를 사용하는 경우 다음과 같이 준비합니다. 0.75mL의 오토클레이브수에 0.75mL의 메데토미딘(1mg/mL), 2mL의 미다졸람(5mg/mL), 2.5mL의 부토르판올(19.75mg/mL)을 추가합니다.23.
    참고: 이 마취액은 2개월 이내에 활성이 감소합니다. 라이트 쉴드와 함께 4 °C에서 보관하십시오.
  3. 아티파메졸 용액을 준비합니다. 0.75mL의 아티파메졸(5mg/mL)을 24.25mL의 오토클레이브수에 희석합니다.
  4. 오토클레이브된 물에 0.2%(w/v) Fast Green 용액을 준비합니다. 필터(기공 크기 0.22μm)로 살균합니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 알칼리 용해 및 컬럼 정제23 을 기반으로 하는 기존 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 준비합니다( 재료 표 참조). 100mL 박테리아 배양에서 정제된 플라스미드를 30-50 μL의 HBS에 용해시켜 플라스미드 스톡(3-5 μg/μL)을 준비합니다(보충 파일 1).
    1. 플라스미드 스톡을 HBS와 혼합 및 희석하고 0.2% Fast Green의 1/10 부피를 추가하여 주입제를 착색합니다. plasmids의 성분 및 최종 농도는 그 목적에 따라 결정됩니다(표 1).
  6. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당겨 마이크로피펫을 만듭니다.
    알림: 피펫의 끝은 미세한 집게를 사용하여 비스듬히 절단됩니다. 팁의 외경은 약 70μm입니다. 2μL의 물을 빨아들여 2μL 간격으로 마이크로피펫을 표시합니다.
  7. 적절한 단계에서 임신한 쥐에게 체중 10μL/g의 MMB 마취제를 복강내로 주입합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
    참고: 조작할 배아 단계는 목적에 따라 결정되어야 합니다. 미래의 II/III 피라미드 뉴런을 표지하려면 E14.5가 적합합니다. 신경교 전구세포를 라벨링하려면 E15-16에서 전기천공법을 수행해야 합니다. 대안적으로, 마우스는 이소플루란(1%-2%)의 흡입에 의해 마취될 수 있다.
  8. 마우스를 완전히 마취한 후 38°C의 따뜻한 접시에 놓습니다.
    알림: 마우스가 꼬리를 잡는 데 반응하지 않는지 확인하십시오.
  9. 제모 크림을 사용하여 수술 부위 주변의 털을 제거한 후 요오드 성분의 스크럽과 70% 알코올로 수술 부위를 원을 그리며 여러 번 소독합니다. 전방으로 가장 뒤쪽 에 있는 2번째 유두 수준에서 정중선을 따라 2cm 길이의 피부를 절개한 다음 linea alba를 따라 복벽에 2cm 정중선을 절개합니다(그림 1A).
    참고: 복벽을 절개하는 과정에서 내부 장기가 절단되지 않도록 미세한 집게로 살짝 들어 올립니다.
  10. 멸균 플라스틱 시트를 피부에 놓고 그 위에 멸균 티슈 페이퍼 조각을 놓습니다(그림 1A). 중앙에 구멍을 뚫어 수술 부위를 노출시킵니다.
    NOTE: 멸균 플라스틱 시트와 멸균 티슈 페이퍼는 유두의 위치를 기준으로 절개 부위를 배치하기 위해 넓은 시야가 필요하기 때문에 절개 후 배치합니다.
  11. 멸균 PBS로 종이를 적시고 절개 부위에서 자궁 뿔을 주의 깊게 관찰하고 플라스틱 시트와 종이의 구멍을 통해 자궁 뿔을 빼냅니다.
  12. 흡인기 튜브 어셈블리에 부착된 마이크로피펫을 사용하여 호기 압력에 의해 자궁벽을 통해 플라스미드 혼합물 1μL를 왼쪽 또는 오른쪽 외측 심실에 주입합니다(그림 1A).
    NOTE: 또는 microinjector를 사용하여 plasmid를 주입할 수 있습니다.
  13. 핀셋형 전극으로 배아의 머리를 끼우고 전기포레이터(E14-16의 경우 35V, E17의 경우 50V, 450ms 간격의 50ms 구각 펄스, 5회)를 사용하여 전자 펄스를 적용합니다(그림 1A).
    알림: 배아가 손상될 수 있으므로 배아의 머리를 강하게 꼬집지 마십시오. 실제 전류는 40-70mA여야 합니다.
  14. 자궁 뿔을 복강에 다시 넣습니다.
  15. 5-0 명주실을 사용하여 복벽을 봉합합니다.
  16. 체중 10μL/g의 용량으로 아티파메졸 용액을 복강내로 적용합니다.
  17. 5-0 명주실을 사용하여 피부를 봉합합니다.
    참고: 스킨은 자동 클립을 사용하여 닫을 수 있습니다.
  18. 조작된 쥐를 따뜻한 접시에 최소 30분 동안 두십시오. 쥐는 우리 안에서 움직이기 시작할 것입니다.
    참고: 자궁 내 전기천공법 절차(1.7단계에서 1.16단계까지)는 30분 이내에 수행해야 합니다. 일반적인 작동 시간은 20분입니다.

2. 슬라이스 준비

참고: 슬라이스의 신선도는 이 실험 성공의 열쇠입니다. 슬라이스는 2.5시간 이내에 준비해야 합니다(2.5-2.12단계에서).

  1. Ca2 + 및 Mg2 +로 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액을 준비합니다. HBSS(+)입니다. 500mL의 HBSS(-)에 CaCl2 5mL(14g/L, 고압멸균)와 5mL의 MgSO4.7H 2O(20g/L, 고압멸균)를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 95%O2 + 5% CO2 가스로 용액을 얼음에 5분 동안 거품을 냅니다.
  2. 배양 배지를 준비합니다. 접시당 최소 2.5mL가 필요합니다. 소 태아 혈청 2mL, L-글루타민 25μL(200mM), B27 200μL(50x), 페니실린 50μL + 스트렙토마이신(10K 단위/mL 및 10mg/mL)을 신경기저 배지 8mL에 추가합니다.
  3. 3% 낮은 용융 온도의 아가로스 겔을 준비합니다. 50mL의 HBSS(+)를 기공한 다음 1.5mg의 낮은 용융 온도 아가로스를 첨가하고 고압멸균합니다. 아가로스를 전자레인지에 녹이고 사용하기 전에 수조 인큐베이터에서 50°C로 보관합니다.
  4. 1.9mL의 배양 배지를 유리 베이스 접시에 추가합니다. 필터 아래에 공기 전구가 갇히지 않도록 세포 배양 삽입물을 조심스럽게 삽입한 다음 500μL의 배양 배지를 필터에 추가합니다(그림 1B). 얼음 위에 놓습니다.
  5. 5% 이소플루란을 흡입하여 조작된 마우스를 마취한 후, 관찰할 적절한 단계에서 자궁경부 탈구(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름)로 희생시킵니다.
    참고: E14.5에서 전기천공법 후 2일(48시간) 및 3일은 각각 다극-양극 전이 및 이동 모드를 관찰하는 데 적합합니다.
  6. 배아를 꺼내 차가운 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다.
  7. 현미경으로 GFP 또는 다른 형광 단백질의 발현으로 배아를 선택합니다.
  8. 배아의 참수 후 해부현미경으로 뇌 6를 절개하고 차가운 HBSS(+)에 보관한다.
  9. 녹은 3% 낮은 용융 온도의 아가로스 겔을 냉동 몰드에 붓고( 재료 표 참조) 뇌를 넣고 여러 번 굴립니다. 아가로스가 완전히 굳을 때까지 실온에 두었다가 얼음 위에 놓는다.
  10. 진동 마이크로톰을 사용하여 350μm 두께로 뇌를 관상으로 절단합니다( 재료 표 참조).
  11. 필터에 슬라이스를 정렬합니다(필터당 최대 6개 슬라이스).
  12. 필터 컵의 내부와 외부에서 배양 배지를 빼냅니다(총 600μL). 이 단계에서는 슬라이스를 눌러 필터에 고정합니다. 5분 후 세포 배양 삽입물 내부에 100μL의 배양 배지를 추가합니다.

3. 타임랩스 이미징

  1. 배양 챔버를 스테이지에 장착한 상태로 유지tag전자 챔버의 히터 또는 현미경을 둘러싸고 있는 후드를 사용하여 챔버의 히터를 사용하여 Z 드리프트를 방지하기 최소 30분 전에 현미경을 둘러싸고 있습니다. 배양실에 가습된 5%CO2 + 40%O2 가스를 공급합니다.
  2. 배양실에서 위에 준비한 조각으로 배양 접시를 설정합니다.
  3. 긴 작동 거리의 20x 렌즈(NA = 0.45)를 사용하여 24시간 동안 15-30분마다 5μm 단위로 약 10개의 Z 스택 이미지를 획득합니다.
    알림: 전동식 XY s의 사용을 적극 권장합니다.tage. 이를 통해 여러 대물렌즈 필드에서 이미지를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 하나의 타임랩스 실험에서 서로 다른 객관식 필드에서 10-20개의 이미지를 얻습니다.

4. 이미징 분석

  1. ImageJ 또는 기타 소프트웨어를 사용하여 Z축의 최대 투영으로 XYZT 이미지를 XYT로 변환합니다.
    참고: 관찰 중에 슬라이스가 미끄러지면 강체 변환 기능이 있는 ImageJ 플러그인인 StackRed를 사용하여 이미지 내 셀의 위치를 조정하십시오( 재료 표 참조).
  2. GFP 또는 기타 형광 단백질 양성 세포의 궤적을 수동 또는 자동으로 추적합니다. 수동 및 자동 추적은 각각 MTrackJ24 및 TrackMate 25,26(ImageJ 플러그인)을 사용하여 수행할 수 있습니다. TrackMate를 사용한 자동 추적은 편향되지 않은 방식으로 많은 세포를 분석하는 데 효율적입니다. 그러나 MTrackJ를 사용한 수동 추적은 개별 세포의 정확한 추적에 여전히 유용합니다.

결과

pallial VZ의 방사형 신경교세포는 E14까지는 뉴런만 생성하고, E15 및 E16에서는 뉴런과 신경교세포를 모두 생산합니다. 뉴런과 신경교세포의 이동 거동을 동시에 관찰하기 위해 뉴런 특이적 프로모터인 Tα1 promoter27과 성상교세포에서 우선적으로 활성화되는 human glial fibrillary acidic protein(hGFAP) 프로모터28을 사용하여 각각 EGFP(enhanced GFP) 및 RFP로 라벨링했습니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 이동 중에 세포 분열을 반복하여 세포의 플라스미드를 희석시킵니다. 이를 피하기 위해, donor plasmid (pPB) 및 transposase expression vector (pCAG-hyPBase)로 구성되는 transposon 벡터 시스템을 사용하였다29,30. 여기에 사용된 donor plasmid (pPB-CAG-LNL-RFP)는 loxP-neo-loxP(LNL) 카세트를 가지고 있으며, Cre recombinase에 따라 RFP를 발현합니다. ICR 마우스(야생형; WT)를 E15에서 그림 2A에 표시된 플라스미드로 전기천공하고, 3일 후에 절편을 제조하였다. 이 기간 동안 EGFP+ 뉴런의 첫 번째 코호트는 피질판의 표면에 도달했지만(그림 2B), 많은 EGFP+ 뉴런은 여전히 이동 중이었습니다. 타임랩스 관찰은 24시간 동안 수행되었습니다. 이 관찰 동안, 두꺼운 선행 돌기를 가진 뉴런은 피질판에서 비교적 일정한 속도로 뇌 표면을 향해 선형으로 이동했습니다(19.54 ± 6.21 μm/h, 평균 ± 표준 편차, 70개 세포). 마이그레이션 궤적은 TrackMate 소프트웨어(그림 2B의 자홍색 선)를 사용하여 자동으로 추적되었습니다. 동일한 객관적 분야에서, 성상세포(astrocyte) 전구세포는 RFP로 시각화되었습니다(그림 2C). hGFAP 프로모터는 배아 후기 단계의 요골 신경교세포에서도 활성화되기 때문에 이러한 요사상 신경교세포에서 파생된 일부 뉴런도 RFP를 발현합니다(그림 2B,C의 파란색 화살표). 이러한 뉴런은 거의 항상 EGFP 발현 벡터로 transfection됩니다. 따라서, 성상세포(astrocyte) 전구세포는 RFP 단일양성세포(single-positive cell)로 확인되었다.

뉴런과 대조적으로, 성상세포(astrocyte) 전구세포는 중간 영역(intermediate zone)과 피질판(cortical plate) 내에서 빈번한 방향 변화(불규칙한 이동)로 빠르고 무작위로 이동합니다(불규칙한 이동)5. 성상세포 전구세포의 이동은 MTrackJ 소프트웨어(그림 2C의 자홍색 선)에 의해 수동으로 추적되었으며, 이를 통해 높은 운동성(88.37 ± 33.61 μm/h, 5개 세포)이 밝혀졌습니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포와 혈관 사이의 관계를 관찰하기 위해 내피세포에서 RFP인 DsRed를 발현하는 Flt1-DsRed 마우스를 사용하였다. 이 실험에서 성상세포(astrocyte) 전구세포는 EGFP에 의해서만 확인될 수 있었다. 이를 위해, hGFAP-Cre에 의존하는 EGFP 발현이 Dcx 프로모터(초기 뉴런 특이적 프로모터)31-의존적 DNA 재조합효소 세트의 또 다른 세트 및 그 인식 서열(Dre-rox)의 활성화를 사용하여 뉴런에서 제거될 수 있는 rDIO 시스템(5)이 개발되었다(그림 2D, pPB-CAG-rDIO-EGFP의 서열은 보충 파일 1에 제공됨)32, 33. rDIO 시스템은 자궁 내 전기천공법을 통해 E15에서 Flt1-DsRed 마우스에 도입되었으며 24시간 후에 절편이 준비되었습니다. 그 결과, EGFP 양성 성상세포 전구세포가 혈관을 따라 활발하게 이동하는 것이 관찰되었습니다(혈관 유도 이동)5(그림 2E).

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그림 1: 자궁 내 전기천공법으로 표지된 세포의 타임랩스 관찰 흐름. (A) 적절한 단계에서 임신한 쥐를 마취하고 복강을 절개합니다. 수술 부위는 멸균 플라스틱과 멸균 종이 시트로 덮여 있습니다. 자궁 뿔이 노출되고 배아에 1μL의 플라스미드 혼합물이 주입되고 전자 펄스가 적용됩니다. 복벽과 피부를 봉합하고, 조작된 쥐를 집 케이지에 다시 넣는다. (B) 전기 천공된 브레인에서 준비된 슬라이스는 유리 베이스 접시에 세포 배양 삽입물(최대 6개 슬라이스)의 필터에 고정됩니다. 슬라이스가 들어있는 유리베이스 접시는 배양 챔버에 장착됩니다. 이 타임랩스 시스템에는 온도를 37°C로 유지하기 위해 전체 현미경을 덮는 아크릴 후드가 있습니다. 가습 혼합 가스가 공급되는 배양 챔버에는 후드 내부에 현미경 스테이지가 장착되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 뉴런 및 성상세포 전구세포의 타임랩스 관찰. (A) 뉴런(EGFP, 녹색) 및 성상세포(RFP, 빨간색)의 차등 라벨링 방법 및 타임랩스 이미징 시작 후 2시간에 전기천공법 2일 후에 준비된 절편의 대표 이미지(오른쪽). (나,씨) 관찰 2시간에서 21시간 사이에 (A)-오른쪽에 표시된 동일한 대물렌즈 필드에 있는 EGFP+(B) 및 RFP+ 세포(C)의 타임랩스 이미지. (B) TrackMate 소프트웨어에 의해 자동으로 감지된 EGFP+ 이동 세포의 궤적은 자홍색으로 표시되었습니다. (C) RFP+ 셀의 궤적은 MTrackJ 소프트웨어를 사용하여 수동으로 추적했습니다. 뉴런으로 생각되는 EGFP/RFP 이중 양성 세포는 파란색 화살표로 표시됩니다. (D) Flt1-DsRed 마우스 배아에서 rDIO 시스템을 사용한 성상세포 전구세포의 라벨링 전략. (E) 혈관 유도 이동의 대표 결과. 세포(화살표)는 선행 돌기(화살촉)를 돌출하고 DsRed 발현 혈관(자홍색)을 따라 pial 표면을 향해 이동했습니다. CP입니다. 피질 플레이트. 이즈; 중간 영역. VZ; 심실 영역. 스케일 바: 200 μm (A–C), 50 μm (E). 이 그림은 Tabata H. et al.5에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

뉴런(레이어 II/III)성상세포(Astrocyte) 전구세포rDIO 시스템
(성상세포(astrocyte) 특이적 라벨링)
피카이소서-EGFP0.5 μg/μLpPB-CAG-LNL-EGFP0.5 μg/μLpPB-CAG-rDIO-EGFP0.5 μg/μL
또는 Ta1-EGFP(뉴런에 대해 더 특이적)0.5 μg/μLhGFAP-CR0.75 마이크로그램/μLhGFAP-CR0.75 마이크로그램/μL
pCAG-hyPBase (영문)0.5 μg/μLpDcx-드레0.5 μg/μL
pCAG-hyPBase (영문)0.5 μg/μL

표 1: 각 타겟에 대한 plasmid mix의 대표 성분. EGFP 벡터는 동등한 RFP 또는 다른 형광 단백질 발현 벡터로 대체할 수 있습니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포를 표지하기 위해, transposon 벡터 시스템이 사용됩니다. pPB 벡터는 게놈 통합을 위한 PiggyBac transposon 벡터입니다. pCAG-hyPBase는 PiggyBac transposase 발현 벡터입니다. LNL은 Cre 의존성 발현을 위한 loxP-neo-loxP 카세트입니다. rDIO-EGFP는 EGFP 발현의 Cre-loxP 및 Dre-roxP 의존성 on/off 카세트입니다. 원하는 유전자의 gain-of-function 또는 loss-of-function 표현형을 관찰하기 위해 발현 벡터 또는 knockdown 벡터를 1μg/μL로 추가할 수 있습니다. 이러한 벡터의 농도는 각 경우에 조정되어야 합니다.

보충 파일 1: 플라스미드 염기서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 pallial(cortical) VZ에서 유래한 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 도입했습니다. VZ에서 이동하는 세포를 라벨링하기 위해 우리는 자궁 전기천공법(utero electroporation)을 사용했는데, 이 경우 바이러스 벡터 매개 라벨링보다 더 높은 신호 대 잡음비로 개별 세포를 명확하게 라벨링했습니다. 자궁 전기천공법(utero electroporation)에 사용하여, 어떤 조합으로든 모든 유형의 벡터를 살아있는 배아의 요골 신경교세포(신경줄기세포)에 쉽게 도입할 수 있습니다. 뉴런(neuron)과 신경교세포(glial progenitor)는 서로 다른 promoter를 사용하여 선택적으로 표지할 수 있습니다. in utero electroporation에 의해 도입된 plasmid의 복제 수가 많기 때문에 GFP 발현 벡터와 발현 벡터 및 knockdown/knockout 벡터와 같은 관심 유전자와 관련된 다양한 벡터의 동시 전기천공을 통해 gain-of-function 및 loss-of-function 연구를 쉽게 수행할 수 있습니다. 더욱이, 자궁 내에서 전기천공법은 대뇌피질 VZ 이외의 다양한 뇌 영역의 VZ에 플라스미드 벡터를 도입하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 억제성 뉴런, 신경절 돌출부 34,35,36 및 해마 피라미드 뉴런(37)의 희소돌기아교세포 전구세포와 같은 다른 세포 유형의 이동을 관찰할 수 있습니다.

타임랩스 연구에서 TrackMate 및 MTrackJ 소프트웨어를 사용하여 세포 거동에 대한 기능 이득 및 기능 손실 실험의 효과를 평가할 수 있습니다. 신경 발달 장애와 지적 장애를 일으키는 유전자를 포함한 많은 유전자가 신경 세포 이동에 관여합니다. 타임랩스 연구는 이러한 유전자가 어떻게 세포 행동을 조절하는지 직접적으로 밝힐 수 있습니다. 신경 세포 이동과 비교했을 때, 신경교세포 이동의 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이 방법은 신경교세포의 정상적인 발달뿐만 아니라 신경교세포의 발달에 영향을 미칠 수 있는 유전적, 환경적 요인 및 정신 질환과의 관계를 밝힐 수 있습니다.

이 방법의 한계는 불가피하게 in vitro slice culture 방법에 의존한다는 것입니다. 흥미롭게도, 이동하는 뉴런은 뇌 표면으로 이동하기 위한 방향 신호를 잃지 않으며, 심지어 체외에서 배양된 단편에서도 마찬가지입니다. 그러나 조사자는 유물에 주의해야 합니다. 표면 근처의 셀은 필터에 부착되고 슬라이스의 가장자리는 쉽게 변형됩니다. 이러한 셀은 분석에서 제외해야 합니다. 가능하면 대조 실험을 고려해야 합니다. 뇌 절편은 약 24시간 이내에 정상적인 발달을 반복한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 전기천공법에서 슬라이스 준비 타이밍을 결정하여 분석할 이벤트가 이 시간 창에서 발생하도록 해야 합니다. 다극-양극 전이를 관찰하려면 전기천공법 2일 후에 슬라이스를 준비해야 합니다. 이동 모드에서 이동을 분석하려면 3일 후가 적합합니다. 혈관 유도 이동을 관찰하는 것은 다른 실험보다 어려운 작업입니다. 내피 세포는 혈류 없이 조각으로 쉽게 분해됩니다. 혈관 저하를 최소화하기 위해 절편을 가능한 한 빨리 준비하고 20% 혈청과 40%O2 가스를 함유한 배지에서 유지해야 합니다. 고정 뇌의 조직학적 분석 또는 이광자 현미경을 사용한 생체 내 실시간 이미징과 같은 다른 보완 실험은 슬라이스 타임랩스 분석에서 발견되는 관찰을 강화할 수 있습니다.

요약하면, 이 방법은 24시간 동안 세포 거동을 관찰할 수 있는 유일한 옵션입니다. 새로운 플라스미드 벡터의 개발로 이 방법의 응용 범위는 앞으로 더욱 확장될 것입니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Tα1 프로모터는 P. Barker와 F.D. Miller의 선물입니다. Dcx 프로모터는 Q. Lu의 선물입니다. hGFAP-Cre는 Albee Messing의 선물입니다. PiggyBac transposon 벡터 시스템은 Sanger Institute에서 제공했습니다. Flt1-DsRed 마우스는 M. Ema (Shiga University)에 의해 제공되었다. 이 연구는 JSPS KAKENHI(JP20H05688 타바타에게 보조금 번호 JP21K07309, K. 나카지마에게 JP22K19365)와 다케다 과학 재단, 교육 연구 진흥을 위한 게이오 기주쿠 후쿠자와 기념 기금, K. 나카지마에 게이오 기주쿠 학술 개발 기금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡인기 튜브 어셈블리Drummond2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 supplementGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Cell culture insertMilliporePICM ORG 50
컨포칼 현미경니콘A1RHD25긴 작동 거리 렌즈 장착 (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
배양실TokkenTK-NBCMP맞춤형
ElectroporatorNEPA 유전자NEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
가스 혼합TokkenTK-MIGM01-02
유리 베이스 접시Iwaki3910-035유리 베이스의 직경은 27mm
유리 모세관NarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
히터 유닛TokkenTK-0003HU20후드 및 히터를 포함한 맞춤 제작
hGFAP-CreAddgene#40591Albee Messing ImageJ
https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
저융온 아가로스Lonza50100
Medetomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
마이크로인젝터NarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal mediumGibco21103-049
pCAG-hyPBasepCMV-hyPBase(Sanger Institute의 기증품)로부터의 hyPBase cDNA를 pCAGGS의 CAG 프로모터(J. Miyazaki의 기증품)의 다운스트림에 삽입하였다.
pDcx-DreDcx4kbEGFP70(Q. Lu의 선물)의 Dcx 프로모터를 pCAG-NLS-HA-Dre34(Pawel Pelczar, Addgene #51272의 선물)의 CAG 프로모터와 교환했습니다.
페니실린 + 스트렙토마이신Gibco15140122
플라스미드 정제 키트
Connie Cepko, Addgene #13769의 선물) 및 TurboRFP cDNA(Evrogen, FP232)를 pPB-CAG.EBNXN(Sanger Institute의 선물)의 클로닝 부위에 삽입했습니다.
pPB-CAG-rDIO-EGFPpEGFP-N1 (Clontech, U55762)의 합성 rox 부위, 합성 DIO 카세트 및 EGFP cDNA를 역방향으로 포함하는 서열은 pPB-CAG.EBNXN (Sanger Institute의 선물)의 복제 부위에 삽입되었습니다. 시퀀스는 추가 파일에 제공됩니다.
끌어당기는 사람NarishigePN-31
StackRed플러그인 ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
봉합 바늘NazmeC-24-521-R No.11/2 서클 봉합사 14mm
봉합사Nazme C-23-B2실크 크기 5-0
시간 임산부 ICR (와일드 타입) 마우스일본 SLCICR 마우스
TrackMate
https://imagej.net/plugins/trackmate/index 핀셋 전극BEX 또는 NEPA 유전자CUY650P5 
티&알파; EGFP cDNA를 T&alpha의 다운스트림에 삽입하였다; 플라스미드 253의 프로모터 1개(P. Barker 및 F.D.Miller의 선물)
진동 마이크로톰Leica 또는 Zeiss진동 블레이드 마이크로톰 VT1000S 또는 Hyrax V50.
기 , pCALNL-DsRed의 pPB-CAG-LNL-RFP CAG-LNL 카세트(K210005, pEGFP-N1 (Clontech, U55762)로부터의 1-EGFP

참고문헌

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

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