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방법 논문

생쥐에서 다낭성 난소 증후군을 유도하기 위한 수정된 기술

2.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66637

⸱

2024년 7월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Obstetrics and Gynecology Hospital, Institute of Reproduction and Development, Fudan University, 2Women's Hospital, Key Laboratory of Reproductive Genetics (Ministry of Education), Zhejiang University School of Medicine, 3International Institutes of Medicine, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 4Research Units of Embryo Original Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences (No. 2019RU056), 5State Key Laboratory of Cardiology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 미니 펌프를 사용하여 제어된 레트로졸 방출을 통해 마우스에서 다낭성 난소 증후군(PCOS) 모델을 유도하는 기술을 소개합니다. 적절한 마취 하에 미니 펌프를 피하 주사하고, 미니 펌프 방출 일정 기간 후에 마우스에서 PCOS를 성공적으로 유도하였다.

초록

다낭성 난소 증후군(PCOS)은 여성 불임의 주요 원인 중 하나입니다. 동물 모델은 다낭성 난소 증후군의 병인학적 기전을 연구하고 관련 약물 개발에 널리 사용됩니다. Letrozole 유도 마우스 모델은 PCOS 환자의 대사 및 생식 표현형을 복제합니다. 다낭성 난소 증후군(PCOS) 생쥐에서 레트로졸 처리의 전통적인 방법은 노동 집약적이고 생쥐에게 상당한 스트레스를 줄 수 있는 특정 기간 동안 매일 투여해야 합니다. 이 연구는 제어된 letrozole-releasing mini-pump를 이식하여 마우스에서 PCOS를 유도하는 간단하고 효과적인 방법을 설명합니다. letrozole의 양이 많은 양의 안정되어 있는, 지속적인 방출 가능한 소형 펌프는 마취의 밑에 쥐에서 피하로 제작되고 이식되었습니다. 이 연구는 마우스 모델이 letrozole 미니 펌프 이식 후 PCOS 기능을 성공적으로 모방했음을 보여주었습니다. 이 연구에 사용된 재료와 장비는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 있으므로 특별한 사용자 정의가 필요하지 않습니다. 종합적으로, 이 논문은 마우스에서 PCOS를 유도하기 위한 독특하고 수행하기 쉬운 방법을 제공합니다.

서론

다낭성 난소 증후군(PCOS)은 가임기 여성에게 가장 흔한 질환 중 하나입니다1. 전 세계 여성의 최대 18%에게 영향을 미치며 전 세계 여성 불임의 주요 원인입니다 2,3. 다낭성 난소 증후군(PCOS)은 성선 자극 호르몬 분비 장애, 만성 무배란, 안드로겐 생산 증가, 다낭성 난소 형태 등 일련의 상호 연관된 생식 이상을 특징으로 한다4. 다낭성 난소 증후군(PCOS)은 부인과 질환 외에도 심혈관 질환의 위험을 증가시킵니다 5,6. 수십 년간의 연구에도 불구하고 다낭성 난소 증후군의 병인은 불분명한 상태로 남아있다 7,8.

다낭성 난소 증후군(PCOS)의 발병 기전에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 새로운 치료법을 개발하기 위해서는 인간 생리학을 밀접하게 모방한 동물 모델을 만드는 것이 매우 중요하다9. 현재 보고된 다낭성 난소 증후군의 설치류 모델에는 테스토스테론, 레트로졸, 에스트라디올 발레레이트 등의 치료에 의해 유발된 모델이 포함됩니다. 테스토스테론은 고안드로겐혈증을 유발하고 쥐에서 PCOS 유도제로 더 일반적으로 사용됩니다10. DHEA는 설치류에서 PCOS를 유도하는 데 사용되어 테스토스테론 수치, LH/FSH(황체 형성 호르몬/여포 자극 호르몬) 비율을 증가시키고, 불규칙한 발정 주기11을 일으키는 원인이 되었습니다. 에스트라디올 발레레이트(EV)는 오래 지속되는 에스트로겐이며, 이 방법을 사용한 연구는 투여된 EV의 투여량에 따라 성 스테로이드 호르몬과 성선 자극 호르몬의 수치가 다르다는 것을 보여줍니다 12,13,14. Letrozole는 비스테로이드 아로마타제 억제제입니다15. Letrozole 처리는 비 주기적인 발정을 유도하고, 난소 무게, 체중을 증가하고, adipocytes를 확대하고, 여포 발달을 확대하고, 쥐16,17에 있는 테스토스테론 수준을 올립니다. Letrozole 처리된 마우스는 LH, FSH, 에스트라디올 및 프로게스테론18,19의 농도 증가뿐만 아니라 부비동 여포 및 출혈성 낭종의 수가 증가합니다.

현재, letrozole 유도 PCOS 모델링의 주요 방법은 경구 투여 및 피하 주사를 포함하며, 둘 다 반복적인 일일 투여를 필요로합니다 20,21,22. 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며, 반복적인 투여는 동물에게 상당한 스트레스를 유발할 수 있다23. 일부 연구에서는 letrozole 펠릿24,25을 사용하지만, 이러한 제품은 사용자 정의가 필요하고 비쌉니다. 이 보고서는 미니 펌프를 사용하여 마우스에서 PCOS를 유도하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 간단하고 시간을 절약할 수 있으며 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 수술 도구와 장비를 사용합니다.

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프로토콜

이 연구의 모든 동물 실험 프로토콜은 Fudan University의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 4주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 여기에 사용하였다. 이 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미니 펌프의 준비

  1. 원래 포장 병에 저장된 letrozole 분말 (50 mg)을 가져 가고, 병에 레트로 졸 분말을 원심 분리 300 x g 5 s (실온에서) 다음 뚜껑을 엽니 다.
  2. 피펫으로 레트로졸 분말에 DMSO 625μL를 천천히 추가하고 잘 혼합하여 8mg/100μL, 총 625μL의 농도로 원액을 얻습니다.
    참고: letrozole 분말의 다른 패키지 크기를 사용하는 경우, 원액을 구성하기 위해 사전에 DMSO의 필요한 부피를 계산하십시오. letrozole 분말, DMSO 및 기타 관련 화합물은 멸균 등급이어야합니다. 피펫 팁, 튜브 및 기타 관련 품목은 사용하기 전에 멸균 또는 멸균해야 합니다.
  3. 실험 설계에 따라 필요한 마우스의 수를 셉니다.
  4. 필요한 마우스의 수에 따라 피펫에 필요한 letrozole 원액의 총량을 끌어 올리고 원심 분리기 튜브에 천천히 주입합니다.
    참고: PCOS 마우스 모델을 유도하기 위해 8주 노출을 위해 4주 된 마우스를 선택했습니다. letrozole의 총 복용량은 이식되는 2개의 연속적인 펌프 (1개의 펌프는 4 주 동안 풀어 놓습니다), i.e, 펌프 당 4 mg /4 주를 요구하는 각 쥐를 위한 8 mg입니다. 단계 1.2에서 언급하는 대로, letrozole 원액의 농도는 8개 mg/100 μL이다. 펌프를 준비하려면 아래 계산된 대로 각 펌프에 대해 50μL의 원액이 필요합니다: 총 4mg 레트로졸을 8mg/100μL로 나눈 값.
  5. PEG300의 동등한 양을 끌어올리고, letrozole 해결책에 추가하고, 잘 섞으십시오 (적절하게 소용돌이칠 수 있습니다).
  6. 대조군에 대한 제어 차량 용액을 준비합니다(레트로졸이 없는 각 펌프에 대해 DMSO 50μL + PEG300 50μL).
  7. 필요한 펌프의 수에 따라 적절한 수의 멸균 원심분리기 튜브를 준비합니다. 각 펌프에 대해 하나의 15mL 원심분리기 튜브를 준비해야 합니다.
  8. 주사기로 식염수를 뽑고 각 원심분리기 튜브에 5mL의 식염수를 추가합니다. 그런 다음 원심분리기 튜브의 뚜껑을 닫고 나중에 사용할 수 있도록 튜브 랙에 놓습니다.
  9. 새 멸균 장갑을 착용하고 원하는 양으로 미니 펌프를 꺼낸 다음 깨끗하고 멸균된 조리대 또는 용기에 놓습니다.
  10. 펌프 본체에 맞는 캡을 엄지와 검지로 부드럽게 잡고 다른 손으로 펌프 본체를 잡습니다.
  11. 캡에 부착된 얇은 튜브로 펌프의 충전 포트를 여러 번 천천히 찔렀습니다(그림 1B).
    알림: 막히지 않으면 충전 후 튜브에서 유체가 자유롭게 흐르지 않을 수 있습니다.
  12. 펌프와 일치하는 바늘과 1mL 멸균 주사기를 가져옵니다. 바늘을 주사기에 부착하고 단단히 조입니다(그림 1C).
  13. 주의깊게 그리고 천천히 새로 조립된 주사통 (숫자 1D)로 위에 형성된 letrozole의 최종 해결책을 위로 끌어올립니다.
    주: letrozole 해결책의 흡인은 천천히 그리고 균등하게 행해질 필요가 있습니다. 빠른 흡인은 기포를 생성할 수 있으며, 이는 후속 약물 용액 주입에 영향을 미칠 수 있습니다.
  14. letrozole 해결책을 소형 펌프로 주입하십시오.
    1. 한 손으로 미니 펌프를 조심스럽게 집어 똑바로 서게 하고 다른 손으로 앞서 언급한 1mL 주사기를 잡고 펌프의 맨 아래에 천천히 삽입합니다(그림 1E).
      알림: 바늘이 펌프 바닥에 삽입되지 않으면 펌프의 액체가 주입 중에 쉽게 거품이 생길 수 있으며, 이는 펌프의 후속 약물 방출에 영향을 미칩니다.
    2. 그런 다음 구성된 용액을 천천히 주입합니다. 주입은 펌프의 개구부가 약간 거품이 생길 때 알 수 있습니다.
    3. 주입량이 90μL에 가까워지면 더 천천히 주입합니다. 펌프가 완전히 채워지면(약 100μL) 주사기를 빼냅니다.
    4. 캡을 펌프 본체에 조심스럽게 삽입하고 단단히 조이십시오. 이 시점에서 소량의 용액이 쏟아집니다. 조심스럽게 닦아내십시오.
  15. 배출구가 위쪽을 향하게(캡이 있는 끝) 약물이 적재된 펌프를 가져와서 미리 준비된 원심분리기 튜브를 잡고 펌프를 멸균 식염수에 완전히 담그십시오(그림 1F). 그런 다음 원심분리기 튜브의 캡을 닫고 튜브 랙에 놓습니다.
    알림: 공정 전반에 걸쳐 펌프가 오염되지 않도록 주의하십시오.
  16. 모든 미니 펌프를 만든 후 모든 원심분리기 튜브를 37°C 온도 조절기에 48시간 동안 넣습니다.

2. 수술 준비 및 마취

  1. 겸자, 지혈제, 수술용 가위, 바늘 홀더 및 4-0 흡수성 수술용 봉합사를 포함하여 수술 당일에 필요한 모든 기구를 준비하고 소독합니다.
  2. 이소플루란 마취기(그림 2B)를 사용하기 전에 파이프라인 연결이 올바른지 주의 깊게 확인하고 파이프라인이 손상되지 않고 누출되지 않는지 확인하십시오.
  3. 마취 기계의 증발기에서 충전 밀봉 캡의 나사를 풀고 마취제를 천천히 추가합니다.
  4. 마취 기계에 표시된 상한과 하한 사이의 마취 수준을 유지하십시오.
  5. 마취 기계 증발기의 공기 흐름이 마취 유도 상자에 연결되도록 3방향 밸브 스위치를 변환합니다.
  6. 공기 펌프와 증발기를 연 다음 마취 유도를 위해 이소플루란의 농도를 조정합니다(일반적으로 3%-4%).
  7. 마취제가 인덕션 박스에 채워질 때까지 약 1분 동안 기다린 다음 마우스를 인덕션 박스에 넣고 완전히 마취될 때까지 기다립니다(이 과정은 약 2-3분 소요).
  8. 상자를 부드럽게 기울여 쥐가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 쥐를 뒤집었을 때 누운 자세로 돌아갈 기미가 보이지 않으면 마취가 유도됩니다.

3. letrozole 미니 펌프의 이식

  1. 수술용 마스크와 멸균 장갑을 착용하십시오.
  2. 인덕션 박스에서 사전 마취된 마우스를 제거하고 제모 크림을 마우스 뒤쪽에 바른 다음 1분 동안 기다립니다. 제모 크림과 머리카락을 젖은 거즈로 부드럽게 닦아냅니다.
  3. 동시에 3방향 밸브 스위치를 변경하여 마취기 증발기의 공기 흐름이 마취 마스크에 연결되도록 하고 유지 농도(일반적으로 2%)를 조정합니다.
  4. 제모 후 주로 사용하는 손으로 마우스를 잡고 머리/코를 마취 마스크에 넣습니다.
  5. 페달 철수 반사를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오.
    알림: 마취와 관련된 모든 절차는 활성탄 정제가 장착된 가스 필터를 사용하여 수행해야 하며 절차는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
  6. 마우스를 수술판의 엎드린 위치에 고정하고 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바릅니다.
  7. 포비돈 요오드 면봉을 노출된 피부에 세 번 바릅니다(그림 2C). 그런 다음 멜록시캠을 2mg/kg의 용량으로 피하 주사합니다.
  8. 다시 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 목 뒤쪽의 정중선에서 털이 없는 쪽의 피부에 유리하게 집게로 피부를 잡고 메스나 수술용 가위로 옆으로 약 0.5cm를 절개합니다(그림 2D).
  9. 그런 다음 절개 부위 아래의 표피를 열고 지혈제 또는 바늘 홀더로 접근하여 피부를 풀어주고 미니 펌프(절개 부위에서 약 2cm 거리)를 위한 공간을 만듭니다(그림 2E).
  10. 멸균 겸자가 있는 원심분리기 튜브의 식염수에서 펌프를 빼내고 펌프의 열린 끝이 아래를 향하도록 하고 펌프를 마우스에 피하로 삽입할 준비를 합니다(그림 2F).
  11. 피부 절개 부위의 한쪽을 집게로 고정하고 펌프를 피하 공간으로 밀어 넣습니다. 펌프에 들어갈 때 저항이 없어야 합니다. 안으로 들어가면 손가락을 사용하여 펌프를 가능한 한 안쪽으로 약간 부드럽게 짜냅니다(그림 1G).
  12. 4-0 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 조심스럽게 봉합합니다(그림 2H).
    알림: 봉합 시 피하 펌프 본체가 손상되지 않도록 주의하십시오.
  13. 봉합 후 요오드포 면봉으로 수술 부위의 피부를 2회 소독합니다.

4. 동물 회수

  1. 수술 후에는 마취 시 사용한 매트리스에서 마우스를 건조하고 깨끗한 매트리스로 부드럽게 옮깁니다. 쥐가 따뜻하고 조용한 환경에 있는지 확인하십시오.
  2. 호흡의 깊이와 빈도와 같은 쥐의 상태를 면밀히 모니터링하십시오.
  3. 생쥐의 움직임이 돌아오기 시작할 때 생쥐의 행동을 관찰하십시오. 마지막으로, 어지러움이나 조정되지 않은 움직임과 같은 명백한 비정상적인 행동 없이 서고 걸을 수 있는지 확인하십시오.
  4. 생쥐가 회복된 후 미리 준비된 케이지로 부드럽게 옮깁니다. 생쥐가 먹을 수 있도록 멸균 젤리와 음식을 케이지 바닥에 놓습니다.
    참고: 수술 부위가 늘어나면 수술 후 초기 기간 동안 쥐가 쉽게 마시고 먹는 것을 방해할 수 있으므로 케이지 바닥에 젤리와 음식을 놓으십시오.
  5. 멜록시캠을 2mg/kg의 용량으로 피하 주사합니다(수술 후 처음 3일 동안은 24시간마다). letrozole 처리의 8 주 후에 (i.e, 2개의 연속적인 소형 펌프 이식), 쥐 모형을 시험하십시오.

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결과

실험 프로토콜과 몇 가지 중요한 단계는 그림 1과 그림 2에 나와 있습니다. 혈청 테스토스테론 수치는 그림 3A에 표시되어 있습니다. Letrozole 미니 펌프 처리 마우스(이하 LTZ 마우스라고 함)는 암컷 대조 마우스에 비해 혈청 테스토스테론 수치가 크게 상승했습니다. 한편, 난소의 조직학적 분석은 LTZ 마우스가 다낭성 난소에서 탈상 수(corpora lutea number)가 현저히 감소한 것으로 나타났으며(그림 3B,C), 이는 무배란을 나타냅니다. 더욱이, LTZ 마우스는 암컷 대조군 마우스에 비해 유의한 발정 비대칭성을 보였다(그림 3D). 체중 평가 결과, LTZ 마우스가 대조군 마우스보다 더 무거웠습니다(

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토론

이 보고서는 쉽게 접근할 수 있는 물질을 사용하여 마우스에서 PCOS를 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 PCOS 모델은 PCOS 메커니즘을 탐색하고 약물을 스크리닝하는 데 필수적이다26. 생쥐에서 PCOS 모델을 유도하는 데 사용할 수 있는 방법 중 letrozole 유도는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. letrozole의 사용은 estradiol에 테스토스테론의 변환을 금하거나 테스토스테론 종합을 증가해서 hyperandrogenic 상태를 개발하고 유지할 수 있습니다27. letrozole 유도 마우스 모델은 PCOS28 환자와 대사 및 생식 유사성을 보여줍니다. 그러나, 마우스 PCOS 모델에서 레트로졸 처리의 종래의 기술은 21일 이상 마우스에 레트로졸 약물을 매일 경구 공급하거나 주입해야 한다

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 2021YFC2700701), 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 82088102, 82071731, 82171613, 8227034, 81601238), 중국 의학 아카데미 의료 과학 혁신 기금(보조금 2019-I2M-5-064), 상하이시 과학기술위원회(보조금 21Y11907600), 상하이시 건강 및 가족 계획 위원회(보조금 20215Y0216)의 지원을 받았습니다. 상하이시 위생건강위원회 협력 혁신 프로그램(보조금 2020CXJQ01), 상하이 병원 개발 센터 임상 연구 계획(보조금 SHDC2020CR1008A), 상하이 부인과 질환 임상 연구 센터(보조금 22MC1940200), 상하이 비뇨생식기 계통 질환 연구 센터(보조금 2022ZZ01012), 상하이 국경 과학 생식 개발 연구 기지, 취저우시 과학기술위원회(보조금 2022K54), 저장대학교 교육부 생식유전학 핵심 연구소의 오픈 펀드 프로젝트(보조금 KY2022035) 및 광동 의학 아카데미의 오픈 펀드 프로젝트(보조금 YKY-KF202202).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
주사기Bofeng BiotechBD3008411ML (sterile)
Centrifugation tubeBiological Hope1850-K15ML (sterile)
PipetteEppendorf3123000268-A100μ L-1000μ L (sterile)
피펫TopPette701010100810μ L-100&뮤; L (sterile)
Letrozole powderSigmaL6545-50MGprimary acting drugs (sterile)
PEG(Poly(ethylene glycol))SolarbioP8250dissolution (sterile)
sterile physiological Saline solutionBiosharpBL158AMini-pump storage
삼투압 펌프ALZET1004Letrozole 저장 및 서방(sterile)
Dimethyl sulfoxideBiosharpBS087용해 (sterile)에 사용되는
작은 동물 마취 기계RWD 마취에 사용되는R500IP
이소플루란 RWD20071302마취에 사용됩니다.
헤모스탯BiosharpBS-HF-S-125수술 기구
가위BiosharpBS-SOR-S-100P수술 기구
바늘 홀더ShangHaiJZJ32010수술 기구
펜치RWD F12028수술 기구
바늘 및 4-0 흡수성 봉합JINGHUANCR413수술 기구
포비돈-요오드 면봉SingleLadyGB26368-2010피부 소독
탈모 크림ZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701 실험동물용 제모제
니트릴 장갑BiosharpBC040-L무균 작동에 사용
멸균 거즈ZHENDEBA69087액체
C57BL/6J 마우스상하이 모델 유기체 센터N/A나이 : 4 주
애완 동물 눈 윤활제미끼 SHF021153마우스 눈 윤활제
Meloxicam 주사MEIDAJIAR21064-21에 사용마우스 진통제에 사용 (무균)
사

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