서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 염료는 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인해 발생하는 염료 유출의 정도를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 염료를 사용한 라벨링은 혈액 내 염료의 농도, 뇌 혈관의 투과성, 염료 유출 기간, 분해 및 확산으로 인한 조직의 염료 농도 감소와 같은 여러 요인의 영향을 받는 복잡한 과정입니다. 경미한 외상성 뇌 손상 모델에서 폭발 유도 충격파(BSW)에 노출되면 제한된 시간 내에 BBB 파괴가 유발됩니다. BBB 분해의 정확한 순서를 결정하기 위해 Evans blue 및 fluorescein isothiocyanate-dextran을 BSW 노출과 관련된 다양한 시점에서 마우스에 혈관 내 및 심내 주사했습니다. 그런 다음 뇌 절편에서 염료 형광의 분포를 기록했습니다. 두 염료 사이의 분포와 강도의 차이는 BBB 파괴의 시공간 순서를 밝혔습니다. 뇌 절편의 면역 염색은 성상세포 및 미세아교세포 반응이 BBB 파괴 부위와 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 다양한 BBB 분해 모델과 관련된 연구에 적용할 수 있는 광범위한 잠재력을 가지고 있습니다.
서론
혈액뇌장벽(BBB) 파괴 및 기능 장애는 전신 염증, 감염, 자가면역 질환, 부상 및 신경 퇴행성 질환으로 인해 발생합니다1. 폭발 유도 충격파(BSW)에 대한 노출로 인한 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)에서 BSW의 강도와 BBB 파괴로 인한 형광 염료 누출 양 사이에 상당한 상관관계가 관찰되었습니다 2,3,4. mTBI에서 BBB 분해의 한 가지 주목할 만한 특징은 BSW에 노출된 직후 또는 몇 시간 이내에 시작되며, 일반적으로 지연된 만성 신경 질환이 나타나기 전에 약 일주일 동안 지속되는 일시적인 과정이라는 것입니다 3,5,6,7. 세부 사항은 불분명하지만, BBB 파괴는 오래 지속되는 병리학적 연쇄 반응의 일부이며 mTBI
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프로토콜
모든 실험은 국방의과대학(일본 도코로자와)에서 제정한 동물실험 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구 프로토콜은 국방의과대학 동물연구위원회(Committee for Animal Research)의 승인을 받았다(승인번호 23011-1). 이 연구에는 8주령, 체중 19-23g의 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 단일 Evans 블루 주입 및 FITC-덱스트란 관류는 단일 BSW 노출과 관련하여 다양한 시점에서 수행되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 마취
참고: 이것은 원래12에 비해 메데토미딘의 양을 2.5배 증가시키는 수정된 프로토콜입니다. 메데토미딘 염산염, 미다졸람, 부토르파놀의 투여량은 각각 0.75mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg이었다.
- 메데토미딘 염산염(75μg/mL), 미다졸람(400μg/mL) 및 부토르파놀(500μg/mL)의 혼합물을 생리....
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결과
그림 1A 는 BSW의 시작과 관련된 염료 주입의 시간 경과를 보여주며, 최대 과압은 25kPa입니다. 'Post' 프로토콜에서 Evans blue solution은 FITC-dextran 관류 2시간 전에 혈관 내 투여되었으며, 이는 BSW 노출 후 6시간, 1일, 3일 및 7일 후에 수행되었습니다. 'Pre' 프로토콜에서 Evans 블루 용액은 BSW 노출 직전에 주입되었습니다. 'Post' 프로토콜에서 Evans blue의 농도는 관류 고정 약 2시간 전에 최대에 도달할 것으로 예상되는 반면, 'Pre' 프로토콜에서는 BSW 노출 시점 즈음에 최대에 도달할 것으로 예상됩니다(그림 1B). 뇌혈관 내 FITC-dextran의 농도는 관류 중 2분 동안 일정하게 유지되었습니다.
Evans 파란색 라벨링은 BBB 분해가 6시간 이내에 시작되어 BSW 노출 후 7일까지 계속되.......
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토론
Evans blue와 FITC-dextran을 사용하는 새로운 이중 라벨링 기술을 사용하여 단일 뇌에서 BBB 파괴의 정확한 시공간 분포를 정확하게 시각화했습니다. 저강도 BSW 모델에서는 검사된 뇌에서 염료 유출의 범위, 위치 및 정도에서 눈에 띄는 변화가 관찰되었습니다(그림 2 및 그림 3). 염료 간 불일치는 BSW 노출 후 약 3시간 후에 BBB 분해가 시작되었으며, 1일차까지 상당한 리모델링이 발생하여 7일차까지 계속되는 것으로 나타났습니다(그림 4). 심한 경우, 활동성 미세아교세포(active microglia)가 BBB 분해 부위에 동원되었고, 반응성 성상세포(reactive astrocyte)의 클러스터가 이 부위에 밀접하게 연결되어 있었습니다(그림 5
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
냉동 절제 기술에 대해 Mayumi Watanabe에게 감사드립니다. 이 연구는 일본 방위성의 Advanced Research on Military Medicine 보조금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% 포르말린 중성 완충 용액 | FUJIFILM Wako Chemicals | 062-01661 | |
| Anti GFAP, Rabbit | DAKO-Agilent | IR524 | |
| Anti Iba1, Rabbit | FUJIFILM Wako Chemicals | 019-19741 | |
| Chicken anti-Mouse IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21200 | |
| 크라이오 마운트 | Muto Pure Chemicals | 33351 | 조직 동결 매체 |
| Domitor | Orion Corporation | 메데토미딘 | |
| 당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| Falcon 24-웰 폴리스티렌 클리어 플랫 바텀 미처리 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 개별 포장, 멸균, 50/케이스 | CORNING | 351147 | |
| Fluorescein isothiocyanate– 덱스트란 평균 mol wt 40,000 | 시그마-알드리치 | FD40S | FITC-dextran |
| 유리 베이스 디쉬 27mm (No.1 유리) | AGC TECHNO GLASS | 3910-035 | 35 mm 유리 바닥 디쉬 |
| IX83 반전 현미경 | OLYMPUS | ||
| MAS 친수성 접착 현미경 슬라이드 | Matsunami Glass | MAS-04 | |
| Matsunami 커버 유리(No.1) 18 x 18mm | 마쓰나미 유리 | C018181 | |
| 미다졸람 주사 10mg [SANDOZ] | 산도즈 | ||
| 파라포름알데히드 EMPROV ESSENTIAL DAC | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| 연동 펌프 | ATTO | SJ-1211 II-H | |
| RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30g, Coronal | ASI INSTRUMENTS | RBM-2000C | 브레인 슬라이서 |
| Vetorphale | Meiji 동물 건강 | VETLI5 | 부토르파놀 |
참고문헌
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
- Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in....
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