방법 논문

망막을 평가하기 위한 쥐와 쥐 안구의 조직학적 슬라이드의 준비 및 분석

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DOI:

10.3791/66663

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2024년 8월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 설치류 안구에서 슬라이드의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법을 사용하면 광학 현미경으로 내부 망막을 쉽게 시각화하고 평가할 수 있습니다. 절차는 생쥐와 쥐의 안구에 대해 제시됩니다.

초록

설치류 안구는 녹내장, 고혈압성 망막병증 등과 같은 많은 안과 질환의 병리 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 전임상 실험을 통해 연구자들은 신약의 효능을 조사하거나, 새로운 치료 방법을 개발하거나, 질병의 발병 또는 진행과 관련된 새로운 병리 메커니즘을 찾을 수 있습니다. 조직학적 검사는 수행된 실험의 효과를 평가하는 데 필요한 많은 정보를 제공하며 퇴행, 조직 리모델링, 침투 및 기타 여러 병리를 밝힐 수 있습니다. 임상 연구에서 조직학적 검사에 적합한 눈 조직을 얻을 수 있는 기회는 거의 없기 때문에 연구자들은 설치류의 안구 검사가 제공하는 기회를 활용해야 합니다. 이 원고는 설치류 안구 절편의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 절차는 마우스와 쥐의 안구에 대해 제시되며 (i) 안구 적출, (ii) 추가 분석을 위해 안구 보존, (iii) 파라핀으로 조직 처리, (iv) 슬라이드 준비, (v) 헤마톡실린 및 에오신 염색, (vi) 광학 현미경으로 조직 평가. 제안된 방법을 사용하면 망막을 쉽게 시각화하고 자세히 평가할 수 있습니다.

서론

안구는 시각 기관을 구성하는 지구본과 같은 구조입니다. 안구 내부는 각막, 홍채, 섬모체, 수정체, 전방, 후방을 포함하는 전안부와 유리체, 망막, 맥락막, 공막, 시신경두를 포함하는 후안부의 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 전방(anterior chamber)은 각막과 홍채 사이에 위치합니다 1,2. 홍채는 중앙에 동공이라고 하는 구멍이 있는 원형 구조입니다. 각막과 홍채의 접합부에는 배수각이 있는데, 여기서 전문화된 섬유주 시스템이 안구에서 정맥계로 수액을 배출합니다. 후방(posterior chamber)은 홍채(iris), 모양체(ciliary body), 수정체(lens)뿐만 아니라 수정체를 제자리에 고정하는 현수인대(suspensory ligament)에 의해 묶여 있습니다. 수정체 뒤에는 안구의 가장 큰 구조인 유리체가 있습니다. 유리체는 망막에 부착되어 그 위치를 안정시킵니다. 망막은 맥락막(choroid)과 공막(sclera)으로 둘러싸여 있다1. 안구의 해부학적 구조는 그림 1에 요약되어 있습니다.

안구 벽은 세 개의 층으로 구성됩니다. 가장 바깥쪽 층은 공막(sclera)으로, 안구를 손상으로부터 보호하고 모양을 유지합니다. 안구의 앞쪽 극에서 공막은 투명한 각막으로 변합니다. 공막 아래에는 포도막(uvea)이라고 하는 혈관 구조가 있는데, 이 조직의 주요 기능은 안구 구조에 영양을 공급하는 것입니다. 포도막은 맥락막을 형성하고, 전극 내에서는 섬모체와 홍채1을 형성합니다. 가장 안쪽 층은 망막으로, 뉴런, 신경교세포, 색소 상피 세포로 구성된 고도로 전문화된 눈 구조입니다. 망막 뉴런에는 광수용체 세포(간상세포와 원추세포), 수평세포, 양극성 세포, 무축삭 세포, 망막 신경절 세포(RGC)가 포함됩니다. 이 세포는 복잡한 층으로 구성되어 있으며, 그들의 역할은 빛의 자극을 받아들이고 처리하는 것입니다 2,3. 망막의 신경교세포(glial cell)는 뮐러세포(Müller cell), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia)로 구성되며, 이들은 망막의 모든 층에 존재합니다. 신경교세포의 많은 기능에는 뉴런의 영양, 혈액-망막 장벽 지원, 망막의 층적 구조를 유지하기 위한 뉴런의 구조적 지원, 뉴런의 신진대사 조절, 뉴런의 기능, 성장 및 생존을 조절하는 생물학적 활성 단백질의 분비, 망막 내 면역학적 과정 조절등이 있습니다 4. 색소 상피 세포는 망막의 가장 바깥쪽 층을 구성하며 맥락막과 광수용체 사이의 장벽 역할을 합니다. 이 세포는 노폐물과 영양분의 양방향 이동을 조절하고 빛 에너지를 흡수하고 빛에서 생성된 활성산소종을 중화하여 과도한 빛으로 인한 손상으로부터 망막을 보호합니다5.

망막은 10개의 층으로 나눌 수 있습니다: (i) 망막 색소 상피, (ii) 광수용체 분절층(간상체 및 원추세포), (iii) 외부 제한막(ELM), (iv) 외부 핵층(ONL), (v) 외망상층(OPL), (vi) 내핵층(INL), (vii) 내망상층(IPL), (viii) 신경절 세포층(GCL), (ix) 망막 신경 섬유층(RNFL), 및 (x) 내부 제한 멤브레인(ILM)2. 망막의 핵층에는 ONL, INL 및 GCL이 포함되며, 세포 간 시냅스 연결이 있는 층에는 OPL 및 IPL6이 있습니다. 간상체와 원추세포의 핵은 ONL을 형성하고 축삭돌기는 OPL로 확장되어 양극성 및 수평 세포의 수상돌기에 연결됩니다. INL 내에는 수평세포, 양극성 세포핵, 무축삭 세포핵이 있습니다. IPL 내에서 양극성 세포와 무축삭 세포의 축삭 말단은 망막 신경절 세포의 수상돌기와 시냅스를 형성합니다. GCL 내에서 망막 신경절 세포는 대부분의 세포체를 구성하지만 일부 탈구된 무축삭 세포도 발견될 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 축삭돌기는 RNFL을 형성하고, 더 나아가 시신경을형성합니다 7,8,9.

망막의 신경퇴행성 질환과 같은 많은 안과 질환은 돌이킬 수 없고 불치의 실명을 초래한다10. 시각은 가장 중요한 감각 중 하나로 간주되며11 영구적인 실명은 환자의 삶의 질을 현저히 떨어뜨린다. 많은 질병의 병리 메커니즘에 대한 이해를 심화하기 위해 세포 배양 또는 동물 모델을 사용한 전임상 연구가 광범위하게 수행됩니다. 실험 동물을 사용한 전임상 연구는 안과 질환의 기저에 있는 병리 메커니즘을 평가하고 새로운 치료 전략을 개발할 수 있는 기회를 제공합니다. 안과 질환은 대형 동물(원숭이, 소, 개, 고양이)과 작은 동물(토끼, 쥐, 생쥐, 제브라피시) 모두에서 모델링할 수 있습니다. 더 큰 동물을 사용하면 크기 때문에 눈에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 반면에 설치류로 수행 된 실험은 상대적으로 빠른 번식으로 인해 특정 질병에 대한 감수성을 특징으로하는 근친 균주의 번식을 허용합니다12, 13.

동물 모델에서는 적출이 가능하여 안구에 대한 상세한 조직병리학적 검사를 수행할 수 있으며, 질병 발병 중 눈의 특정 구조에서 나타나는 경미한 병리학을 평가할 수 있습니다. 조직병리학적 평가는 안구 장애의 병리 메커니즘을 연구하는 동안 매우 유용한 도구입니다. 발표된 문헌에서 안구의 조직학적 검사 방법론에 대한 설명이 매우 제한적이고 단계별 가이드가 부족하여 초보자가 재현하기 어렵습니다. 이 연구는 조직학적 슬라이드를 준비하고 쥐와 쥐의 망막을 평가하는 간단하고 간결한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

연구는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 안구는 폴란드 바르샤바에 있는 바르샤바 생명과학대학교의 제2차 지역 윤리 위원회에서 발행한 연구 승인 번호 WAW2/122/2020을 기반으로 수행된 실험에 포함된 동물에서 얻은 것입니다. 우리의 프로토콜은 11주와 44주 된 쥐와 6주, 12주, 16주 된 쥐를 검사하여 개발되었습니다.

1. 마우스 안구의 준비

참고: 이 프로토콜은 생쥐 안구 절편을 준비하는 방법을 제시하며, 11주 령의 암컷 C57Bl/6마리의 마우스(평균 체중 21g), 44주 령의 암컷 C57Bl/6마리의 마우스(평균 체중 25g), 11주 령의 암컷 DBA/마우스 2마리(평균 체중 21.5g) 및 녹내장이 있는 44주 령의 암컷 DBA/마우스 2마리(평균 체중 25g)에서 채취한 안구를 사용하여 개발되었습니다.

  1. 적출
    1. 작은 집게를 사용하여 눈꺼풀을 엽니다. 안구가 탈출할 수 있도록 눈꺼풀을 누릅니다.
    2. 작고 날카로운 가위로 안구 뒤의 조직을 잘라 안구에서 안구를 해부합니다. 안구가 안와에서 제거되면 튀어나온 결합 조직과 안구 주위 근육을 잘라냅니다.
      1. 예를 들어, 안구의 측직근 힘줄 그루터기에 작은 봉합사를 묶어 안구의 측두근을 표시하여 안구의 측두부 쪽을 표시하여 안구의 방향을 더 잘 잡을 수 있도록 표시합니다.
  2. 조직의 정착
    1. 적출된 안구를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 파라포름알데히드(PFA) 4% 용액에 24시간 동안 그대로 둡니다.
    2. 그 후, 10 % 자당 용액에 안구를 24 시간 동안 처리 한 다음 제거하고 20 % 자당 용액에 24 시간 동안 놓고, 마지막으로 제거하고 30 % 자당 용액에 24 시간 동안 놓습니다.
      알림: 이 과정에서 안구를 4°C의 낮은 온도로 유지하십시오. 안구 손상의 위험을 최소화하기 위해 자당 침투에 대한 바늘 천자를 피해야 합니다.
  3. 조직 동결 및 보관
    1. 자당 용액에서 안구를 제거하고 종이 타월로 가볍게 두드려 말리십시오.
    2. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 안구를 넣고 향후 처리를 위해 -80°C에서 동결합니다.
      참고: -80 °C에서 보관하면 안구는 향후 처리될 때까지 최대 12개월 동안 생존할 수 있습니다.
  4. 슬라이드 준비
    1. 안구는 실온에서 해동합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 카세트로 옮기고 흐르는 물에 20분 동안 헹구어 자당을 씻어냅니다.
    2. 흄 후드 아래의 용액에 안구를 넣은 다음 제거하여 안구를 탈수합니다: 에틸 알코올(EtOH) 70% 용액 10분, EtOH 80% 용액 10분, EtOH 96% 용액 10분, EtOH 99.9% 용액 10분, 아세톤 5분.
    3. 흄 후드 아래에 자일렌에 5분 동안 넣어 안구를 청소합니다.
    4. 비커에 고체 파라핀을 넣고 파라핀 제조업체가 지정한 용융 온도(파라핀의 용융 온도는 46°C에서 68°C 사이)보다 높은 온도로 설정된 실험실 인큐베이터에 넣어 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 녹은 후(시간은 사용된 파라핀의 양에 따라 다름) 파라핀이 있는 비커로 안구를 옮기고 인큐베이터에서 1시간 동안 따뜻하게 유지합니다. 파라핀이 조직에 침투한 지 1시간 동안 10-15분마다 파라핀을 저어줍니다.
      참고: 용액을 교반하는 동안 파라핀 침투를 가능하게 하는 조직 처리기를 이 단계에 사용할 수 있습니다.
    5. 아래 설명된 대로 안구를 파라핀 블록에 삽입합니다.
      1. 카세트를 열고 상단 커버를 제거합니다. 금속 주형을 선택하고 소량의 파라핀을 부어 주형 바닥을 덮습니다. 집게로 카세트에서 안구를 제거하고 금형의 파라핀에 놓습니다. 시상면에서 절단할 수 있도록 안구를 옆으로 눕힙니다.
        알림: 안구를 옆으로 눕히면(앞쪽 극이 한쪽에, 뒤쪽 극이 다른 쪽에 위치함) 시상면을 절단할 수 있습니다. 이런 식으로 각막, 홍채, 섬모체, 동공, 말초 및 중앙 망막을 통한 절편을 얻을 수 있습니다.
      2. 파라핀이 약간 응고되어 조직을 제자리에 고정할 수 있도록 -15°C로 설정된 냉각판에서 금형을 잠시 냉각합니다. 파라핀으로 조직을 조심스럽게 덮고 카세트 바닥을 덮어 블록을 형성합니다. 블록을 냉각판에 올려 완전히 응고시킵니다. 그런 다음 금속 주형에서 블록을 제거하고 파라핀 블록을 냉각판에 다시 놓고 절단하기 전에 최소 15분 동안 냉각시킵니다.
    6. 마이크로톰에 파라핀 블록을 고정합니다. 마이크로톰을 설정하여 블록에서 여분의 파라핀을 잘라내고(15μm를 자르도록 설정) 안구 중앙까지 다듬습니다. 마이크로톰 설정을 변경하여 더 얇은 부분을 자르고(여기서는 3.5μm를 자르도록 설정) 섹션을 슬라이드에 배치합니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하는 경우 젖은 티슈로 슬라이드에서 여분의 물을 제거하십시오.
      참고: 목표는 동공을 통해 최소 3개의 단면을 얻는 것입니다. 경험이 적은 연구자일수록 학생 수준에서 절편을 보장하기 위해 더 많은 단면을 얻어야 합니다. 하나의 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치합니다. 또한 경험이 부족한 연구자의 경우 조직을 더 두껍게 절단하는 등의 방법을 4μm 또는 5μm 두께로 절단할 수 있습니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하면 수조 없이 마이크로톰을 사용하는 것과 비교할 때 조직 절편을 슬라이드로 옮기는 과정이 훨씬 쉬워집니다. 주목할 가치가 있는 또 다른 점은 렌즈를 절단하기 어려울 수 있다는 것입니다. 부서지기 쉬운 렌즈로 인한 조직 손상 위험을 최소화하려면 단단한 조직을 절단하도록 지정된 날카로운 마이크로톰 블레이드만 사용하십시오. 한 블레이드는 트리밍에 사용하고 다른 블레이드는 블레이드의 무뎌짐을 최소화하기 위해 섹션을 절단하는 데 사용하는 것이 좋습니다.
    7. 슬라이드를 56°C로 설정된 실험실 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
    8. 인큐베이터에서 슬라이드를 제거하고 다음 용액에 슬라이드를 순차적으로 넣고 제거하여 수동으로 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색을 시작합니다. 7분 크실렌, 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커) 및 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커)으로 시작합니다. 2분 96% EtOH, 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)를 사용합니다.
    9. 흐르는 물에 5분, Mayer의 헤마톡실린 2분, Mayer의 헤마톡실린(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커), 흐르는 물 5분, 흐르는 물 5분(또 다른 깨끗한 비커)으로 씻습니다.
    10. 1% Eosin을 2분 동안 추가한 다음 1분 96% EtOH, 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 크실렌, 1분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)을 추가합니다.
      참고: 또는 자동 슬라이드 염색기를 사용하십시오.
    11. 자동 슬라이드 실러를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다. 준비된 슬라이드는 광학 현미경으로 보관 및 평가할 준비가 되었습니다.
      참고: 또는 염색된 조직에 폴리스티렌 마운턴트의 얇은 층을 놓고 유리 커버슬립으로 덮어 수동으로 슬라이드 씰링을 수행합니다.
      주의 : PFA, EtOH, 아세톤 및 자일렌을 포함하는 단계는 실험실 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.

2. 쥐 안구 단면도와 활주 설치의 준비

참고: 이 프로토콜은 쥐 안구 절편을 준비하는 방법을 제시하며 6주 령의 수컷 SHR 쥐(평균 체중 115.5g), 동맥성 고혈압이 있는 12주 령의 수컷 SHR 쥐(평균 체중 262.5g), 6주 령의 수컷 WKY 쥐(평균 체중 143.5g), 12주 령의 수컷 WKY 쥐(평균 체중 265g), 생후 12주 령의 수컷 루이스 쥐(평균 체중 310g)와 당뇨병을 앓고 있는 16주 령의 수컷 루이스 쥐(평균 체중 259g).

  1. 적출
    1. 작은 집게를 사용하여 눈꺼풀을 엽니다. 눈꺼풀을 눌러 안구를 탈출시킵니다.
    2. 작고 날카로운 가위로 안구 뒤의 조직을 잘라 안구에서 안구를 해부합니다.
      참고: 예를 들어, 안구의 측직근 힘줄 그루터기에 작은 봉합사를 묶어 안구의 측두근을 표시하여 안구의 측두부 쪽을 표시하는 등 더 나은 방향을 위해 안구를 표시합니다.
  2. 조직의 정착
    1. 적출된 안구를 1.5mL 미세원심분리 튜브에 넣고 인산염 완충액 식염수(PBS)에 용해된 파라포름알데히드(PFA) 4% 용액에 24시간 동안 둡니다.
    2. 그 후, 10% 자당 용액에 안구를 24시간 동안 처리한 후, 제거하고 20% 자당 용액에 24시간 동안 놓고, 마지막으로 제거하여 30% 자당 용액에 24시간 동안 놓습니다.
      알림: 이 과정에서 안구를 4°C의 낮은 온도로 유지하십시오. 안구 손상의 위험을 최소화하기 위해 자당 침투에 대한 바늘 천자를 피해야 합니다.
  3. 조직 동결 및 보관
    1. 자당 용액에서 안구를 제거하고 종이 타월로 가볍게 두드려 말리십시오.
    2. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 안구를 넣고 향후 처리를 위해 -80°C에서 동결합니다.
      참고: -80°C에서 보관하면 안구는 향후 처리될 때까지 최대 12개월 동안 생존할 수 있습니다.
  4. 슬라이드 준비
    1. 냉동실과 마이크로 원심분리기 튜브에서 안구를 제거합니다. 날카로운 메스로 시상면을 따라 안구를 반으로 자릅니다. 렌즈를 제거하고 버리십시오.
      알림: 이 단계는 냉동실에서 갓 꺼낸 얼어붙은 안구에 수행하는 것이 가장 쉽습니다. 안구를 자르는 동안 수정체가 주변 조직을 손상시킬 수 있습니다. 손상 위험을 최소화하려면 매우 날카로운 메스를 사용하고 주의하십시오.
    2. 안구는 실온에서 해동합니다. 두 개의 반쪽을 카세트로 옮기고 흐르는 물에 20분 동안 헹구어 자당을 씻어냅니다.
    3. 흄 후드 아래의 용액에 안구를 넣은 다음 제거하여 안구를 탈수시킵니다: 에틸 알코올(EtOH) 70% 용액을 15분, 80% EtOH 용액을 15분, 99.9% 용액을 15분, 아세톤을 7분 동안 넣습니다.
    4. 흄 후드 아래에 자일렌에 7분 동안 넣어 안구를 청소합니다.
    5. 비커에 고체 파라핀을 넣고 파라핀 제조업체가 지정한 용융 온도(파라핀의 용융 온도는 46°C에서 68°C 사이)보다 높은 온도로 설정된 실험실 인큐베이터에 넣어 파라핀을 녹입니다. 파라핀이 완전히 녹은 후(시간은 사용된 파라핀의 양에 따라 다름) 파라핀이 있는 비커로 안구를 옮기고 인큐베이터에서 1시간 동안 따뜻하게 유지합니다. 파라핀이 조직에 침투한 지 1시간 동안 10-15분마다 파라핀을 저어줍니다.
      참고: 용액을 교반하는 동안 파라핀 침투를 가능하게 하는 조직 처리기를 이 단계에 사용할 수 있습니다.
    6. 아래 설명된 대로 안구를 파라핀 블록에 삽입합니다.
      1. 카세트를 열고 상단 커버를 제거합니다. 금속 주형을 선택하고 소량의 파라핀을 부어 주형 바닥을 덮습니다. 집게로 카세트에서 안구를 제거하고 금형의 파라핀에 놓습니다. 한쪽 안구를 컵 바닥이 위로 향하게 하고 다른 안구를 아래로 향하게 놓습니다.
        참고: 안구 반쪽을 컵 바닥이 위로 향하게 하고 다른 반쪽을 아래로 향하게 하면 시상면에서 조직을 절단할 수 있습니다. 이런 식으로 각막, 홍채, 섬모체, 동공, 말초 및 중앙 망막을 통한 절편을 얻을 수 있습니다.
      2. 파라핀이 약간 굳어지고 안구가 제자리에 고정되도록 -15°C로 설정된 냉각판에서 금형을 잠시 냉각합니다. 파라핀으로 안구를 조심스럽게 덮고 카세트 바닥을 블록으로 만듭니다. 블록을 냉각판에 올려 완전히 응고시킵니다. 그런 다음 금속 주형에서 블록을 제거하고 파라핀 블록을 냉각판에 다시 놓고 절단하기 전에 최소 15분 동안 냉각시킵니다.
    7. 마이크로톰에 파라핀 블록을 고정합니다. 마이크로톰을 설정하여 블록에서 여분의 파라핀을 잘라내고(15μm를 자르도록 설정) 안구 중앙에 도달할 때까지 다듬습니다. 마이크로톰 설정을 변경하여 더 얇은 부분을 자르고(여기서는 3.5μm를 자르도록 설정) 섹션을 슬라이드에 배치합니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하는 경우 젖은 티슈로 슬라이드에서 여분의 물을 제거하십시오.
      참고: 목표는 동공을 통해 최소 3개의 단면을 얻는 것입니다. 경험이 적은 연구자일수록 학생 수준에서 절편을 보장하기 위해 더 많은 단면을 얻어야 합니다. 하나의 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치합니다. 또한 경험이 부족한 연구자의 경우 조직을 더 두껍게 절단하는 등의 방법을 4μm 또는 5μm 두께로 절단할 수 있습니다. 인접한 수조와 함께 마이크로톰을 사용하면 수조 없이 마이크로톰을 사용하는 것과 비교할 때 조직 절편을 슬라이드로 옮기는 과정이 훨씬 쉬워집니다.
    8. 슬라이드를 제거하고 다음 용액에 슬라이드를 순차적으로 끼우고 제거하여 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 수동으로 염색을 시작합니다. 7분 크실렌, 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커) 및 5분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커)으로 시작합니다. 2분 96% EtOH, 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 1분 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)를 사용합니다.
    9. 흐르는 물에 5분, Mayer의 헤마톡실린 2분, Mayer의 헤마톡실린(깨끗한 용액이 있는 또 다른 비커), 흐르는 물 5분, 흐르는 물 5분(또 다른 깨끗한 비커)으로 씻습니다.
    10. 1% Eosin을 2분 동안 추가한 다음 1분 96% EtOH, 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 30초 96% EtOH(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 크실렌, 1분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커), 2분 자일렌(깨끗한 용액이 있는 다른 비커)을 추가합니다.
      참고: 또는 자동 슬라이드 염색기를 사용하십시오.
    11. 자동 슬라이드 실러를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다. 준비된 슬라이드는 광학 현미경으로 보관 및 평가할 준비가 되어 있습니다.
      참고: 또는 염색된 조직에 폴리스티렌 장착제의 얇은 층을 놓고 유리 커버슬립으로 덮어 슬라이드 밀봉을 수동으로 수행합니다.
      주의 : PFA, EtOH, 아세톤 및 자일렌을 포함하는 단계는 실험실 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다.

3. 안구 부분 평가

  1. 슬라이드 스캔
    1. 슬라이드를 조직병리학적 슬라이드 스캐너에 넣고 스캔 모드: 40x를 사용하여 섹션을 스캔합니다. 이미지를 고해상도 디지털 파일로 저장합니다.
  2. 슬라이드 분석
    1. 이미지 보기 소프트웨어를 사용하여 스캔한 파일을 엽니다. 교차 동공 단면을 찾고 세 개의 연속된 단면을 분석합니다.
    2. 망막의 가장 두꺼운 부분을 찾아 오른쪽 상단 모서리에 있는 확대 상자를 누르고 20배를 선택하여 이미지를 20배로 확대합니다. 마우스를 망막의 가장 두꺼운 부분에 있는 ELM 수준으로 이동하고 마우스의 오른쪽 버튼을 누르고 주석 달기 및 눈금자를 선택합니다.
    3. ILM으로 마우스를 이동하고 왼쪽 단추를 클릭합니다. 측정 RT의 제목을 지정하고 제목을 표시하고 길이를 표시하는 상자를 선택합니다. 이런 식으로 망막 두께(RT)가 측정되고 측정값이 μm 단위로 표시됩니다. 대표적인 결과는 그림 2 와 그림 3에 나와 있습니다.
    4. 자를 사용하여 ONL, OPL, INL 및 IPL을 포함한 각 망막층의 두께를 측정하고 레이블을 지정합니다. 대표적인 결과가 그림 4 와 그림 5에 나와 있습니다.
    5. GCL 내의 세포 수를 세려면 미리 결정된 망막 길이를 설정합니다. 예를 들어, 마우스 망막의 경우 500μm 섹션 1개를 사용하고 쥐 망막의 경우 100μm 섹션 5개를 사용합니다.
    6. 눈금자를 사용하여 GCL을 따라 선택한 거리를 측정합니다. 마우스의 오른쪽 버튼을 누르고 1x RBC> Annotate > Saved를 선택합니다. 미리 결정된 망막 길이에 걸쳐 GCL을 따라 둥글고 헤마톡실린으로 염색된 몸체로 식별된 각 세포를 클릭합니다. 원으로 둘러싸인 셀의 수를 계산합니다. 대표적인 결과가 그림 6 과 그림 7에 나와 있습니다.
    7. 세 개의 연속된 섹션을 분석한 후 모든 측정값에 대한 평균을 그립니다.

결과

제시된 프로토콜을 사용하여 안구의 특정 구조의 해부학과 형태를 자세히 평가할 수 있습니다. 우리 팀은 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 고혈압성 망막병증과 같은 망막 질환에서 신경퇴행의 병리기전을 연구하는 데 중점을 두고 있습니다. 망막의 신경퇴행 특징을 평가하기 위해 RT(쥐 안구-그림 2, 쥐 안구-그림 3), ONL, OPL, INL, IPL(쥐 안구-그림 4, 쥐 안구-그림 5) 및 GCL의 세포 수(쥐 안구-그림 6, 쥐 안구-그림 7)를 평가했습니다. GCL의 RT와 세포는 중앙 망막에서 가장 높고 주변부에서 가장 낮을 것으로 예상됩니다. 동공 높이에서 안구를 절단함으로써 중앙(안구의 뒤쪽 극)과 말초(모양체에 가까운) 망막을 통한 단면이 하나의 슬라이드에서 달성됩니다.

GCL 세포를 계수하는 것은 매우 객관적인 것으로 간주될 수 있지만, 편향된 절편으로 인한 편향은 특정 망막층 측정 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 바이어스를 피하기 위해 측정값은 RT 값에 대한 주어진 층의 두께의 비율(ONL/RT, OPL/RT, INL/RT 및 IPL/RT)로 표시될 수 있습니다.

표시된 부분을 보여주는 눈 해부학 다이어그램: 망막, 공막, 수정체, 각막, 시신경, 황반.
그림 1: 안구의 해부학적 구조. 가장 큰 구조의 라벨링이 있는 안구의 시상 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직층을 보여주는 망막 단면의 현미경 이미지, 두께 측정 125μm.
그림 2: 마우스의 망막 두께. 외부 제한 막에서 가장 넓은 지점에서 내부 제한 막까지의 망막 두께(RT)를 측정하며, 녹색 막대로 표시됩니다. 쥐 안구(염좌: C57Bl/6, 연령: 44주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

53.4μm 두께의 망막층을 보여주는 조직학적 절편; 현미경 이미지, 조직 연구.
그림 3: 쥐의 망막 두께. 외부 제한 막에서 가장 넓은 지점에서 내부 제한 막까지의 망막 두께(RT)를 측정하며, 녹색 막대로 표시됩니다. 쥐 안구 (균주 : 루이스, 나이 : 16 주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

망막 조직 단면도; 측정된 레이어: IPL, INL, OPL, ONL; 현미경 분석.
그림 4: 마우스의 망막층. 개별 망막층의 두께 측정: 녹색 막대로 표시된 외부 핵층(ONL), 외부 망상층(OPL), 내부 핵층(INL) 및 내부 망상층(IPL). 쥐 안구(염좌: C57Bl/6, 연령: 44주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

라벨이 붙은 층이 있는 망막 단면의 현미경 이미지: OPL, ONL, IPL, INL; 스케일 바 100 μm.
그림 5: 쥐의 망막층. 개별 망막층의 두께 측정: 녹색 막대로 표시된 외부 핵층(ONL), 외부 망상층(OPL), 내부 핵층(INL) 및 내부 망상층(IPL). 쥐 안구 (균주 : 루이스, 나이 : 16 주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

층상 세포 구조, 현미경 이미지, 조직 분석, 500μm 스케일을 보여주는 조직학 섹션.
그림 6: 생쥐에서 신경절 세포층의 세포 계수. 500 μm 길이의 망막을 따라 신경절 세포층(GCL)의 세포를 계수하는 방법. 단세포체는 신경절 세포층 내에 위치한 둥글고 헤마톡실린으로 염색된 몸체로 확인되었습니다. 셀은 검은색 원으로 표시됩니다. 쥐 안구(염좌: DBA/2, 연령: 44주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직학 슬라이드, 망막 단면; 조직층이 보입니다. 현미경 검사, 100μm 스케일.
그림 7: 쥐의 신경절 세포층의 세포 계수. 100μm 길이의 망막을 따라 신경절 세포층(GCL)의 세포를 계수하는 방법. 단세포체는 신경절 세포층 내에 위치한 둥글고 헤마톡실린으로 염색된 몸체로 확인되었습니다. 셀은 검은색 원으로 표시됩니다. 쥐 안구 (균주 : 루이스, 나이 : 16 주). 왼쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 100μm의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

쥐와 쥐의 안구에 대한 조직학적 검사는 실험 안과 분야에서 강력한 도구입니다. 안과 질환 과정에서 안구 구조의 변화와 관련된 새로운 정보를 제공할 수 있으며, 그렇지 않으면 임상 환경에서 관찰되지 않을 것입니다. 설명된 프로토콜은 망막의 조직학적 분석을 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 각막과 같은 전방 조직을 처리하는 데 필요한 절차의 미묘함은 여기에 설명되어 있지 않습니다.

제시된 연구에서, 동물을 안락사시킨 후 적출을 시행했는데, 이는 안구 외에 다른 조직(혈액, 신장)을 연구 목적으로 적출했기 때문입니다. 그러나 마취 하에 살아있는 동물에 대해서도 적출을 수행할 수 있습니다. Wilding 등은 이 절차를 설명했으며(14), 우리는 독자들이 적출 절차의 사진을 볼 수 있도록 이 작업을 참조하도록 권장하고자 합니다.

쥐와 쥐 안구의 슬라이드 준비에 대한 프로토콜은 비슷하지만 슬라이드를 준비할 때 고려해야 할 쥐와 쥐 안구의 주요 차이점은 크기입니다. 쥐의 안구는 생쥐에 비해 8-10배 더 큰 부피를 가지고 있으며, 쥐 안구의 평균 축 길이는 약 3.2mm이고 쥐 안구의 축 길이는 일반적으로 약 6.91mm에서 진동합니다15,16. 이것은 가공 중에 시약이 조직에 더 잘 침투하기 위해 쥐의 안구를 반으로 잘라야 할 필요성을 용이하게 합니다. 또한 시약이 쥐 조직에 침투하는 데 필요한 시간은 쥐 안구보다 깁니다. 쥐의 안구를 반으로 자르는 동안에는 단단하고 얼어붙은 수정체가 장애물이 될 수 있으므로 날카로운 칼날을 사용하는 것이 중요합니다.

논의할 가치가 있는 또 다른 요점은 동물로부터 수확한 후 조직을 고정하는 것입니다. 제시된 프로토콜에서, 적출 후 안구를 PFA로 고정하고 자당 용액에 담갔다. 설탕은 동결 중에 형성되는 얼음 결정에 의한 손상으로부터 큰 조직의 세포를 보호하기 때문에 동결 보호제 역할을 합니다17. 조직을 동결하면 연구자들은 조직을 더 오래 보관할 수 있으며 마이크로톰(제시된 것과 같은)을 사용한 조직병리학적 분석, 냉동 절제체를 사용한 조직병리학적 분석, 컨포칼 현미경을 사용한 평가를 위한 면역 라벨링을 포함한 향후 다양한 검사에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 쥐의 안구를 반으로 자를 때(2.4.1단계) 효율적이고 신속하게 절단하고(5 - 10초 이내) 눈이 해동될 시간이 없는 경우, 안구의 절반은 조직 병리학에 사용하고 다른 절반은 향후 면역 표지를 위해 냉동고에 다시 넣을 수 있습니다. 파라핀 고정 후 단백질 에피토프의 형태에 변화가 있을 수 있으므로 이전에 파라핀이 침투한 조직에 대해 면역 라벨링을 수행하는 것은 권장하지 않습니다. 그러나, 연구자 그룹이 마이크로톰을 사용하여 조직병리학적 분석만을 수행하려는 경우, 파라핀 매립을 위해 조직을 고정하는 더 간단하고 표준적인 방법을 사용할 수 있습니다 - 예를 들어, 마우스의 경우 1.2.1 - 1.4.1 단계 또는 쥐의 경우 2.2.1 - 2.4.2 단계를 수행하는 대신, 조직을 24시간 동안 PFA의 10% 용액에 넣고, 그런 다음 처리할 때까지 4°C의 PBS에 보관하십시오. 그러면 조직이 얼지 않기 때문에 설탕이 동결 방지제로 필요하지 않습니다. 이 제안된 방법을 사용하면 동결 과정을 피할 수 있으며, 이는 유익한 것으로 입증되고 더 높은 품질의 슬라이드를 얻을 수 있습니다. 안구를 동결하는 것은 연구자들이 조직병리학적 검사를 수행할 시간을 선택하는 데 더 많은 자유를 제공하지만, 잠재적으로 샘플의 품질을 떨어뜨리고 망막 박리를 유발할 수 있는 단계입니다. 그러나 조직을 4°C에서 보관하면 생물학적 안정성이 짧아지고 4주 이내에 조직을 분석해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 또한 쥐 안구로 작업하는 동안 2.4.1단계(안구를 반으로 자르는 것)는 얼지 않은 안구에서 수행하기가 훨씬 더 어려울 것입니다.

제시된 방법론은 Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 및 Dorfman et al.21이 설명한 개인적 경험과 시행착오 방법에 대해 설명한 방법론을 기반으로 개발되었습니다. 망막과 개별 층의 두께를 측정하는 방법은 Chai et al.16 및 Barber et al.18,22에 제시된 방법론을 기반으로 설명됩니다. 망막 망막 신경절 수치 계산 방법은 Chai 등16, Zhang 등18, Steinle 등19, Dorfman 등18,20,21,23의 연구를 검토하여 개발되었습니다. 전반적으로, 안구의 조직병리학적 슬라이드의 준비는 안구가 구형이기 때문에 취급, 절단 및 절단이 더 어렵기 때문에 표준 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 슬라이드 준비와 다릅니다. 또한 공막은 시약이 조직으로 침투하는 것을 막는 장벽입니다. 안구의 조직학적 슬라이드를 준비할 때는 안구 안쪽의 섬세한 구조가 손상되지 않도록 주의하면서 보다 섬세하고 정확하게 작업해야 합니다. 이 프로토콜의 수정에는 파라핀 임베딩 대신 메타크릴레이트 임베딩 기술의 사용이 포함될 수 있으며, 이는 더 나은 형태학적 결과를 제공할 수 있는 것으로 보고되었습니다. 그러나 망막을 평가하기 위해 이 방법을 사용한 연구자는 거의 없습니다24,25.

이 프로토콜은 편향에서 자유롭지 않습니다. 우리 팀이 어려움을 겪었던 가장 큰 문제는 망막 파열과 망막 박리였습니다. 특히 쥐 안구의 망막이 찢어지기 쉬웠는데, 슬라이드 준비 전에 반으로 잘라야 했기 때문에 망막이 손상되기 쉬웠기 때문입니다. 망막 박리로 인해 이 프로토콜은 맥락막, 망막 색소 상피 또는 광수용체 분절층의 평가에 사용할 수 없습니다. 그러나 우리 팀은 이 프로토콜을 사용하여 내부 망막(ILM에서 ELM까지)을 평가할 수 있다고 믿습니다. 망막의 찢어짐과 박리를 최소화하기 위해 프로토콜의 각 단계는 신중하고 천천히, 그리고 정확한 움직임으로 수행되어야 합니다.

망막의 조직병리학적 분석은 표준 인체 진단의 일부는 아니지만 전임상 연구에서 널리 사용되는 방법입니다. 전임상 연구에서 망막의 조직병리학적 평가 결과는 임상 시험에서 인간을 대상으로 임상 환경에서 수행할 수 있는 생체 내 검사 중 망막을 통한 단면을 보여주는 검사인 광학 간섭성 단층촬영(Optical Coherent Tomography, OCT)26의 결과와 관련되고 논의될 수 있습니다. 그러나 OCT는 덜 세부적인 검사입니다. 따라서 전임상 연구의 일환으로 수행된 조직학적 연구에서 얻을 수 있는 정보는 대체할 수 없으며 의학 지식을 개발하는 데 필요합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

쥐를 포함한 이 작업은 2014-2020년 운영 프로그램 지식 교육 개발에 따라 유럽 사회 기금이 공동 자금을 지원하는 바르샤바 의과 대학의 발전을 위한 기회로서의 TIME 2 MUW - 교육 우수성 프로젝트의 일환으로 자금을 지원받았으며, 공동 자금 조달 계약 번호: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. 생쥐를 포함한 이 작업은 2020년부터 2022년까지 시행된 프로젝트의 일환으로 수행되었으며, 바르샤바 의과대학이 확보한 과학 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세톤 쳄푸르 
Dumont 핀셋 #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm 팁월드 정밀 기기14095작은, 미세수술용 집게
EosinMar-Four4P.05.2001/L수용액
에틸 알코올 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA입니다.
에틸 알코올 99.9 %Chempur 채널. 에틸. ALK.99,9%BWEtOH 빙하의 70% 및 80% 용액을 준비하는 데 사용
- 86 ° C 초저온 냉동고 NU-9483ENuAire13027D0034동결 온도 - 80°C; C
유리 슬라이드Mar-FourMI.15.01673양면 매트 필드가 있는 그라운드 유리 슬라이드 설명을 위한
Leica CV5030 완전 자동화된 유리 커버슬리퍼Leica Biosystems 14,04,78,80,101자동 슬라이드 실러 
Mayer의 헤마톡실린Chempur 
메탈 베이스 몰드 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Microtome 면도날Mar-FourHI. N.35절단 각도 35°;
마이크로-트윈 생검 카세트Mar-FourLN.13874550
마이크로파 하이브리드 조직 처리기마일스톤
멀티스테인 Leica ST5020Leica Biosystems 자동 슬라이드 염색기 
NanoZoomer 2.0-HT 슬라이드 스캐너HamamatsuC9600조직병리학 슬라이드 스캐너
NDP.view2 이미지 보기 소프트웨어HamamatsuU12388-01이미지 보기 소프트웨어
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010용융 온도 56 > 씨 - 58 ° C
파라포름알데히드시그마 - Aldrich441244-1KGPBS 정제에 4% 용액 준비
Merck Millipore524650-1EA제조업체의 지침에 따라 인산염 완충 식염수 용액을 준비하는 데 사용
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
냉장고-냉동고 EN14000AWElectrolux925032562-00냉동 4 ° C
메스 블레이드Swann-MortonT.OST. SKAL00.024
설탕쳄푸르 
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, 곡선World Precision Instruments501925곡선형, 작은 현미경 수술용 가위
자동 밀봉기용 테이프Mar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur 채널. KSYL.5l.METAL.OP 
111024800CH1246874023803081427720906형

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