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방법 논문

눈물에서 유래한 외색체 miR-15a, 당뇨병성 망막병증의 새로운 진단 도구로

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/66687

⸱

2025년 12월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

이 논문에서

요약

이 글은 당뇨병성 망막병증의 새로운 진단 도구로서 눈물에서 miR-15a를 수집하고 검출하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

당뇨병성 망막병증(DR)은 당뇨병의 주요 합병증으로, 당뇨병 환자의 상당 부분에 영향을 미칩니다. 조기 진단과 개입은 돌이킬 수 없는 시력 상실을 예방하는 데 매우 중요합니다. 현재의 진단 방법은 효과적이지만 한계가 있습니다. miRNA는 3'-비번역 영역(3'-UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성 및/또는 번역을 억제하는 작은 비암호화 RNA로, 당뇨병과 유의미하게 연관되어 있으며 눈물에서 얻을 수 있습니다. 이 연구는 눈물액에서 유래한 외계체 miR-15a가 DR의 새로운 진단 표지자로서 가능성을 조사하였다. 눈물 샘플은 135명의 당뇨병 환자(당뇨병성 망막병증 [DR] 환자 36명, DR가 없는 50명)와 49명의 건강한 대조군으로부터 채취되었다. 엑소좀을 분리하고, 외계체 miR-15a의 발현 수준은 드롭렛 디지털 PCR(ddPCR)을 사용해 측정하였습니다. 결과는 당뇨병 및 DR 환자에서 외계체 miR-15a 발현이 건강한 사람들과 비교해 변화를 보였음을 보여주었습니다. 이 결과는 눈물에서 유래한 외계체 miR-15a가 당뇨병과 그 합병증의 분자 메커니즘에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 더 나아가, 이 약물은 비침습적이고 신뢰할 수 있는 당뇨병성 망막병증 진단 바이오마커로서 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.

서론

당뇨병성 망막병증(DR)은 당뇨병의 가장 두드러진 미세혈관 합병증 중 하나로, 전 세계 수백만 명의 시력을 위협하고 있습니다. IDP Atlas 2019의 인구 데이터에 따르면 전 세계 당뇨병 인구의 22.7%로 추정되며, 특히 선진국과 개발도상국에서 신규 확진자 수가 지속적으로 증가하고 있습니다. 임상적으로 DR은 초기 단계 DR 또는 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 후기 단계 DR 또는 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 그리고 황반부종의 존재가 특징입니다. 혈관 투과성 증가와 모세혈관 폐색은 NPDR에서 흔히 관찰되는 병리학적 변화이며, PDR 2,3의 경우 홍채, 황반, 시간두 또는 망막의 비정상적인 신생혈관화가 관찰됩니다. PDR로의 진행은 유리체 출혈과 망막 박리를 초래할 수 있으며, 이는 심각한 시력 장애를 초래할 수 있습니다. 모든 경우에 병리학적 변화는 훈련된 안과 전문의의 안저경 검사나 안저 사진 검사를 통해 발견할 수있습니다. 표준 안저 촬영법을 사용하면 당뇨병성 망막병증을 78%-96% 민감도와 86%-97% 특이도로 발견할 수 있습니다5. 하지만 이 방법은 망막에 손상이 발생한 후에만 감지합니다. 임상적으로 눈에 띄는 망막 증상, 예를 들어 블롯 망막 출혈, 미세동맥류, 삼출물, 신혈관 증식과 같은 증상이 나타나기 전에 DR을 조기에 발견할 필요가 충족되지 않습니다.

분자 도구의 발전으로 인해 엑소좀이 암과 심혈관 질환을 포함한 다양한 질병의 진단 도구로 발견되었습니다 6,7. 엑소좀은 대부분의 세포가 세포외 소포(EV) 공간에 분비하는 지질 이중층 막에 결합된 나노 크기 입자입니다. 이 엑소좀은 혈액, 눈물, 타액, 소변과 같은 생체유체에 의해 운반될 수 있어 비침습적 또는 최소 침습 진단 절차에 쉽게 접근할 수 있습니다8. 단백질, 지질, 핵산 등 다양한 기원 세포 표지를 가지고 있습니다. 특히 EV 내에 탑재된 작은 비암호화 RNA가 주목할 만합니다. 이 RNA들은 단백질로 암호화되지는 않지만, 유전자 조절에서 중요한 역할을 하며, 당뇨병 발병에 매우 중요한 췌장 β세포를 포함한 많은 생리적·병리학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다.

구체적으로, miR-15a는 주로 인슐린 생성과 췌장 베타세포 기능 조절을 통해 당뇨병 발병과 강한 연관성을 가진 것으로 나타났습니다11. 우리 연구팀은 최근 당뇨병성 망막병증 혈장에서 miR-15a가 변질된다는 것을 입증했습니다. 또한 miR-15a는 췌장 베타세포에서도 분비되며, 혈류를 통해 망막12로 이동합니다. 눈물액은 비침습적이고 비용 효율적인 방법으로 쉽게 접근할 수 있는 액체로 간주됩니다13. 이 물질은 다양한 단백질, 지질, 전해질 및 기타 분자의 혼합물을 포함하고 있으며, 이는 망막14를 포함한 안구 표면과 주변 조직의 생리학적 상태를 반영합니다. 눈물액에서 혈청 및 방방액보다 더 많은 miRNA가 검출된 바15,16. 눈물 구성은 당뇨병을 포함한 다양한 전신 질환에 반응하여 변화합니다. 실제로 눈물액 분석은 다발성 경화증, 유방암 등 눈과 관련 없는 질환의 모니터링 및 진단에 유망한 잠재력을 가진 것으로 입증되었습니다18,19. 당뇨병성 망막병증이 눈과 직접 연관되어 있기 때문에, 이 질환에서 눈물액의 잠재적 진단적 특성을 찾는 것이 더 중요할 것입니다. 당뇨병성 망막병증 환자의 눈물액에서 IL-1RA, IL-8, IL-6, TNF-α 수치는 질병의 심각도에 따라 변화하는 것으로 관찰되었습니다20,21. 전통적인 안저경 검사와 비교할 때, 당뇨병성 망막병증에 대한 눈물액 분석은 접근성, 비침습성, 특이성 측면에서 잠재적 장점을 제공하며, 질병 발병 전에 조기 발견할 수 있게 합니다22.

따라서 본 연구의 주요 목표는 당뇨병성 망막병증 집단의 눈물액에서 miRNA 분리 및 정량화를 통해 눈물액에서 유래한 외색체 miR-15a가 당뇨병성 망막병증의 새로운 진단 지표로서 잠재력을 조사하는 것입니다. 이로써 눈물액 선별을 통한 당뇨병성 망막병증 검출 방법이 새롭게 개발되어, 망막 합병증 발병 전에도 발견되어 조기 예방 또는 치료 조치를 가능하게 할 것입니다.

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프로토콜

이 연구는 말라야 의과대학 의학 연구 윤리 위원회(참조 번호: 20165-2446)의 승인을 받아 수행되었습니다. 모집 전에 모든 인간 피실험자로부터 서면 동의를 받았습니다. 총 135명의 환자가 쿠알라룸푸르 말라야 대학교 의료센터(UMMC) 안과 클리닉에 출석한 환자들 중 포함되었습니다. 포함 기준에는 UMMC에 따라 서비스를 받은 환자가 포함되었으며, 나이는 20세에서 80세 사이였습니다. 활성 인슐린 치료를 받고 있고, 최근 3개월 이내에 레이저 또는 항VEGF 치료를 받은 환자, 또는 정기적인 항혈소판 또는 혈액 희석제를 복용 중인 환자는 연구에서 제외되었습니다. 참가자들은 세 그룹으로 나뉘었다: (1) 건강한 대조군(대조군), (2) 망막병증 없는 당뇨병(DM No DR), (3) 망막병증이 동반된 당뇨병(DR). 프로토콜의 요약은 그림 1에 제공되어 있습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1: 프로토콜 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

1. 재료 준비    

  1. 두 개의 겸자, 여섯 개의 솜뭉치, 네 개의 거즈 패드, 쟁반, 생물학적 위험 가방이 포함된 멸균 기본 드레싱 세트를 준비하세요.
  2. 0.9% 염화나트륨 관개 용액 5mL를 트레이에 부으세요.
  3. 눈꺼풀 세정용 물티슈 한 팩을 열고 멸균 공간에 올려놓으세요.
  4. 250 μL 방부액이 담긴 튜브를 준비합니다.
  5. 포장 상태에서 쐐기 높이에서 쉬머 스트립을 접은 후 멸균 스트립을 멸균 필드에 놓으세요.
  6. 무균 상태로 수술용 장갑을 착용하세요.
  7. 멸균 겸자를 사용해 0.9% w/v 멸균 염화나트륨 관개 용액으로 솜뭉치를 적셔 주세요.

2. 인간 대상 준비    

  1. 피실험자가 편안하게 앉도록 한 뒤 눈을 감아달라고 요청하세요.
  2. 관개 용액에 적신 솜뭉치로 안와 주변 피부를 네 번 닦으세요.
  3. 눈꺼풀 세정용 물티슈로 안와 주변 피부를 닦아주세요.

3. 인간의 눈물액 채취

  1. 측두하 포르닉스에 부착한 쉬머스 스트립을 사용해 눈물 체액을 채취하세요.
  2. 부분적으로 접힌 스트립을 오른쪽 눈에 올릴 때, 피실험자에게 왼쪽을 바라보라고 요청합니다. 아래 눈꺼풀을 내리면 하궁을 드러내세요.
  3. 멸균 겸자 한 쌍을 사용해 하부 결막 포르닉스 바깥쪽 3분의 2에 쉬르머 스트립을 붙입니다. 땀이나 피부 위의 다른 물질로 샘플이 오염되는 것을 막기 위해 스트립이 피부에 닿지 않도록 주의하세요.
  4. 피부 접촉을 막기 위해 스트립 아래에 거즈 패드를 깔아주세요.
  5. 찢어진 부분이 스트립에 흡수되도록 20mm 지점 또는 최대 5분 정도 기다려 두세요.
  6. 20mm 수준에 도달하지 못하면 표시를 바탕으로 찢어진 수준을 문서화하여 눈물액 부피의 표준화를 가능하게 합니다.
  7. 멸균 겸자 한 쌍을 사용해 쉬머 스트립을 조심스럽게 제거하고, 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 용액이 담긴 튜브에 스트립을 넣습니다.
  8. 튜브를 쿨러 박스에 넣어 실험실로 운반하세요.
  9. 피부에 남은 용액을 닦아내어 안와 주위 표면을 깨끗이 닦아내세요.

4. 눈물 샘플의 전처리    

  1. 시머 스트립이 담긴 튜브를 실온에서 5분간 PBS에 담갔습니다.
  2. 관을 락커에 올려 실온에서 5분간 저어주세요.
  3. 튜브를 2000 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
  4. 용액을 새 튜브로 옮기고 라벨링한 뒤 -80 °C에서 다음 처리 단계까지 유지합니다.
  5. 남은 스트립은 버리세요.

5. 엑소좀 분리

참고: RNA 분리는 제조사 프로토콜(재료 표 참조)에 따라 상업적으로 판매되는 키트를 사용하여 수행됩니다.

  1. 눈물 용액을 얼음 위에 10분간 녹이세요.
  2. 사용 전에 실온에서 15분간 스핀 컬럼을 평형으로 유지하세요.
  3. 기둥의 하단 출구를 제거하여 제공된 폐기물 수집판 위에 올려놓으세요.
  4. 상단 밀봉 매트를 제거하고 중력에 의해 저장 완충제가 컬럼을 통과하도록 하세요.
  5. PBS 250 μL를 추가하고 컬럼을 통과하게 합니다.
  6. 5.5단계를 반복합니다.
  7. 각 컬럼 상단에 110 μL 샘플을 적용하고 샘플이 컬럼에 들어오도록 합니다.
  8. 컬럼을 제공된 샘플 채취판에 옮깁니다.
  9. PBS 100 μL을 추가하여 컬럼을 통과해 샘플 수집판으로 통과시킵니다.
  10. 컬럼을 폐기물 수거 판으로 옮기세요.
  11. 컬럼에 200 μL PBS 4개를 추가하고, 첫 번째 로딩에서 자유 단백질 분획을 제거하기 위해 컬럼에 들어오게 합니다.
  12. 컬럼에 110 μL 샘플을 추가합니다. 열에 들어가는 것을 허용하세요.
  13. 컬럼을 샘플 수집판 위에 올려놓으세요. PBS 100 μL를 추가하여 컬럼을 통과하게 합니다.
  14. 샘플 수집판을 100 x g 에서 30초간 잠시 원심분리합니다. 분리된 엑소좀은 이제 RNA 분리를 위한 준비가 되었습니다.

6. RNA 분리

참고: RNA 분리는 제조사 프로토콜(재료 표 참조)에 따라 상업적으로 판매되는 키트를 사용하여 수행됩니다.

  1. 분리된 엑소좀 200 μL을 RNA 분리에 노출시켰습니다.
  2. 분리된 엑소좀에 60 μL의 용해 버퍼를 추가합니다. 5초 동안 보텍스.
  3. 상온에서 3분간 부양하세요.
  4. 억제제 침전 완충액 20μL을 추가하고, 20초간 소용돌이를 한 뒤 실온에서 3분간 배양합니다.
  5. 실온에서 12,000 x g 에서 3분간 원심분리기를 사용하세요.
  6. 투명하고 무색 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
  7. 이소프로판올 1부량을 추가하세요.
  8. 5초 동안 소용돌이를 돌린 후 용액을 키트에 포함된 미니 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
  9. 실온에서 8000 x g에서 15초간 원심분리기. 흐름을 버리세요.
  10. 700 μL RWT 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
  11. 8000 x g에서 15초간 원심분리기. 플로우스루를 버리세요.
  12. 500 μL RPE 워시 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
  13. 8000 x g에서 15초간 원심분리기. 플로우스루를 버리세요.
  14. 샘플 미니 스핀 컬럼에 80% 에탄올 500 μL를 추가합니다.
  15. 원심분리기에서 8000 x g에서 2분간 가열합니다. 플로우스루 튜브와 수집관을 버리세요.
  16. 미니 스핀 컬럼을 새로운 2mL 수집관에 넣으세요.
  17. 컬럼과 튜브를 18,000 x g 에서 5분간 원심분리합니다. 흐름을 버리고 수집관을 버리세요.
  18. 미니 스핀 컬럼을 새로운 1.5mL 튜브에 넣고, 스핀 컬럼 막 중앙에 RNase 무첨가 물 15 μL을 추가합니다.
  19. 상온에서 3분간 배양하세요.
  20. 18,000 x g 에서 원심분리기를 1분간 사용해 RNA를 희출합니다. RNA는 후속 처리를 위해 준비가 되어 있습니다.
  21. RNA 수율의 품질 관리 및 검증을 위해 나노입자 추적 분석을 수행합니다.

7. cDNA 합성

  1. 제조사 프로토콜 (재료표 참조)에 따라 상업적으로 구할 수 있는 키트를 사용하여 cDNA 합성을 수행하세요.
  2. 마스터 믹스는 표 1 에 따라 1.5mL 마이크로 원심분리관에서 준비합니다.
  3. 피펫팅으로 위아래로 섞어 용액을 섞으세요.
  4. 마스터 믹스 5.1 μL를 0.1 μL PCR 튜브에 피펫 투여합니다.
  5. 마스터 혼합물이 포함된 할당된 튜브에 9.9 μL의 샘플을 추가합니다.
  6. PCR 튜브를 열사이클러에 넣고 표 2에 따라 작동시키세요.
    참고: cDNA는 추가 분석을 위해 준비되었습니다.
구성 요소볼륨/반응
10배 RT 버퍼1.5 μL
100M dNTP 믹스0.15 μL
RNAse 억제제 (200U/μL)0.19 μL
멀티스크라이브 RT 효소 (50U/μl)1 μl
20배 RT 프라이머0.75 μL
RNAse 자유수1.51 μL
샘플9.9 μL
총 부피15 μL

표 1: 분리된 RNA에서 cDNA 합성을 위해 사용되는 PCR 마스터 믹스의 준비.

스텝온도지속 기간
역전사16 °C30분
42 °C30분
멈춰85 °C5분
멈춰4 °C

표 2: cDNA 합성을 위한 열순환 조건.

8. 디지털 비말 PCR

참고: 디지털 액자 PCR(ddPCR)은 제조사 프로토콜에 따라 시상화된 키트를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조).

  1. 표 3에 따라 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 ddPCR용 마스터 믹스를 준비합니다.
  2. 19.8 μL 마스터 믹스를 0.1 μL PCR 튜브에 피펫 삽입. 2.2 μL의 샘플을 추가한 후 혼합물을 10회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
  3. 샘플 혼합물 20 μL를 ddPCR 카트리지의 샘플 레인에 전달합니다.
  4. 카트리지의 오일 레인에 50 μL의 오일을 추가하세요.
  5. 플레이트에 달린 후크를 이용해 가스켓을 카트리지에 부착하세요.
  6. 카트리지를 방울 생성 기계에 넣으세요. 딸깍 소리는 카트리지가 액자 발생 기계에 제대로 삽입되었음을 나타냅니다.
  7. 생성된 모든 방울을 96웰 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 틀이 없는 대조군 우물은 최소 한 개 이상, 음의 대조군과 함께 추가하세요.
  8. 판 실러 기계에서 관통 가능한 호일을 사용해 판을 밀봉합니다(재료 표 참조).
  9. 플레이트를 열사이클러에 넣고 표 4에 따라 작동하세요.
  10. 플레이트를 드롭렛 리더 기계로 옮겨 양수와 음수액을 세는 것입니다.
  11. 복제 수/mL를 복제 번호/20 μL 값을 사용하여 측정합니다.
구성 요소볼륨/반응
프로브용 ddPCR 슈퍼믹스 2개 (dUTP 없음)10 μL
20배 프라이머/프로브1 μL
샘플7 μL
RNAse 자유수2 μL
총 부피20 μL

표 3: ddPCR에 사용되는 PCR 마스터 믹스의 준비 과정.

스텝온도지속 기간램프사이클
효소 활성화95 °C10분각 단계마다 ~2 °C/ 초1
변성94 °C30년대40
어닐링60 °C1분40
효소 비활성화98 °C10분1
멈춰4 °C해당 없음해당 없음

표 4: ddPCR의 열사이클링 조건.

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결과

표준 곡선
각 환자에게서 수집된 정확한 눈물 양을 결정하기 위해 표준 곡선이 만들어졌습니다. 기본적으로, 3 μL에서 25 μL 사이의 다양한 방부제 부피가 쉬머 스트립에 노출되었습니다. 그리고 쉬르머 강의 습지 거리도 관측되었다. 각 시술마다 세 번 반복되어 평균 수치를 계산했습니다. 수집된 눈물의 부피와 쉬르머의 젖은 영역 거리의 표준 곡선이 생성되었으며(그림 2), 이는 수집된 눈물 부피의 기준으로 사용되었습니다.

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그림 2: 시머에서 ...

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토론

안저경 검사, 광학 일관성 단층촬영술, 형광 혈관조영술이 현재 당뇨병성 망막병증 발견을 위한 사용 가능한 기법입니다. 이 세 가지 기법은 종종 함께 사용되어 다양한 망막 및 맥락막 질환을 포괄적으로 평가합니다. 안저경은 당뇨병성 망막병증 평가 중에 일상적으로 시행되는 임상 검사입니다. 이 방법은 훈련된 안과 전문의가 시행하며, 당뇨병성 망막병증 진단의 금본위입니다. 이 방법은 망막의 상세한 평가를 가능하게 하며, 향후 비교를 위한 망막 외관의 기록, 사진 내 관심 영역을 전자적으로 확대할 수 있는 기능, 그리고 이미지를 전자적으로 보관하고 전송할 수 있는 기능을 갖추고 있습니다 4,23. 광학 코히어런스 단층촬영은 빛파를 사용하여 망막과 시신경의 고해상도 단면 이미지를 제공합니다. 형광 혈관조영술은 망막 순환의 이상을 감지하기 위해 특정 염료를 주입하고 조명해야 합...

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공개 사항

저자들은 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 Alcon Research Institute(IF011-2020)와 FOM UMSC Care 박사후 연구 보조금(2021)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨 0.9%아인 메디케어 Sdn BhdGB16165967618
1x 인산염 완충 식염수써모피셔 사이언티브10010-023
응용 생명시스템  TaqMan 마이크로RNA 역전사 키트응용 생명 시스템4366596
ddPCR 슈퍼믹스 프로브용 (dUTP 없음)바이오래드 연구소1863024
ddPCR 96-웰 플레이트바이오래드 연구소12001925
DG8 탄환바이오래드 연구소1864008
DG8 가스켓바이오래드 연구소1863009
프로브용 액적 생성 오일바이오래드 연구소1863005
엑소스핀-96 엑소좀 분리 키트셀 유도 시스템EX07-96
miRNeasy 세럼/혈장 고급 키트치아겐그리고 nbsp; 217204
PX1 PCR 플레이트 실러바이오래드 연구소1814000
QX100 액적 디지털 PCR 시스템바이오래드 연구소QX100
QXDx 액적 발생기 바이오래드 연구소12001049
쉬머 스트립옵티텍SCH-100
T100 열 사이클러바이오래드 연구소1861096
Taqman MicroRNA Assay MTOMED 20 (분석기 ID: 000389)응용 생명 시스템4440887목표 시퀀스: UAGCACACAUAAUĞGUUGUG

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