방법 논문

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

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⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

2024년 9월 6일

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

초록

미세아교세포(Microglia)는 뇌에 상주하는 대식세포(macrophage)로서 뇌의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 그들은 발달 중에 신경 회로를 형성하고, 파편이나 죽은 세포가 있는지 주변 환경을 조사하고, 뇌의 감염 및 손상에 반응하는 등 많은 기능을 수행합니다. 그러나 신경 발달과 시냅스 가소성 및 병태 생리학에서 중요한 역할은 완전히 정의되지 않았으므로 추가 연구의 필요성이 강조됩니다. 이러한 과정에서 미세아교세포의 역할을 보다 포괄적으로 이해하려면 미세아교세포를 분리하고 유전적, 대사적, 기능적으로 특성화해야 합니다. 그러나 성체 마우스, 특히 작은 뇌 구조에서 미세아교세포를 분리하는 것은 전체 뇌세포의 작은 비율을 차지하고 분리된 미세아교세포의 수율이 너무 낮기 때문에 까다롭습니다. 여기에서 CD11b+ 마이크로비즈를 사용한 미세아교세포의 자기 분리를 통해 갓 관류된 성인 쥐 뇌의 시상하부에서 미세아교세포를 분류할 수 있습니다. 현재의 방법을 사용하면 세포 생존력을 유지하면서 단기간에 상대적으로 높은 순도와 수율을 달성할 수 있습니다.

서론

미세아교세포(Microglia)는 전체 신경세포의 5-20%에 해당하며, 난황낭의 적혈구척수성(erythromyeloid progenitor)에서 유래하여 배아일 E9.5 1,2 경에 발달 중인 뇌에 서식하기 시작하는 유일한 신경교세포(glial cell)입니다. 이들은 골수 유래 세포와 독립적으로 천천히 자가 재생을 할 수 있는 능력을 가진 수명이 긴 세포입니다3. 가장 매우 역동적인 세포 중 일부로서, 그들은 상황 및 환경 신호에 반응하여 다양한 표현형을 획득 할 수 있습니다 2,4. 그들의 활동을 조절할 수 있는 신호 중 중추신경계(CNS) 손상, 신경 세포 활동 및 영양분이 가장 강력합니다. 점점 더 많은 연구에서 부상, 신경 퇴행성 질환 및 비만에서 미세아교세포의 중추적인 역할을 입증하고 있습니다 2,5,6. 그럼에도 불구하고 생리학적 과정과 병태생리학 모두에서 미세아교세포의 정확한 역할은 추가 연구가 필요합니다. 따라서 다양한 조건에서 이들의 전사, 대사 및 기능적 특성 분석은 매우 중요하며 현장 연구가 DNA, RNA 및 단백질 국소화 및 정성적 비교, 미세아교세포의 형태학적 특성 분석에 적합하기 때문에 이들을 분리해야 합니다.

미세아교세포 분리를 위해 설명된 다양한 기법이 있으며, 그 중에는 Percoll gradientmethod7, 유세포 분석 세포 분류(FACS)8 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)가 있습니다. 적절한 방법의 선택은 연구의 목표와 다운스트림 응용 분야에 필요한 순도 수준에 따라 다릅니다. 성인 쥐의 뇌, 특히 시상하부와 같은 작은 뇌 구조에서 순수한 미세아교세포를 분리하는 것은 미세아교세포의 수가 제한되어 있기 때문에 어렵습니다. Miltenyi 기술을 사용한 시상하부의 자동 완만 해리를 통해 gentleMACS Octo Dissociator를 사용하여 동시에 최대 8개의 시료를 처리할 수 있는 기능으로 단시간에 상대적으로 높은 미세아교세포 수율을 정제할 수 있습니다.

조직 균질화 후에는 MACS 컬럼 기반 기술과 초자성 나노 크기의 CD11b+ 비드를 사용하여 미세아교세포를 정제합니다. 따라서 모든 샘플은 온전한 CD11b+ 세포를 생성하는 동일한 방식으로 정확하게 처리됩니다. CD11b는 미세아교세포에만 존재하는 것이 아니라 대식세포와 단핵구를 포함한 다른 골수성 계통세포에서도 발현된다는 점은 주목할 만하다9. 이를 제한하기 위해 시상하부 추출 전에 얼음처럼 차가운 식염수로 뇌 관류(프로토콜 단계 2.6 참조)는 대부분의 골수성 세포를 제거하고 잠재적으로 극히 일부만 남기고 상주 대식세포 또는 혈관에 부착된 세포만 남게 합니다. 건강한 정상 상태 CNS의 상주 대식세포와 단핵구는 전체 뇌 면역 세포의 미미한 비율을 구성합니다(각각 ~10% 및 <2%)10,11. 따라서 뇌세포를 CD11b+ beads로 분류하면 미세아교세포와 대식세포를 모두 분리할 수 있지만 대다수는 미세아교세포입니다.

미세아교세포의 최종 수율과 생존력 유지를 통해 생체 외 및 체외 분석을 수행할 수 있으며, 특정 뇌 관심 영역을 분석할 수 있는 이점이 있습니다. 최신 증거에 따르면 미세아교세포 집단은 매우 이질적이며, 지역 특이적 유전자 발현과 형태학적 특성 및 기능을 나타냅니다 2,12,13. 따라서 현재 프로토콜은 지역 특이적 방식으로 성인 미세아교세포를 분리하고 분석하는 것을 목표로 합니다. 실제로, RT-qPCR 및 RNA 염기서열 분석과 같은 방법을 사용하여 성인 시상하부 미세아교세포의 유전적, 전사적, 번역적 프로필을 특성화할 수 있을 뿐만 아니라 체외 기능 분석을 수행할 수 있습니다.

프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 유럽 연합 권장 사항(2013/63/EU)을 엄격히 준수하여 수행되었으며 보르도 대학교(CEEA50)의 지역 윤리 위원회와 프랑스 고등 교육, 연구 및 혁신부(승인된 프로젝트 NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022의 비기술적 요약)의 승인을 받았습니다.

다음 프로토콜은 평균 연령이 2-4개월인 성인 C57BL/6 마우스에서 수행됩니다. 그러나, CNS의 면역 세포 환경이 변경될 수 있고 상주 대식세포 및 단핵구의 비율이 증가할 수 있다는 점을 고려하여(예: 노화 및 신경 퇴행에서) 모든 마우스의 연령 및 조건에서 수행될 수 있습니다.

1. 용액 준비

참고: 다음 부피 및 용액은 Cd11b+ 셀의 분리를 엄격하게 참조합니다.

  1. 샘플 수에 따라 필요한 D-PBS/0.5% 소 혈청 알부민(BSA)의 총 부피를 결정합니다. 칼슘 및 마그네슘 및 BSA 분말이 함유된 시중에서 판매되는 D-PBS를 사용하여 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
  2. 라벨이 부착된 해리 튜브(C-튜브)를 준비하고 성인 뇌 조직 해리 키트에 제공된 1,900μL의 완충 Z를 각각에 채웁니다( 재료 표 참조). 효소를 해동하고 다음 단계에서 필요한 모든 완충액과 함께 얼음 위에 보관합니다.
  3. 관류(1단계)에 필요한 적절한 부피의 PBS(Phosphate-Buffered Saline)( 재료 표 참조)를 얼음 위에 준비하고 놓습니다. 각 동물에 대해 10mL에 초과분 10%를 계산합니다.
  4. RT-qPCR 분석을 위해 RNA를 정제하기 위해 시판되는 키트를 사용하여 시료당 qPCR 완충액(2.5μL의 티오글리세롤 + 250μL의 용해 완충액)을 준비합니다( 재료 표 참조).
  5. 단백질 정량을 위해 포유류 추출 완충액에 인산가수분해효소 억제제 칵테일과 프로테아제 억제제 칵테일을 1:100으로 희석하여 용해 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조).
  6. 활성산소종(ROS) 검출 및 식세포작용 분석을 위해 시판되는 10x HBSS에서 1x HBSS를 준비합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 1x HBSS에 0.2% BSA를 추가하여 FACS 버퍼를 준비합니다.

2. 뇌 제거

  1. 자일라진 20mg/kg의 투여량으로 동물을 진정시킨다. 그런 다음 펜토바르비탈 400mg/kg을 과다 투여한 쥐를 안락사시키고 해부 트레이에 앙와위 상태로 놓습니다.
    참고: 동물을 안락사시키기 위한 다른 마취제 조합도 효과가 있을 수 있습니다.
  2. 10mL 주사기에 10mL의 얼음처럼 차가운 1x PBS를 채우고 나비 21G 바늘에 부착합니다.
  3. 쥐가 완전히 마취되면(반응이 없는지 확인하기 위해 발을 꼬집어 확인) 호흡이 멈추고 심장이 세동 상태가 되면 집게로 피부를 덮고 마지막 갈비뼈와 흉골 수준에서 가위로 흉강을 엽니다.
  4. 가위를 사용하여 흉곽 측면을 따라 흉곽 상단을 향해 깊게 절단하여 심장을 노출시킵니다.
  5. 좌심실의 원위부에 21G 바늘을 삽입합니다(바늘의 약 1/3이 심실 내부에 있는지 확인). 즉시 가위를 사용하여 우심방을 절개합니다.
  6. 얼음처럼 차가운 1x PBS 10mL를 주입하여 순환하는 면역 세포에서 뇌를 청소합니다.
    참고: 뇌가 깨끗하고 관류가 잘 되는지 육안으로 확인하십시오.
  7. 쥐 머리를 자르고 조심스럽게 뇌를 추출한 다음 얼음을 채우고 알루미늄 호일로 덮은 페트리 접시에 놓습니다.
    참고: 페트리 접시와 호일은 뇌 조각을 보는 데 도움이 됩니다. 신진대사 활동을 제한하기 위해 뇌 조각을 자르는 동안 시원한 환경을 유지하는 것이 좋습니다.
  8. 집게를 사용하여 시상 하부를 분리하고 면도날로 작은 조각으로 자릅니다.
    1. 시상하부를 식별하고 해부하려면 뇌를 거꾸로 놓아 피질이 복부에 있고 시상하부가 상면에 등쪽으로 보이도록 합니다. 제3뇌실 양쪽의 뇌 바닥에 위치한 시상하부(hypothalamus)를 구부러진 집게를 사용하여 분리합니다. 성체 C57BL/6 마우스의 시상하부의 평균 체중은 15mg입니다.
      알림: 뇌 조각은 가능한 한 작아야 합니다(<0.5mm). 작은 조각으로 자르는 것은 더 나은 해리와 더 높은 세포 수율을 허용하기 때문에 중요한 단계입니다.
  9. 이전에 1,900μL의 Buffer Z로 채워진 해리 튜브(C-Tube)에서 시상하부 조각을 수집합니다(단계 1.2).
    참고: 분석을 수행하기에 충분한 미세아교세포의 양호한 수율을 얻으려면 튜브당 최소 2개(단백질 정량화용) 또는 3개(qPCR 및 RNAseq용)의 시상하부(hypothalami)를 풀링합니다.

3. 조직 해리

알림: 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다. 어떤 단계에서도 셀 현탁액을 소용돌이치지 마십시오. 1,000 μL 피펫과 함께 조심스럽게 섞으십시오.

  1. 표 1에 따라 효소 믹스 2를 제조합니다(모든 튜브의 총 부피 계산 + 초과량 10%). 각 C-튜브에 믹스 1에 포함된 효소 50μL(표 1 참조)와 효소 믹스 2 30μL를 추가합니다. 모든 효소는 성인 뇌 조직 해리 키트에 제공됩니다(재료 표 참조).
  2. C-튜브를 닫고 제조업체의 지침에 따라 가열 브래킷이 있는 분리기에 거꾸로 놓습니다. 37C_ABDK_02 프로그램을 실행합니다.
  3. 15mL 스냅 튜브( 재료 표 참조)를 준비하고 그 위에 70μm 스트레이너를 얹습니다. D-PBS 2mL로 여과기를 적십니다.
  4. 해리/분해 프로그램이 완료되면 C-Tube를 스트레이너에 비우고 200μL 팁으로 긁어 세포 여과를 증가시키고 필터에 대한 조직 균질화의 부착을 줄여 세포 손실을 줄입니다.
  5. 2 x 5mL의 D-PBS로 튜브를 세척하고 세척액을 여과기에 비우고 세척 사이에 200μL 팁으로 긁습니다.
  6. 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 완전히 흡입합니다. 표 1에 따라 적절한 양의 차가운 D-PBS로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다.
  7. 즉시 450μL의 밀도 구배 시약(Debris Removal Solution, 재료 표 참조)과 조심스럽게 혼합하고 2mL의 차가운 D-PBS( 표 1 참조)를 매우 부드럽게 오버레이합니다.
    참고: 다양한 밀도 구배 층을 얻으려면 D-PBS를 1mL 피펫으로 한 번에 1mL씩 "교란"을 최소화하면서 한 방울 한 방울 부드럽게 오버레이해야 합니다.
  8. 3,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 저속 가속과 저속 브레이크로 원심분리기합니다(9가 가득 찬 경우 5 사용).
  9. 세 단계가 형성됩니다. 두 개의 상단 단계를 완전히 흡인하고 폐기합니다. 세 번째 하단 단계를 흡인하지 않도록 하십시오.
  10. 1800μL의 차가운 D-PBS를 채우고 튜브를 부드럽게 3번 뒤집습니다.
  11. 1,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 최대 가속 및 완전 제동으로 원심분리하고 상층액을 완전히 흡입합니다. 2mL의 D-PBS/BSA 를 위아래로 천천히 피펫팅하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다.

4. CD11b+ 세포의 자기 절연

  1. 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 완전히 흡입합니다. 세포 펠릿을 90μL의 완충액 D-PBS/BSA(D-PBS/BSA)에 조심스럽게 재현탁시킵니다.
  2. CD11b-마이크로비드 혼합물 10μL를 넣고 피펫과 잘 섞습니다.
  3. 얼음이 아닌 냉장고에서 2-8 ° C에서 15 분 동안 배양하십시오. 1mL의 D-PBS/BSA를 추가하고 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 추가하여 세포를 세척합니다. 상층액을 완전히 흡인하십시오. 500 μL의 D-PBS/BSA에 조심스럽게 재현탁하십시오.
  4. 화면의 지시에 따라 분리기에서 POSSEL2 프로그램을 시작합니다. 작은 기둥( 재료 표 참조)을 자기장에 놓습니다.
    참고: 예상되는 평균 셀 수에 따라 자기 셀 정렬을 위해 작거나 큰 열을 선택할 수 있습니다. 작은 열은 최대 1 × 107 개의 레이블이 지정된 셀과 최대 1 × 108개의 큰 열을 수용할 수 있습니다. 시상하부(hypothalamus)와 같은 작은 구조에서 세포를 분리할 때는 작은 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다. 큰 컬럼을 사용할 때 시약의 부피가 다릅니다(제조업체 지침 참조).
  5. 컬럼( 재료 표 참조)을 500μL의 D-PBS/BSA로 적십니다. 추가 분석을 위해 세포의 음의 분획(CD11b-)이 필요한 경우 컬럼 아래에 수집 플레이트를 놓은 다음 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다.
  6. 컬럼에 한 번에 500μL의 D-PBS/BSA를 추가하여 3단계 세척을 수행하고, 매번 버퍼가 컬럼을 통과할 때까지 기다립니다.
    참고: 컬럼의 윗부분이 마르는 것을 방지하는 것이 중요하므로 모든 버퍼가 통과할 때까지 기다리지 않는 것이 좋습니다.
  7. 수집 플레이트의 웰에서 CD11b- 분획의 총 유출물을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.
  8. 분리기에서 컬럼을 제거하고 5mL 튜브에 놓고 1mL의 D-PBS/BSA를 컬럼에 피펫팅합니다.
  9. 컬럼과 함께 제공된 플런저를 단단히 적용하여 자기적으로 라벨링된 세포 분획을 즉시 씻어냅니다.
  10. 결국, 혈량계 또는 다른 방법으로 CD11b+ 세포를 계수하십시오. 시상하부당 ~15,000개의 세포를 예상합니다.
  11. 셀 현탁액을 300×g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.

5. 분석

  1. RT-qPCR 분석의 경우 세포 펠릿을 qPCR 완충액으로 재현탁하고(준비는 1.3단계 참조) mRNA 추출까지 튜브를 -80°C에서 보관합니다. 총 RNA를 분리한 다음 MIQE 지침14에 따라 처리 및 분석합니다. 마지막으로 cDNA를 합성하고 RT-PCR 소자를 이용하여 qPCR을 수행한다. 사용되는 모든 시중에서 판매되는 키트에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  2. 단백질 정량을 위해 세포 펠릿을 D-PBS(BSA 없음)로 2배 이상 세척하여 BSA를 제거합니다. 그런 다음 2개의 시상하부에서 세포 펠릿을 20μL의 용해 완충액으로 재현탁시킵니다. 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 정량을 진행합니다( 재료 표 참조).
    참고: 제조업체의 지침15 에 따라 세린/트레오닌 키나아제 활성 분석을 수행하기 위해 단백질을 정량화했습니다.
  3. 미세아교세포에서 활성산소종(ROS)을 검출하려면 펠릿을 1x HBSS에 현탁시킵니다. 유세포분석 분석을 위한 키트의 제조업체 프로토콜에 따라 세포를 처리합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 처리된 세포를 200μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고(준비의 경우 1.5단계 참조) FACS를 수행하여 산화 스트레스 세포를 검출합니다.
  4. phagocytosis assay를 위해 D-PBS/BSA에서 분류된 세포를 형광 라텍스 비드( 재료 표 참조)로 30분 동안 배양합니다. 셀당 평균 4개의 비드를 갖도록 비드 수를 조정합니다. 그런 다음 4°C에서 7분 동안 300× g 에서 원심분리하고 200μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 FACS(λex 575 nm; λem 610 nm)로 형광 방출을 판독합니다.

결과

최종 수율의 평가는 순도 수준과 분리된 세포의 양에 따라 달라지며 RT-qPCR, 세포 계수 및 단백질 정량화에 의해 결정될 수 있습니다. 시상하부에서 분리된 자성 세포의 순도는 RT-qPCR을 사용한 CD11b, C1qa, Gad1 및 GFAP의 유전자 발현 분석을 통해 확인되었습니다(그림 1). CD11b 및 C1qa는 주로 정상 상태의 미세아교세포에 의해 발현되며, CNS16 과 Gad1 및 GFAP는 각각 신경 세포 및 성상세포 마커 역할을 합니다. 한 시상하부에서 채취한 총 cDNA는 55 내지 98 ng 범위였다. 주목할 만한 점은 양성 분획만이 CD11b 및 C1qa 발현을 나타냈으며, 이는 음성 분획에서 미세아교세포의 잠재적 손실이 없음을 나타냅니다. 프라이머는 표 2에 나와 있습니다.

또한, 신경 세포 및 성상 세포 마커의 사소한 수준은 상주 대식 세포와 단핵구가 건강한 뇌의 총 면역 세포 환경의 10 %만을 구성하기 때문에 고립 된 세포의 대다수가 미세 아교세포임을 보장합니다10,11. 이러한 결과는 자기 선택의 효능을 입증하고 RT-qPCR을 적용하여 신선하게 분류된 시상하부 미세아교세포에서 모든 관심 유전자의 발현 수준을 평가할 수 있는 길을 열어줍니다. 마찬가지로, 시상하부 분류 미세아교세포에 대해 RNAseq 분석을 수행하여 전사체에 대한 포괄적인 보기를 얻을 수 있습니다.

분리된 세포의 양은 세포 계수에 의해 결정되었으며 시상하부당 ~15,000개의 세포인 것으로 나타났습니다(프로토콜 단계 4.10에서 언급됨). 또한 분류된 미세아교세포의 단백질 농도를 정량화하여 두 개의 풀링된 시상하부에서 분리한 CD11b+ 세포의 평균 농도가 0.5μg/μL임을 나타냈습니다(그림 2). 이 지식을 통해 최소 단백질 역치에 따라 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 또한 더 많은 시상하부를 합치면 더 높은 농도를 얻을 수 있어 잠재적인 분석 범위를 확장할 수 있습니다. 시상하부 미세아교세포에서 추출된 단백질은 AlphaLISA 면역분석 및 키나아제 활성 분석을 포함한 다양한 기술을 용이하게 합니다.

또한, 설명된 프로토콜을 통해 연구자들은 여러 생체 외 분석을 수행할 수 있으며, 이를 통해 생리학적 및 병리학적 맥락 모두에서 시상하부에서 미세아교세포의 활동과 그들의 역할을 탐색할 수 있습니다. ROS 생성의 정량화는 미세아교세포 면역 반응의 중요한 측면을 나타냅니다17. 따라서 분리 후 미세아교세포는 산화 시 증가된 형광 신호를 나타냄으로써 살아있는 세포에서 ROS를 검출할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 시약으로 처리할 수 있습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 3개의 풀링된 시상하부에서 자기적으로 분리된 미세아교세포는 FACS에 의한 ROS를 검출하기에 충분하지만, 우리의 결과는 우리가 분석한 조건 중에서 세포 ROS 생산의 변동성이 상당히 높다는 것을 보여줍니다. 주목할 만한 점은 위에서 언급한 상용 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 DNA 결합 시 형광이 증가하는 세포 불투과성 죽은 세포 염색 덕분에 분류된 Cd11b+ 세포의 생존력도 평가할 수 있었다는 것입니다. 특히, 우리의 데이터는 세포의 99%가 살아 있음을 보여줍니다(그림 3B). 게이팅 전략은 살아있는 세포와 죽은 세포, 그리고 형광 특성에 따라 산화적으로 스트레스를 받은 세포와 스트레스가 가해지지 않은 세포를 구별하는 데 사용되었습니다.

미세아교세포 활동의 또 다른 주요 특징은 면역 감시, 조직 복구 및 중추 신경계의 전반적인 항상성에 중요한 역할을 하는 역동적이고 엄격하게 조절되는 과정인 식세포작용(phagocytosis)입니다18. 놀랍게도, 자기 결합 비드로 분류된 Cd11b+ 세포는 24시간 동안 배양한 다음 다른 시점에서 형광 라텍스 마이크로비드로 배양하여 FACS 또는 형광 현미경으로 다양한 조건에서 식세포 활성의 변화를 평가할 수 있습니다. 또한 신선하게 분류된 미세아교세포는 형광 비드 또는 튜브 내에서 직접 모든 유형의 pHrodo 결합 입자(예: 시냅토솜)에 노출될 수 있으며, FACS 분석을 통해 식세포작용을 평가할 수 있습니다.

특히, 우리는 분류된 세포 현탁액, 두 개의 풀링된 시상하부에서 분리된 미세아교세포 또는 형광 라텍스 비드가 있는 전체 뇌가 포함된 튜브에서 직접 배양했습니다. 하나 이상의 형광 bead를 phagocyted 한 Microglia는 phagocytic microglia가 향상된 형광을 나타내기 때문에 유세포 분석을 통해 비 phagocytic cell과 구별 할 수 있습니다. 비드로 배양하지 않은 음성 대조군은 게이팅에 사용되었습니다. 두 실험 조건(차우를 먹인 쥐와 고지방 식단(HFD))에서 우리는 매우 낮은 비율의 식세포 미세아교세포를 관찰했습니다(그림 4A). 그러나 이 결과는 이 방법의 효능을 보여주기 위해 여기에 표시되었으며, 놀랍게도 1개의 비드, 2개의 비드, 3개의 비드 등을 식세포화한 세포를 구별할 수도 있습니다(그림 4B). 마지막으로, 모든 오믹스 접근법은 분리된 시상하부 미세아교세포에 적용될 수 있습니다. 이러한 분석을 수행하기에 충분한 세포를 갖기 위해 3개의 시상하부를 통합하는 것이 좋습니다.

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그림 1: RT-qPCR에 의한 CD11b+ 세포 순도 평가. 인테그린 CD11b의 mRNA 발현의 mRNA 발현의 정량화, 보체 C1q 하위 구성 요소 소단위 A C1q, 글루탐산 탈카르복실라제 Gad1 및 신경교세포 섬유산 단백질 GFAP는 하우스키핑 유전자 Eef1a1 및 Sdha의 mRNA 수준에서 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 세포 분류 후 시상하부 세포의 단백질 정량화. CD11b+ 및 CD11b- 세포의 단백질 농도 정량화. CD11b+ 및 CD11b- 세포는 모두 20μL의 용해 완충액에서 용해되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: microglial live cells에서 ROS 검출. 정렬된 Cd11b+ 세포 집단에서 (A) 산화 스트레스 세포 및 (B) 살아있는 세포의 정량화(상대 FACS 등고선 플롯 포함). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 미세아교세포 식세포 활성의 정량화. (A) 상대적인 FACS 윤곽 플롯을 사용하여 두 개의 시상 하부 또는 한 개의 뇌에서 분류된 Cd11b+ 세포의 식세포 세포의 정량화. (B) 상대 FACS 윤곽 플롯으로 식세포화된 비드 수에 따른 식세포 세포의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

효소 믹스 2
효소 A버퍼 Y효소 P
10 마이크로리터20 마이크로리터50 마이크로리터
D-PBS (디-PBS)이물질 제거 솔루션오버레이 D-PBS
15-100 mg 구조1000 마이크로리터450 마이크로리터2mL

표 1: 해리 혼합물(부피는 단일 시료를 나타냄) 및 그래디언트 오버레이의 준비.

유전자단백질전달후진
잇감인테그린 알파 M(CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
스다숙시네이트 탈수소효소 복합체 플라보단백질 서브유닛 ACCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qa 님보체 성분 1, q 하위 성분, 알파 폴리펩티드CGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
갓1글루타메이트 탈카르복실라아제 1GACCAATCTCTGTGACTCGCT태그CTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
지팍신경교세포(glial fibrillary acidic protein)AGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

표 2: RT-qPCR 프라이머 염기서열.

유세포 분석 세포 분류(FACS)자기 활성화 세포 분류(MACS)
형광 태그가 부착된 생화학 항체항체에 접합된 자성 비드
세포 표면 마커를 넘어서는 분화세포 표면 마커에 의해서만 분화
상당한 초기 수율적당한 초기 수율
MACS보다 느려서 많은 시료를 동시에 처리할 수 있습니다.FACS보다 빠름으로 많은 시료를 동시에 처리할 수 있습니다.
MACS보다 덜 부드럽습니다.FACS보다 부드러움

표 3: FACS 및 MACS 특성 및 제한 사항 표현

토론

현재 프로토콜은 Magnetic-Activated Cell Sorting을 통해 갓 관류된 성인 마우스 뇌에서 시상하부 미세아교세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 위에 제시된 결과는 분리된 세포의 순도와 생존력뿐만 아니라 식세포 활성 및 ROS 생산 정량화를 통해 생체 외 미세아교세포를 기능적으로 특성화하는 이 방법의 효능을 확인합니다. 특정 세포 집단을 분리하기 위한 고전적인 방법은 미세아교세포에도 사용할 수 있습니다. 밀도 그래디언트 분획은 크기 및/또는 밀도에 따라 서로 다른 세포와 그 입자를 분리하는 잘 알려진 방법입니다. 이 기술은 원발성 미세아교세포의 분리 및 배양에 적용할 수 있습니다. 그러나 성인 미세아교세포의 정제는 형광 활성화 또는 면역자기 세포 분류를 사용하여 분리된 뇌 세포를 추가로 분류해야 합니다.

특히, FACS는 형광 표지 생화학 항체에 의존하여 세포를 라벨링하고 크기 및 대사 상태와 같은 표면 마커를 넘어서는 수많은 변수에 따라 세포를 구별합니다. 그럼에도 불구하고 세포 정제 과정은 더 느리고 부드럽지 않을 수 있으며, 이로 인해 죽은 세포의 수가 증가하고 상당한 초기 수율이 필요할 수 있습니다. 따라서 시상하부 미세아교세포의 수가 적다는 것은 이미 제한 요인입니다. MACS는 특정 세포 에피토프에 대한 특정 항체에 접합된 마그네틱 비드를 사용하며 미세아교세포 역학에 대한 영역별 연구를 용이하게 하는 적당한 초기 수율로 작동할 수 있습니다. 마이크로비즈의 강한 자기장으로 인해 최소한의 라벨링이 필요합니다. 따라서 FACS보다 부드러워 셀 무결성 유지를 보장합니다. 또한 MACS는 많은 샘플을 동시에 처리해야 하는 경우 FACS보다 빠릅니다. 이는 작은 초기 수율에서도 나올 수 있는 높은 세포 생존율을 유지하는 뚜렷한 이점을 제공합니다(표 3).

MACS 기술을 통해 효과적으로 해결할 수 있는 시상하부에서 미세아교세포를 분리하는 데 있어 주요 과제에는 충분한 최종 수율을 달성하고 세포 무결성을 보장하는 것이 포함됩니다. 필요한 세포 양은 선택한 분리 후 분석의 특성에 따라 다릅니다. 예를 들어, 체외 에서 미세아교세포의 기능적 역할에 대한 연구에는 상당한 수의 세포가 필요합니다. 이는 분리 과정을 진행하기 전에 동일한 조건을 가진 별개의 마우스에서 동일한 뇌 영역의 초기 풀의 중요성을 강조합니다. 반대로, 고정밀 단일 세포 시퀀싱과 같은 기술은 큰 세포 집단을 필요로 하지 않으며, 차례로 여러 마우스를 풀링할 필요가 없습니다.

세포 수율을 극대화하려면 프로토콜의 특정 단계를 준수하는 것이 중요합니다. 효과적인 해리는 시상하부를 작은 조각으로 절단한 다음 공정 중에 튜브 바닥의 완충액에서 유지되도록 함으로써 시작됩니다. 그런 다음, 기계적 해리와 세포외 기질의 효소적 분해의 조합은 상당히 높은 세포 수율을 보장합니다. 그러나, 37°C에서 수행된 효소 해리(enzymatic dissociation)는 전사 및 번역 변화를 유도할 수 있기 때문에 결과를 해석하는 데 매우 신중해야 한다19. 기술적으로 매개된 변경을 방지하기 위해, 전사 및 번역 억제제를 사용한 적절한 대조군을 사용할 수 있다19. 또한 냉장실과 같은 더 낮은 온도에서 효소 해리를 진행할 수 있지만(효과가 감소할 수 있음) 해리는 효소보다 기계적 효과에 더 의존할 수 있습니다. 해리 후, 세포 현탁액을 사전 세척하여 스트레이너로 옮기고, 세포 손실을 방지하기 위해 튜브를 두 번 더 철저히 세척합니다. 또 다른 중요한 단계는 밀도 구배 원심분리와 다양한 층의 형성에 의해 달성된 파편과 미엘린의 제거입니다. 따라서 상당한 최종 수율을 달성하려면 시상하부 조직과 세포 현탁액을 모두 세심하게 처리해야 하며, 신진대사를 늦추고 생체 내 표현형을 유지하기 위해 항상 얼음 상태를 유지해야 합니다.

또한, 미세아교세포의 최고 순도를 달성하고 미세아교세포 표현형을 유지하기 위해 매우 주의해야 할 사항이 있습니다. 초기에 4°C에서 수행되는 관류는 모든 순환 CD11b+ 세포를 제거하는 데 매우 중요하며, 이는 가장 높은 잠재적 미세아교세포 순도를 보장합니다. 그러나 혈액-뇌 장벽 파괴의 경우, 순환하는 면역 세포의 비율이 높을수록 뇌에 서식할 수 있어 미세아교세포 자체의 연구를 방해할 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위한 대안적인 접근법은 CD45 항체에 접합된 마이크로비즈를 사용하는 2차 자기 분리를 구현하는 것입니다. CD45는 대식세포(20 )에서 높은 발현을 나타내는 세포 표면 마커이며, 이 라운드의 후속 플로우스루는 미세아교세포만을 포함합니다. 두 차례의 자기 절연을 사용하는 이 전략은 공정의 특수성을 향상시킵니다. 그럼에도 불구하고 추가 시간이 소요되며, 이는 세포 무결성 및/또는 미세아교세포 표현형을 방해할 수 있는 잠재적인 위험을 내포하고 있습니다. 따라서 세포의 기능적 특성과 온전함을 보존하기 위한 중요한 요인은 뇌 조직을 신속하게 분리하여 해리 과정이 시작될 때까지 얼음 위에 두는 것입니다. 요약하면, 이 분석적 접근 방식은 미세아교세포의 기능과 행동에 대한 이해를 향상시켜 시상하부에서의 동적 반응에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

AN은 IUF(Institut Universitaire de France), 보르도 대학교(University of Bordeaux), FRC(French Foundation for Brain Research), GLN(Lipid-Nutrition Group) 및 National Research Agency(ANR, PRC 2023-MicroNRJ)의 지원을 받습니다. CA는 FRM-ARF201809006962(Fondation pour la Recherche Médicale)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759(FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY)에 따라 유럽 연합의 Horizon Europe Research and Innovation Program에서 자금을 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
성인 뇌 해리 키트Miltenyi130-107-677키트에는 완충액 Z, 완충액 Y, 효소 A 및 P, 파편 제거 용액, 완충액 A(효소 A를 용해하기 위해)가 포함되어 있습니다.
알부민 소 FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, 인간 및 마우스 - 소형Miltenyi130-093-636
CellROX 녹색 유세포 분석 키트InvitrogenC10492
원심분리기 튜브, 스냅팝 뚜껑 15 mLCellTreat978449
DPBS, 칼슘, 마그네슘, 포도당, 피루브산Gibco14287-072
gentleMACS C 튜브Miltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)Thermofisher78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드없음 Thermofisher14065056
라텍스 비즈, 카르복실레이트 수정 폴리스티렌, 형광 레드Sigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR 그린 I 마스터로슈 4707516001이 시약은 PCR을 수행하는 데 사용되었습니다. 
MACS SmartStrainers(70 &마이크로; m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA 단백질 분석 키트Thermofisher23235
M-PER 포유류 추출 버퍼Thermofisher78503
MS 컬럼Miltenyi130-042-201프로토콜에서 작은 컬럼으로 언급됩니다. 
MultiMACS Cell24 분리기 플러스Miltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177이 키트는 cDNA를 합성하는 데 사용되었습니다.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011이 키트에는 1-Thioglycerol 및 BL buffer(프로토콜에서 lysis buffer라고 함)가 포함되어 있으며 전체 RNA를 분리하는 데 사용되었습니다.
Vacutainer 안전 록 21GBecton 디킨슨367282

참고문헌

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Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting
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