PyOKR: Optokinetic Reflex Tracking Ability를 정량화하기 위한 반자동 방법

요약

여기에서는 2차원 이미지 움직임에 대한 시각적 반응으로 인한 안구 움직임을 직접 측정하는 반자동 정량 분석 방법인 PyOKR에 대해 설명합니다. Python 기반 사용자 인터페이스 및 분석 알고리즘을 사용하면 이전 방법보다 더 높은 처리량과 더 정확한 정량 측정이 가능합니다.

초록

시각적 자극에 대한 행동 반응에 대한 연구는 시각 시스템 기능을 이해하는 데 중요한 구성 요소입니다. 한 가지 주목할 만한 반응은 망막의 이미지 안정화에 필요한 고도로 보존된 타고난 행동인 광동태 반사(OKR)입니다. OKR은 이미지 추적 능력에 대한 강력한 판독 기능을 제공하며 다양한 유전적 배경을 가진 동물의 시각 시스템 회로 및 기능을 이해하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. OKR은 눈이 시각 평면의 가장자리로 자극을 따라가는 느린 추적 단계와 안와에서 눈의 위치를 재설정하는 보상적 빠른 위상 saccade의 두 단계로 구성됩니다. 이전의 게인 정량화 추적 방법은 신뢰할 수 있지만 노동 집약적이며 주관적이거나 임의로 파생될 수 있습니다. 시선 추적 능력의 보다 빠르고 재현 가능한 정량화를 얻기 위해 우리는 모든 유형의 비디오 안구 촬영 장비에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 모든 방향 자극에 대한 반응으로 2차원 시선 추적 동작을 정량화할 수 있는 새로운 반자동 분석 프로그램인 PyOKR을 개발했습니다. 이 방법은 자동 필터링, 느린 추적 단계 선택, 수직 및 수평 눈 벡터의 모델링, 자극 속도에 상대적인 안구 움직임 이득의 정량화, 결과 데이터를 통계 및 그래픽 비교를 위해 사용 가능한 스프레드시트로 구성합니다. PyPI 가져오기를 통해 쉽게 액세스할 수 있는 이 정량적이고 간소화된 분석 파이프라인은 OKR 응답을 빠르고 직접 측정하여 시각적 행동 응답에 대한 연구를 용이하게 합니다.

서론

이미지 안정화는 자기 동작 중에 발생하는 전체 광학 흐름을 보상하기 위해 정확한 안구 운동 반응에 의존합니다. 이 안정화는 주로 두 가지 운동 반응, 즉 광동태 반사(OKR)와 전정-안구 반사(VOR)^1,2,3에 의해 주도됩니다. 망막을 가로지르는 느린 글로벌 모션은 OKR을 유도하여 해당 방향으로 반사적인 눈 회전을 유도하여 이미지를 안정화합니다 ^1,2. 느린 단계(slow phase)로 알려진 이 움직임은 빠른 단계(fast phase)로 알려진 보상 사케이드(compensatory saccades)에 의해 중단되며, 이 단계에서 눈은 반대 방향으로 빠르게 재설정되어 새로운 느린 단계를 허용합니다. 여기서는 이러한 빠른 단계의 saccades를 ETM(시선 추적 움직임)으로 정의합니다. VOR은 머리^{의 움직임3}을 보상하기 위해 안구의 움직임을 유도하기 위해 전정계에 의존하는 반면, OKR은 ON의 발화와 중뇌의 AOS(Accessory Optic System)에 대한 후속 신호에 의해 망막에서 시작된다(^4,5). OKR은 망막 회로에 직접적으로 의존하기 때문에 연구 및 임상 환경 모두에서 시각적 추적 능력을 결정하는 데 자주 사용되어 왔습니다 ^6,7.

OKR은 기초^{시각 능력}2,6,8, DSGC 발달 9,10,11,12, 안구 운동 반응¹³ 및 유전적 배경 간의 생리적 차이7를 평가하기 위한 도구로 광범위하게 연구되어 왔다. OKR은 움직이는 자극(¹⁴)이 제시된 머리가 고정된 동물에서 평가된다. 눈 운동 반응은 일반적으로 다양한 비디오 도구를 사용하여 캡처되며, 시선 추적 동작은 수평 및 수직 방향9에서 OKR 파형으로 캡처^됩니다. 추적 능력을 정량화하기 위해 두 가지 주요 메트릭, 즉 추적 게인(자극의 속도에 대한 눈의 속도)과 ETM 주파수(주어진 시간 프레임 동안 빠른 위상 saccades의 수)가 설명되었습니다. 이득 계산은 추적 능력을 추정하기 위해 눈의 각속도를 직접 측정하는 데 역사적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 계산은 노동 집약적이며 비디오 안구 촬영 수집 방법 및 후속 정량화를 기반으로 임의로 파생될 수 있습니다. 보다 신속한 OKR 평가를 위해 ETM 빈도 계수가 추적 시력을 측정하는 대체 방법으로 사용되었다⁷. 이는 추적 능력에 대한 상당히 정확한 추정치를 제공하지만, 이 방법은 간접 메트릭에 의존하여 느린 위상 응답을 정량화하고 많은 편향을 도입합니다. 여기에는 saccade determination의 관찰자 편향, 설정된 epoch 전반에 걸쳐 시간적으로 일관된 saccadic 응답에 대한 의존, 느린 위상 응답의 규모를 평가할 수 없는 무능력이 포함됩니다.

현재 OKR 평가 접근 방식으로 이러한 문제를 해결하고 OKR 매개변수의 높은 처리량의 심층 정량화를 가능하게 하기 위해 OKR 파형을 정량화하는 새로운 분석 방법을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 "PyOKR"이라는 액세스 가능한 Python 기반 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 OKR 느린 위상 응답의 모델링 및 정량화를 더 깊이 있고 더 많은 매개변수화로 연구할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 무수한 시각적 자극에 대한 반응에 대한 접근 가능하고 재현 가능한 정량적 평가와 수평 및 수직 움직임에 대한 2차원 시각적 추적을 제공합니다.

프로토콜

존스 홉킨스 의과대학(JHUSOM)에서 수행된 모든 동물 실험은 JHUSOM의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. UCSF(University of California, San Francisco)에서 수행된 모든 실험은 UCSF Institutional Animal Care and Use Program에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 행동 데이터 수집

1. 파동 데이터(즉, 구형 좌표에서 눈의 시선 각도의 시계열)를 생성하기 위해 선택한 비디오 안구 조영 방법을 사용하여 OKR 눈의 움직임을 기록합니다.
   참고: JHUSOM에서 수집된 대표 데이터는^{앞서 설명한} 바와 같이 헤드포스트 이식 수술 및 비디오 안구 조영술을 사용하여 획득^{되었습니다(}그림 1). UCSF에서 수집된 대표 데이터는 이전¹⁰에서 설명한 바와 같이 헤드포스트 이식 수술 및 비디오 안구 조영술 방법을 통해 획득되었습니다(그림 7).
   1. 자극 및 기록 매개변수: 기록 프레임 속도, 자극 속도 및 방향, 자극 에포크 사이와 이후의 시간 길이를 기록하십시오. 정현파 자극의 경우 자극파의 진폭과 주파수도 주목하십시오.
2. 수집된 웨이브 데이터를 . 수평 및 수직(방위각 및 고도) 파동 데이터를 포함하는 CSV 파일입니다.
   1. 웨이브 데이터를 탭으로 구분된 로 구성합니다. 수평 데이터(epxWave)와 수직 데이터(epyWave)를 포함하는 두 개의 열이 있는 CSV 파일입니다.

2. 분석 소프트웨어 설치

1. Python을 다운로드하여 설치합니다.
   1. 그래프 감시를 위해 Anaconda를 통해 Spyder를 설치하십시오.
   2. Spyder에서 그래프가 올바르게 작동하도록 하려면 도구 > 기본 설정 > Ipython 콘솔 > 그래픽 > 그래픽 백엔드로 이동합니다. 인라인을 자동으로 설정합니다.
2. Python을 사용하여 새로운 Anaconda 환경을 만듭니다.
3. pip install PyOKR을 사용하여 PyPi를 통해 PyOKR을 설치하여 패키지 종속성(추가 코딩 파일 1 및 추가 코딩 파일 2)과 함께 최신 버전을 설치합니다.
4. Windows 컴퓨터를 사용하는 경우 PyOKR import OKR_win에서 o 로 실행한 다음 o.run()을 실행합니다.
5. Mac 컴퓨터를 사용하는 경우 PyOKR import OKR_osx에서 o 로 실행한 다음 o.run()으로 실행합니다.

3. 파동 데이터 분석

1. 분석 및 파일 가져오기 초기화
   1. .py 스크립트에서 o.run() 을 실행하여 사용자 인터페이스를 엽니다.
   2. 파일에서 열기 함수 또는 Ctrl+O [iOS 명령] 명령을 사용하여 사용자가 원하는 웨이브 파일을 선택할 수 있는 브라우저를 엽니다.
   3. 파일에서 폴더 내보내기 버튼 또는 Ctrl+E 명령을 사용하여 최종 해석을 내보낼 출력 폴더를 선택할 수 있는 폴더 브라우저를 엽니다.
   4. 출력 파일 아래에 최종 해석 파일 이름을 권장 형식(예: AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis)으로 입력합니다.
   5. 파일에서 주제 설정 명령을 사용하거나 Ctrl+S 명령을 사용하여 개별 동물에 대한 데이터셋을 초기화하여 개별 동물에 대한 프로그램을 설정합니다.
2. 웨이브 파일 매개변수의 정의
   1. 자극 파라미터 설정을 시작하려면, 4개의 기본 방향 중 하나를 선택하여 Select stimulus direction (자극 방향 선택 )에서 방향성을 정의하십시오. 정현파 자극의 경우 ( Horizontal) 또는 (Vertical) 이 포함된 것을 선택하고 기본 방향이 정현파의 초기 방향을 정의합니다.
   2. Select stimulus type(자극 유형 선택)에서 stimulus type(자극 유형)을 Unidirectional(단방향), Oscillatory(진동) 또는 Oblique(경사)로 설정합니다.
   3. 방향성을 설정한 후 자신의 자극 위치 데이터셋을 가져오거나(자체 자극 벡터 데이터 가져오기) 매개변수를 기반으로 벡터를 자동으로 생성합니다(매개변수에서 자극 벡터 생성). 자극 벡터를 가져오는 경우 3.2.3.1을 진행한 다음 3.3단계로 건너뜁니다. 자극 벡터를 생성하는 경우 다음 단계를 진행합니다.
      1. 자신의 벡터 데이터를 가져오는 경우 자극의 거리 값(즉, 자극이 인접한 각 획득 프레임 사이에서 얼마나 멀리 이동하는지 설명하는 시계열)을 3.2.1단계에서 설명한 것과 동일한 형식으로 가져옵니다. 또한 PyOKR v1.1.2부터 가져온 자극 값을 하위 집합으로 설정하는 기능이 추가되지 않았으므로 전체 데이터셋을 개별 epoch로 분할하지 않고 하나의 epoch로 분석하십시오.
   4. Stimulus parameters(자극 매개변수)에서 데이터 수집에 사용되는 자극의 매개변수를 설정합니다.
      1. Head and Tail을 사용하여 주어진 시도의 시작(머리)과 끝(꼬리)에서 자극이 없는 시간을 설정합니다.
      2. 자극이 표시되는 시간, 자극이 표시된 후 자극이 없는 시간, 주어진 시행 내의 총 epoch 수를 각각 Length of epoch, Length of post-stimulus 및 Number of Epochs로 설정합니다.
      3. 단방향 및 경사 자극의 경우 Horizontal Speed 와 Vertical Speed를 사용하여 자극 속도를 초당 각도로 설정합니다.
      4. Capture frame rate(캡처 프레임 속도)를 사용하여 수집 카메라의 캡처 속도를 설정합니다.
      5. 정현파 자극의 경우, Frequency 및 Amplitude를 사용하여 진동 자극을 모델링하기 위한 정현파를 생성합니다.
   5. 파라미터화 후에는 Generate stimulus vector from parameters를 사용하여 위에 입력된 자극 정보로부터 적절한 모델을 만듭니다.
   6. Select epoch를 사용하여 입력된 자극에 대해 지정된 epoch를 선택하여 전체 웨이브 파일을 스캔합니다.
3. 추적 단계의 감독된 선택
   1. 저속 추적 영역을 식별하려면 필터링되지 않은 데이터(Unfiltered Data) 또는 필터링된 데이터(Filtered Data)를 클릭하여 예비 조정을 통해 고속 위상 saccades를 자동으로 선택합니다. 이 경우 최대 속도 변화를 기반으로 잠재적 saccades에 레이블이 지정됩니다.
   2. 필터링되지 않은 데이터(Unfiltered Data)에서 saccades가 파란색 점으로 정확하게 선택되었는지 확인합니다. 자동 선택이 정확하지 않은 경우 마우스 왼쪽 버튼(LMB)으로 수동으로 포인트를 제거하거나 마우스 오른쪽 버튼(RMB)으로 포인트를 추가합니다. 빠른 위상 saccades가 적절하게 선택되면 가운데 마우스 버튼(MMB)으로 포인트를 저장하고 그래프를 닫습니다.
   3. 자동 필터링이 필요한 경우 Z-Score 임계값 을 설정하고 필터링된 데이터를 클릭하여 saccades를 자동으로 필터링합니다. 필요한 경우 3.3.2단계에서 설명한 것과 동일한 수동 감독을 사용하여 소음을 제거하십시오.
   4. 적절한 saccade 선택 후 Point Adjustment 를 눌러 제거할 영역을 선택합니다. 이전에 3.3.2단계에서 설명한 것과 유사한 제어 체계를 통해 상단 및 하단 지점을 변경합니다. LMB 또는 RMB 로 상단(녹색) 점을 편집하고 Shift+LMB 또는 Shift+RMB로 하단(빨간색) 점을 편집합니다. 포인트가 제대로 배치되면 MMB 를 사용하여 포인트를 저장합니다.
      알림: Mac을 사용하는 경우 하단 및 상단 지점 조정은 두 개의 별도 버튼에 있으며 3.3.2단계에서 설명한 것과 동일한 제어 체계를 따릅니다.
4. 느린 추적 단계 분석
   1. Set Polynomial Order를 사용하여 다항식 모델의 순서를 설정하여 개별 느린 위상에 맞출 다항식 모델을 정의합니다.
      참고: 단방향 또는 경사 자극의 경우, 추적 게인을 계산하기 위해 선형성이 필요하기 때문에 기본값은 1입니다. 정현파 자극의 경우 파동의 곡선을 모델링하기 위해 더 높은 차수가 필요하며 기본값은 15입니다.
   2. 트레이스를 분석하려면 최종 분석을 선택하여 선택한 느린 위상에 대한 느린 위상 모델(그림 2)을 생성하고(그림 2A-D 참조) Epoch(그림 2E)에 걸쳐 평균화된 거리, 속도 및 추적 게인을 계산합니다.
   3. 선택한 영역의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 그래프를 보려면 각각 2D 그래프 보기 또는 3D 그래프 보기를 선택합니다.
   4. epoch 추가를 선택하여 3.4.2단계에서 생성된 수집된 값을 저장합니다. 지정된 동물에 대한 모든 추가 값과 수집된 시행의 평균을 보려면 현재 데이터 세트 보기를 선택합니다.
   5. Epoch를 추가한 후 3.3.1에서 3.4.4 단계에 따라 Select epoch를 사용하여 파일의 나머지 부분을 순환합니다.
   6. 웨이브 파일이 완전히 분석되면 새 파일을 열고, 적절한 매개변수를 설정하고, 그에 따라 분석하여 지정된 동물에 대한 다른 모든 파일에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 각 파일에 대해 3.2.1-3.4.5 단계를 반복하여 지정된 동물에 대한 모든 웨이브 데이터를 포함하는 최종 데이터 세트를 생성합니다.
5. 데이터의 최종 내보내기
   1. 지정된 동물에 대한 데이터 분석이 완료되면 모든 방향 또는 자극이 분석되면 데이터 내보내기를 통해 데이터 세트를 내보냅니다.
      참고: 원시 데이터셋은 출력 파일 이름을 기반으로 내보내지고 출력 폴더 에서 설정한 경로를 따라 각 자극 매개변수에 대한 총 평균과 함께 개별 epoch 데이터를 포함하는 CSV로 저장됩니다.
   2. 개별 동물을 내보낸 후 Ctrl+S를 사용하여 데이터셋을 다시 초기화한 다음 이전 단계를 모두 반복하여 새 동물을 분석합니다.
   3. 필요한 경우 분석 탭에서 데이터 정렬 명령을 사용하여 더 쉽게 분석할 수 있도록 여러 동물에 대해 수집된 모든 출력 데이터를 재구성합니다.
      참고: 이 함수는 출력 폴더에 저장된 분석된 모든 동물 파일의 모든 평균 값을 컴파일하고 정렬하여 그래프 및 통계 비교를 더 쉽게 생성할 수 있도록 합니다. 정렬은 v1.1.2의 파일 이름에 의존합니다. 각 파일(예: WT_123_Analysis)에 대해 3.1.4단계에서 설명한 대로 권장되는 명명 체계를 사용합니다.

결과

위에서 설명한 분석 방법을 검증하기 위해 야생형 마우스와 알려진 추적 결함이 있는 조건부 녹아웃 돌연변이에서 수집된 웨이브 트레이스에 대한 OKR 추적 이득을 정량화했습니다. 또한, 분석 방법의 광범위한 적용 가능성을 테스트하기 위해 다른 비디오 안구 촬영 수집 방법을 사용하여 획득한 야생형 마우스의 별도 코호트에서 파생된 흔적을 분석했습니다. saccades의 자동 필터링은 OKR 데이터 처리 및 분석을 용이하게 합니다(그림 3). 단방향 및 정현파 자극(그림 1D)의 기록을 사용하여 야생형 동물(n = 13)에서 단방향 자극에 대한 4가지 기본 방향(그림 2F)의 이득을 추적하고 수평 및 수직 정현파 자극에 대한 반응의 이득을 추적하는 OKR을 계산했습니다(그림 4). 단방향 및 정현파 자극 모두에 대한 자극 방향에 대한 추적 능력의 불균형은 모든 야생형 마우스에서 일관되게 관찰되며, 설명된 바와 같이 수직 반응보다 훨씬 더 높은 추적 이득을 보여주는 동등하게 강력한 수평 반응을 보입니다². 또한, 상향 및 하향 반응 사이의 비대칭 추적 이득은 이전에 보고된 바와 같이 비디오-안구 채취 방법을 모두 사용하는 야생형 마우스에서도 관찰됩니다 ^2,10. OKR 응답의 게시된 특성화와 비교하여 추적 이득의 상대적 크기 및 일관성은 소프트웨어를 사용하여 계산된 추적 이득이 추적 기능을 정확하게 반영한다는 것을 나타냅니다. 단방향 게인 계산 외에도 수평 및 수직 안구 움직임을 동시에 모델링할 수 있으므로(그림 5) 주어진 자극에 대한 반응으로 안구 움직임을 3차원으로 재구성할 수 있습니다. 이는 교차 결합된 수평 및 수직 반응을 조사하는 향후 연구에 유용한 추가 정량화 기능을 제공합니다⁹.

다양한 실험 조건에서 중요한 행동 변화를 식별하기 위한 소프트웨어의 유용성을 검증하기 위해 게시된 데이터⁹를 다시 분석하여 해당 연구에서 고속 위상 saccades의 수동 계산에 의해 평가된 수직 추적의 결함이 여기에 제시된 방법론을 사용하여 이득을 추적하는 데 반영되는지 확인했습니다. 이전 연구는 Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre)를 사용한 조건부 녹아웃을 통한 전사 인자 T-box Transcription Factor 5 (Tbx5)의 망막에서 유전적 불활성화가 상향 조정된 ON Direction-Selective Ganglion Cells(up-oDSGCs)의 특정 손실을 유발하고 Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); Pcdh9-Cre 돌연변이는 수직 OKR 추적의 특이적 손실을 나타낸다⁹. 여기에 설명된 방법을 사용한 정량 분석은 Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 동물은 이전에 설명하고 ETM(Fast Phase Saccades)의 수동 계수에 의해 얻어진 것과 유사한 정상적인 수평 추적 이득을 유지한다(그림 2F). 그러나 이러한 마우스는 상향 및 하향 자극에 대한 반응으로 거의 0에 가까운 이득으로 수직 추적의 상당한 손실을 보여줍니다(그림 6B, C). 또한, 정현파 반응을 분석한 결과, Tbx5 cKO 동물은 수직 추적이 현저히 감소한 반면 수평 추적 이득은 더 큰 것으로 확인되었습니다(그림 6D-F). PyOKR을 사용하여 이전에 설명한 이 표현형을 재분석하면 이 새로운 방법론의 정밀도와 감도를 입증할 수 있으며, 이를 통해 다양한 유전 균주의 마우스에서 OKR 반응을 정량적으로 비교할 수 있습니다.

마지막으로, UCSF에서 수집된 야생형 수직 OKR 트레이스를 분석하여 다양한 비디오 안구 촬영 방법과 자극 매개변수로 소프트웨어 애플리케이션의 유용성을 검증했습니다. UCSF로부터의 데이터는 405nm 파장 프로젝터의 반사를 통해 움직이는 격자가 머리가 고정된 동물⁽¹⁰ )을 둘러싼 반구에 마우스에 제시되는 반구형 투영 시스템을 사용하여 수집되었다(그림 7A). 단방향 수직 격자를 초당 10도의 속도로 마우스에 제시하고 OKR 응답을 60초 간격으로 기록했습니다(그림 7B, C). PyOKR을 통해 수직 트레이스를 정량적으로 분석하고, 상향 반응을 하향 반응과 비교했습니다(그림 7D). 상향 반응은 예상대로 하향 반응보다 훨씬 강했다¹⁰; 그러나 추적 이득은 JHUSOM에서 기록된 추적에 비해 약간 감소했습니다(그림 2F). 또한 정현파 반응의 정량화는 PyOKR을 통해 분석되었으며(그림 7E), 정현파로 움직이는 자극에 대한 수직 반응의 상당한 비대칭성이 계산된 이득에 반영되었습니다(그림 7F). JHUSOM과 UCSF에서 수집된 이득 값 간의 차이는 서로 다른 자극 속도, 유형 및 파장을 포함한 자극 매개변수 간의 차이에 기인할 수 있습니다. 그러나 각 수집 방법을 사용하여 얻은 데이터 분석에서 관찰된 전반적인 일관성은 PyOKR이 JHUSOM OKR 데이터 수집 시스템을 넘어 쉽게 조정될 수 있으며 비디오 오큘로그래피 방법과 관계없이 다른 OKR 기록에 적용될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 여기에 설명된 소프트웨어 플랫폼이 정확하고 일반적으로 안구 운동 반응 연구에 적용될 수 있음을 보여주며, 이를 통해 다른 그룹에 속하는 동물 간의 정확한 정량적 비교를 가능하게 하여 시각적 이미지 안정화 회로에 대한 연구를 더욱 발전시킬 수 있습니다.

그림 1: OKR 응답 데이터 수집. (A) 앞서 설명한 바와 같이 행동 자극을 위한 OKR 가상 경기장 장치 ^9,13. 4개의 모니터가 머리가 고정된 동물(1)을 둘러싸고 지속적으로 움직이는 바둑판 자극(2)을 표시합니다. 가상 드럼은 4개의 기본 방향 모두에서 단방향 움직임과 진동 정현파 자극을 나타낼 수 있습니다. 마우스의 왼쪽 눈은 적외선(IR) 광선에 의해 조명되고 카메라(3)로 기록되어 시선 추적에 반사된 시각 시스템 반응을 기록합니다. (B) 시선 추적 분석은 동공과 IR 광에 의해 생성된 각막 반사를 캡처하여 수행됩니다. 가상 드럼에 응답하는 안구 움직임의 데이터 수집 및 계산은 앞서 설명한 바와 같이 수행하였다 ^9,13. (C) 수직(Y파) 및 수평(X파)으로 이동하는 눈 벡터의 개략도. (D) 단방향 상향 및 후진 운동과 수직 및 수평 정현파 운동에 대한 눈의 추적 반응 추적 추적 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 단방향 시각적 반응의 추적 분석. (A-D) 게인 분석을 위한 느린 추적 단계의 식별 및 선택. 샘플 단방향 트레이스는 마우스의 눈을 기준으로 앞으로(A), 뒤로(B), 위쪽(C) 및 아래쪽(D) 동작에 대한 시각적 반응과 함께 표시됩니다. 느린 단계는 saccades를 제거하기 위해 3단계에서 설명한 빨간색 및 녹색 점을 추가하여 식별되며 선택한 느린 단계는 노란색으로 강조 표시됩니다. 다항식 회귀는 추적에 선으로 오버레이됩니다. (E) PyOKR 판독값에 구성된 샘플 추적(A-D)의 정량화. 각 트레이스에 대해 방향성에 관계없이 총 XY 속도와 해당 게인이 계산됩니다. 단방향 응답에서 이러한 총 속도는 일반적으로 특정 방향의 개별 속도를 반영합니다. 그러나 정현파 반응의 경우 이 값은 눈의 평균 전체 속도를 반영합니다. 수평 및 수직 속도 구성 요소는 각 방향의 속도를 표시하기 위해 분류됩니다. 그런 다음 제시된 자극 속도를 기반으로 이득을 계산합니다. (F) 관련 ETM 정량화와 비교하여 4개의 기본 방향에서 야생형 동물(n = 13)의 계산된 추적 이득. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 다중 비교와 함께 일원 분산 분석으로 분석된 데이터입니다. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: saccades의 자동 필터링은 OKR 데이터 처리 및 분석을 용이하게 합니다. (A-D) 그림 2A-D의 트레이스 자동 필터링은 saccade를 제거하고 빠른 속도 변화를 제거하고 느린 위상을 함께 연결하여 느린 위상 동작만 모델링합니다. 마지막 기울기는 주어진 epoch 동안의 전체 눈 움직임을 나타냅니다. (E) PyOKR 판독에 정리된 대로 필터링된 샘플 데이터의 이득 정량화. (F) 필터링되지 않은 샘플과 필터링된 샘플 아이 트레이스 간의 게인 값 비교는 유의미한 차이를 반영하지 않습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 필터링되지 않은 결과와 필터링된 결과 사이의 Mann-Whitney U 검정으로 분석된 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 진동 시각적 자극에 대한 반응으로 추적 이득의 도출. (A,B) 정현파로 움직이는 자극에 대한 수직(A) 및 수평(B) 안구 운동 반응은 정의된 진동 자극 매개변수를 기준으로 모델링할 수 있습니다. 선택한 영역은 노란색으로 표시되며 다항식 근사치가 트레이스 위에 오버레이됩니다. 자극의 모델은 각 지점에서 자극이 무엇인지를 참조할 수 있도록 트레이스 뒤에 주황색 정현파로 표시됩니다. (C) 야생형 정현파 반응(n = 7)의 이득 계산은 수평 및 수직 추적 능력 간의 비대칭 반응을 반영합니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 다중 비교와 함께 일원 분산 분석으로 분석된 데이터입니다. **p<0.01,***p<0.005입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 방향 추적은 수평 및 수직 구성 요소에서 모델링할 수 있습니다. (A) 상향 자극에 대한 반응으로 시선 추적 파동의 수직 구성 요소. (B) 상향 자극에 대한 반응으로 시선 추적파의 수평 구성 요소. (C) 수직 및 수평 방향의 전체 눈 궤적. (D) 하향 움직임에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 눈의 움직임 벡터의 3차원 모델. 원시 추적 데이터는 빨간색으로 표시되고 궤적의 회귀 모델은 파란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: Tbx5f/f의 OKR 분석; Pcdh9-Cre 마우스는 단방향 수직 추적 이득에서 상당한 결함을 보여줍니다. (A) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 동물은 수평 추적 이득에서 유의한 변화를 보이지 않습니다. (나,씨) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 동물은 수직 반응에서 이득이 현저히 감소하는 것을 보여줍니다: 위쪽(B) 및 아래쪽(C). (D,E)  Tbx5f/f의 정현파 반응; 수평 (D) 및 수직(E) 진동 자극에 반응하는 Pcdh9-Cre 동물. (F) Tbx5f/f의 정량화; Pcdh9-Cre 진동 응답은 수평 추적 게인에서 상당한 증가를 보이지만 수직 응답에서는 감소를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, Mann-Whitney U 검정으로 분석된 데이터입니다. *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 대체 비디오 안구 조영술 방법에서 획득한 데이터에 대한 PyOKR 적용. (A) 설명된 바와 같은 OKR 가상 드럼 자극 장치¹⁰. 405nm 파장 DLP 프로젝터는 볼록 거울을 통해 반구에 반사되어 동물의 시야를 둘러싸는 가상 드럼을 만듭니다. 안구 움직임은 반구 외부에 위치한 NIR 카메라를 사용하여 측정됩니다. 단방향 및 정현파 막대 격자는 수직 방향으로 머리가 고정된 동물에게 표시됩니다. (나,씨) 상향(B) 및 하향(C) 추적 단계를 식별하고 정량 분석을 위해 선택합니다. 느린 단계는 노란색으로 강조 표시됩니다. (D) 여기에 설명된 방법을 사용하여 야생형 동물(n=5)의 수직 추적에서 계산한 추적 이득. 비대칭 추적 능력이 관찰되며 하향 추적이 크게 감소합니다. (E) 야생형 동물(n=8)의 추적 이득을 정량화하기 위해 모델링된 정현파 자극에 대한 진동 반응. 느린 단계는 노란색으로 강조 표시됩니다. (F) 정현파 이득을 정량화하면 상향 이득에 비해 하향 추적 이득이 감소한 것으로 나타났습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, Mann-Whitney U 검정으로 분석된 데이터입니다. *p<0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: PyOKR Windows 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 2: PyOKR Mac 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

PyOKR은 눈의 움직임에 반영된 시각적 반응을 연구하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에는 정확성, 접근성 및 데이터 수집 옵션뿐만 아니라 매개변수화 및 다양한 자극 속도를 통합할 수 있는 기능이 포함됩니다.

직접 시선 추적 게인 평가는 ETM(Fast Phase Saccades)의 기존 수동 계산보다 더 직접적인 정량 메트릭인 안구 움직임의 정확한 특성화를 제공합니다. saccade counting은 유용하지만 실제 추적 동작에 대한 간접 평가를 제공합니다. PyOKR 소프트웨어 플랫폼은 saccade 진폭 및 느린 위상의 길이를 포함한 추가 매개변수를 고려하여 추적 속도의 직접 정량화를 제공합니다. 또한 고속 위상 saccade 계수는 설정된 기간 동안의 saccade 빈도 평가에 의존하므로 각 trace에는 동물 스트레스로 인한 무작위 saccades를 포함하여 노이즈가 거의 또는 전혀 없어야 합니다. 이러한 요인으로 인해 수집된 많은 추적을 사용할 수 없게 되므로 시선 추적을 정확하게 평가하기 위해 데이터 수집에 상당한 시간이 추가됩니다. 그러나 여기에서 설명하는 소프트웨어는 주어진 트레이스 내에서 개별 느린 위상을 직접 정량화하고 트레이스를 따라 순간 지점에서 이득을 계산하여 이 문제를 해결합니다. 그것은 눈 움직임의 속도를 주어진 지점에서 자극의 속도와 비교함으로써 이를 달성합니다. saccadic 주파수는 더 이상 해석을 위한 정의 매개변수가 아니기 때문에 사용자 감독을 통해 노이즈를 쉽게 제거할 수 있으므로 노이즈가 해석 품질에 미치는 영향을 줄일 수 있습니다. 이를 통해 수집된 데이터를 보다 유용하게 사용할 수 있으며, 이러한 데이터를 분석할 때 더 높은 통계적 성능을 얻을 수 있으며, 개별 마우스 및 다양한 마우스 그룹에 대한 OKR 매개변수를 특성화하고 시선 추적을 정량화할 때 정확도와 재현성을 높일 수 있습니다. Z-점수 방법을 통해 발견된 안구 속도의 급격한 변화를 기반으로 한 saccades의 자동 필터링도 추적 게인¹⁰을 특성화하는 데 사용되었습니다. 이 필터링 방법을 소프트웨어 내에 통합하기 위해 이러한 유형의 속도 필터링을 포함했지만 이 접근 방식으로 인해 발생하는 잠재적 오류를 줄이기 위해 임계값 매개변수화 및 수동 saccadic 감독과 같은 추가 도구를 포함했습니다. 자동 필터링을 사용하는 대신 원시 트레이스를 분석에 사용하는 경우, 트레이스 속도의 가우스 커널 밀도 추정을 통한 최대 속도 변화를 통해 saccades, 깜박임 또는 마우스 피로 인한 안구 움직임의 급격한 변화를 식별할 수 있습니다. 이렇게 하면 세그먼트 영역을 자동으로 선택할 수 있으며 결국 수동 사용자 감독에 따라 제거할 수 있습니다. 수동 감시는 노이즈가 있는 추적에 대한 더 높은 허용 오차를 제공하여 사용자가 빠른 눈 변화를 위해 위양성 또는 위음성 표시를 신속하게 수정할 수 있도록 합니다. 또한 PyOKR은 다항식 근사치를 사용하여 주어진 방향의 일반적인 눈 움직임을 모델링하기 때문에 개별 지점의 노이즈가 매끄럽게 제거되어 트레이스의 노이즈에 대한 어느 정도의 허용 오차로 궤적 속도를 평가할 수 있습니다. 전체 트레이스에서 데이터 품질이 극도로 떨어지거나 데이터 수집 중 부적절한 보정이 발생하는 경우에만 소프트웨어가 정확한 데이터 분석을 생성할 수 없습니다. 여기에 설명된 PyOKR 소프트웨어 응용 프로그램은 사용자 감독, 필터링 및 순간 이득 계산 도구를 통합하여 이전 방법보다 높은 정확도와 더 직접적인 메트릭으로 추적 이득을 생성합니다.

PyOKR에는 사용자 요구에 맞게 OKR 분석을 사용자 지정할 수 있는 많은 기능도 있습니다. 자극 매개변수와 원시 자극 벡터의 입력을 통해 사용자는 원하는 자극을 정확하게 정의할 수 있습니다. 여기에는 단방향, 정현파 또는 경사 자극이 포함될 수 있으며, 소프트웨어는 이 모든 자극을 사용하여 관련 시각적 반응에 대한 정확한 추적 이득을 생성할 수 있습니다. 이 방법론의 자극 매개변수화를 통해 각 프레임에서 계산된 순간 이득은 입력된 자극에 관계없이 높은 정확도로 안정적으로 생성될 수 있습니다. 여기서는 경사 자극 데이터를 분석하지 않았지만 분해된 XY 속도 벡터를 통해 정확한 이득을 계산하여 경사각을 재구성할 수 있으므로 경사 자극의 정확한 이득을 계산할 수 있습니다. 자극 설정의 접근 가능한 매개변수화를 통해 이 도구는 모든 시각적 자극에 대한 반응으로 웨이브 트레이싱에 널리 적용할 수 있습니다. 또한 이 소프트웨어는 이전 방법에 비해 더 높은 처리량과 재현 가능한 정량화를 용이하게 합니다. OKR 추적을 통해 정렬하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 그러나 PyOKR의 간소화된 사용자 인터페이스는 이전보다 더 빠른 속도로 많은 트레이스를 쉽게 스크리닝할 수 있습니다. 이를 통해 더 빠른 추적 정량화가 가능할 뿐만 아니라 눈 속도의 직접 정량화, 눈 움직임의 방향 벡터 구성 요소, 이동 벡터의 수평 및 수직 구성 요소 모두에서 자극에 대한 순간 이득을 포함한 추가 OKR 매개변수를 나타낼 수 있습니다. 또한, 당사의 방법이 제공하는 saccades의 자동 식별 및 추적 속도 계산을 감안할 때, 데이터 분석의 잠재적 실험자 편향은 위음성을 생성할 수 있는 수동 ETM 계수 또는 자동 추적 필터링과 같은 다른 정량화 방법에 비해 크게 감소합니다. 또한 대량의 행동 데이터를 생성하고 자동으로 컴파일하여 다운스트림 분석을 단순화할 수 있습니다. PyOKR에서 사용할 수 있는 데이터 내보내기 및 정렬 기능을 통해 여러 동물 및 조건에 대한 추적 데이터를 자동으로 처리하여 체계적인 데이터 저장과 신속한 통계 분석을 가능하게 할 수 있습니다. 회로 조작 또는 시각적 응답과 같은 동일한 기록 세션 동안 여러 조건을 사용하는 실험을 수행하는 경우, 이 단일 기록 세션에서 파생된 관심 있는 독립 변수를 기반으로 별도의 데이터 세트를 저장할 수 있는 개별 웨이브 파일 또는 하위 집합 epoch로 데이터를 수집하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 실험 패러다임 내에서 서로 다른 정현파 주파수에 대한 응답의 차이를 테스트하는 경우 WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis 및 WT_1_Freq0.3Analysis와 같은 별도의 분석을 위해 다른 매개변수를 다른 파동 파일에 저장하는 것이 좋습니다. 현재 버전에서는 epoch가 분석되면 데이터 세트 내에서 개별 epoch 값을 선택할 수 있는 기능이 없지만 필요한 경우 나중에 추가할 수 있습니다.

마지막으로, 당사의 분석법은 여러 비디오 안구 촬영 수집 방법에 적용할 수 있으며 실험실의 특정 요구 사항에 쉽게 맞출 수 있는 강력한 분석 플랫폼을 제공합니다. 야생형 및 기존 돌연변이 OKR 데이터, 그리고 다양한 방법과 자극을 사용하여 수집된 야생형 OKR 데이터의 분석을 통해 분석 도구가 a) 높은 정확도와 처리량으로 모든 방향성 자극에서 OKR 추적을 정량화할 수 있음을 보여줍니다. b) 유전적 교란으로 인한 시각 시스템 행동 차이를 식별합니다. c) 다양한 비디오 안구 조영 방법의 시각적 추적 데이터 평가. 분석 플랫폼의 접근성과 일반적인 적응성은 OKR 반응에 대한 추가 연구를 용이하게 하고 안구 운동 반응의 맥락에서 신경 회로 조립 및 역학을 특성화하는 행동 연구를 향상시킬 것입니다.

정확한 측정과 그에 따른 유용한 데이터 분석을 얻으려면 데이터 수집에 몇 가지 단계가 필요합니다. 동물이 행동 테스트 장치에 적응하고 행동 반응에 대한 동물 스트레스의 영향을 줄일 수 있도록 여러 세션에 걸쳐 OKR 데이터를 수집하는 것이 좋습니다. 그러나, 과도한 기록은 OKR 반응(¹³)의 강화로 이어질 수 있으므로, 테스트 체제를 설계할 때 주의하는 것이 권장된다. OKR 데이터 수집 중에는 분석된 데이터의 품질이 처리된 추적의 직접적인 기능이기 때문에 비디오 안구 조영 장비의 적절한 보정이 정확한 정량화에 매우 중요합니다. 중요한 것은 Matplotlib를 통한 그래프 감시를 위해 Spyder IDE의 사용이 필요하다는 것입니다. 우리 플랫폼의 접근성과 프레임워크 설계를 감안할 때, 다른 사람들이 소프트웨어의 기능을 확장하고 이 플랫폼을 고유한 행동 실험 패러다임에 맞게 조정하는 데 필요한 모든 도구를 사용할 수 있습니다.

결론적으로, 여기에서는 현재 기존 방법론을 사용하여 사용할 수 있는 것보다 더 심층적이고 정량적인 힘으로 OKR 행동 반응을 분석하기 위한 새롭고 접근 가능하며 다재다능한 도구에 대해 설명합니다. PyOKR은 초보 Python 사용자가 쉽게 사용할 수 있으며 엄격성과 재현성을 높인 OKR 파동을 빠르고 정확하게 분석할 수 있도록 확립된 분석 파이프라인과 인터페이스가 포함되어 있습니다. 이 소프트웨어의 적응성은 사용자가 특정 요구 사항과 데이터 수집 절차에 맞게 쉽게 조정할 수 있는 유연한 프레임워크를 제공합니다. 우리는 이 정량적 방법이 안구 운동 반응에 대한 연구를 발전시키고 시각 시스템 행동을 주도하는 신경 회로의 발달 및 기능에 대한 이해를 더욱 발전시킬 것으로 기대합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J  마우스	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex 녹음 챔버 - UCSF	맞춤형	N/A	Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Gift from B. Bruneau N	/A	Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC 재고 # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD