전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드

이 프로토콜은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하기 위한 접근 가능한 방법과 워크플로우를 보여줍니다. 이 프로토콜은 특히 실험실 기술에 대한 사전 교육을 받지 않고 PBMC의 수집 및 냉동 보존을 용이하게 하기 위한 목적으로 초보 연구 기술자, 학생 및 임상 실험실 직원을 대상으로 합니다.

이 프로토콜은 원심분리를 사용하여 밀도에 따라 전혈 성분을 분리합니다. 전혈은 적혈구/적혈구(부피의 ~45%), 백혈구(부피의 <1%), 혈소판(부피의 <1%), 혈장(부피의 ~55%)1,2,3,4,5,6의 4가지 주요 성분으로 구성됩니다. 백혈구는 핵 특성에 따라 원형 또는 다핵^{6의 두} 가지 범주로 나눌 수 있다. PBMC는 둥근 핵을 가진 백혈구로 정의되며 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포), 수지상 세포 및 단핵구로 구성됩니다⁶. 다핵 백혈구에는 과립구가 포함되며, 과립구는 호중구, 호염기구, 호산구 등의 세포 유형으로 구성된다⁶. 다핵 백혈구는 PBMC보다 밀도가 높다⁶. 전혈의 각 성분의 밀도는 표 1에 자세히 나와 있습니다.

이 프로토콜에서는 전혈이 밀도 구배 원심분리 튜브에 수집됩니다. 이 튜브에는 밀도가 1.077g/mL인 사전 충전된 밀도 구배 매체가 포함되어 있습니다. 원심분리 후, 다핵 백혈구 및 적혈구를 포함한 밀도가 높은 세포는 밀도 구배 배지에 의해 PBMC 및 혈소판에서 분리됩니다(그림 1A)^6,7. 그런 다음 PBMC 및 혈소판 분획을 수집, 세척 및 원심분리하여 혈소판을 제거합니다. 생성된 정제된 PBMC는 -80°C 또는 액체 질소에서 수집 및 보관됩니다. 동결 보존된 PBMC는 실행 가능하게 해동하여 다운스트림 분석에 직접 사용하거나 특정 구성 세포 유형을 분리하기 위해 추가로 처리할 수 있습니다.

이 프로토콜은 생존율이 높은 PBMC의 고품질 RNA 염기서열분석에 최적화되었습니다. 이 기사에서는 PBMC를 외래 환자 클리닉에서 환자로부터 분리하고 냉동 보존했습니다. 그 후, FACS에 의해 PBMC에서 단핵구를 분리하고 RNA 시퀀싱을 통해 분석했습니다. 그러나 프로토콜은 세포 배양, 유전자 편집, 생체 외 기능 연구, 단일 세포 분석, 유세포 분석에 의한 표현형 분석 또는 비행 시간에 의한 세포 분석, DNA/RNA 또는 단백질의 분리, 면역조직화학을 위한 슬라이드 등과 같은 다른 실험적 요구에 널리 적용될 수 있습니다 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

밀도 구배 원심분리 튜브에서 PBMC 수집 외에도 이 프로토콜은 EDTA 튜브를 사용하여 원심분리를 통해 플라즈마 및 버피 코트를 수집하는 방법을 검토합니다. 원심분리 후 전혈은 혈장, 적혈구 및 백혈구를 포함하는 버피 코트(buffy coat)라고 하는 얇은 계면층으로 분리됩니다(그림 1B)⁶. 버피 코트는 일반적으로 DNA 추출 및 후속 게놈 분석에 사용됩니다^19,20. 형질층은 전혈의 cell-free 성분을 포함하며 바이오마커 분석에 사용할 수 있습니다^21,22.

이 연구 프로토콜은 UCSD와 KUMC Human Protections Program의 승인을 받았으며 헬싱키 선언을 준수합니다. 모든 개인은 참여 및 혈액 채취에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. PBMC의 처리 및 냉동 보존

1. 채혈 하루 전에 표 2 에 나열된 재료 및 시약의 체크리스트를 인쇄하고 그에 따라 준비하고 라벨을 부착합니다.
   참고: 이 프로토콜은 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브를 수집하기 위해 설계되었습니다. 각 튜브는 약 1,200만 개의 PBMC를 생성하며, 그 중 약 50%와 20%는 각각 살아있는 림프구와 단핵구입니다. 실험적 요구 사항에 따라 확장할 수 있습니다. 세포의 절대 수는 환자 또는 치료 조건에 따라 크게 다를 수 있습니다.
2. 표준 정맥 절개술 기법을 사용하여 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브와 1개의 EDTA 튜브에 약 6mL의 부피가 채워질 때까지 전혈을 수집합니다.
   참고: 여러 환자 또는 치료 조건의 샘플이 필요한 경우 수집된 튜브를 최대 4시간까지 보관한 다음 동시에 처리할 수 있습니다.
3. 채취 후 모든 튜브를 1,800 x g 에서 실온에서 20분 동안 원심분리합니다.
   알림: 원심분리기 작동 방법에 대한 데모는 추가 비디오 1 을 참조하십시오.
4. 원심분리 후 밀도 구배 원심분리 튜브를 조심스럽게 엽니다. 전사 피펫을 사용하여 플라즈마가 포함된 반투명 노란색 층을 제거하고 폐기합니다. 밀도 구배 매체 바로 위에 있는 흐릿한 세포 층을 방해하지 마십시오. PBMC를 버리지 않고 과도한 플라즈마를 남겨 두는 것이 좋습니다. 모든 튜브에 대해 반복합니다.
   참고: 밀도 구배 매체를 포함하는 튜브의 원심분리 후 플라즈마 및 PBMC는 밀도 구배 매체 위에 있습니다. 적혈구와 과립구는 바닥에 가라앉습니다. 시각화에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오.
5. 새로운 전사 피펫을 사용하여 각 튜브에 세포와 잔류 혈장을 포함하는 나머지 부피를 밀도 구배 매체 위로 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다.
6. 재현탁 후, 튜브의 재현탁 내용물을 라벨이 부착된 50mL 코니컬 튜브에 피펫팅합니다. 모든 튜브에 대해 반복합니다.
7. 용액 1(RPMI 배지)을 50mL 라인에 도달할 때까지 50mL 튜브에 붓습니다.
8. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 1.4-1.7단계를 반복합니다.
   알림: 다른 샘플이 혼합되지 않았는지 확인하고 오염을 방지하기 위해 새 이송 피펫을 사용하십시오.
9. 50mL 튜브를 300 x g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다.
   참고: 섹션 2에 자세히 설명된 혈장 및 버피 수집 프로토콜은 이 시간 동안 완료될 수 있습니다.
10. 가능한 한 많은 상층액을 버리십시오. 필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
    참고: 원심분리 후 펠릿에는 PBMC가 포함되고 상층액에는 혈소판과 잔류 혈장이 포함됩니다.
11. 용액 2(RPMI 배지 + 12.5% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌) 15mL 튜브를 PBMC 펠릿이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
12. 전사 피펫을 사용하여 용액 3(RPMI 배지 + 11.25% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌 + 10% DMSO) 15mL를 흡입합니다. 50mL 튜브에 적하에 추가합니다.
    참고: 솔루션 3에는 실온에서 세포에 독성이 있는 DMSO가 포함되어 있습니다. 즉시 처리할 준비가 될 때까지 솔루션 3을 추가하지 마십시오.
13. 튜브를 부드럽게 3번 뒤집어 섞습니다.
14. 다중 분주 피펫을 사용하여 사전 라벨링되고 사전 냉각된 각 cryovial을 1mL의 PBMC로 채웁니다.
    참고: 다중 분주 파이펫을 작동하는 방법에 대한 데모는 추가 비디오 2 를 참조하십시오.
15. 미리 냉각된 냉동 용기에 극저온을 넣습니다. 그런 다음 용기를 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.
16. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 1.9-1.13단계를 반복합니다.
17. 냉동 용기 내부에 극저온을 최소 12시간 동안 보관한 다음 -80°C의 라벨이 부착된 보관 상자로 옮깁니다.
    알림: 또는 장기 보관을 위해 냉동 극저온을 액체 질소(<-135 °C)로 옮기십시오.

2. EDTA 튜브의 플라즈마 및 버피 코트 처리

1. 실온에서 1,800 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다.
   참고: 원심분리 후 최상층은 혈장으로 구성되고 하단층은 적혈구가 포함되며 계면은 버피 코트가 됩니다. 시각화에 대해서는 그림 1B 를 참조하십시오.
2. 새로운 전사 피펫을 사용하여 버피 코트 층을 방해하지 않고 가능한 한 많은 플라즈마를 흡입합니다. 그런 다음 0.5mL 분취액을 사전 라벨링된 극저온 저장고에 분주합니다. 버피 코트 층을 흡인하고 적절하게 라벨이 지정된 cryovial로 옮깁니다.
   참고: 일부 혈장과 적혈구는 버피 코트 컬렉션을 오염시킬 수 있습니다.
3. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 2.2단계를 반복합니다.
4. 채취 후에는 극저온을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
   알림: 또는 장기 보관을 위해 액체 질소(<-135 °C)에 보관하십시오.

3. PBMC 해동

1. 해동 하루 전에 표 3 에 나열된 재료 및 시약의 체크리스트를 인쇄하고 그에 따라 준비하고 라벨을 붙입니다.
   참고: 이 프로토콜은 1mL의 PBMC를 포함하는 1.5mL 튜브 1개의 해동을 위해 설계되었습니다. 각 튜브는 약 200만 개의 PBMC를 생성하며, 그 중 약 50%와 20%는 각각 살아있는 림프구와 단핵구입니다. 실험적 요구 사항에 따라 확장할 수 있습니다. 세포의 절대 수는 환자 또는 치료 조건에 따라 크게 다를 수 있습니다.
2. 드라이아이스를 사용하여 냉동 PBMC를 보관에서 옮기고 37°C 인큐베이터에서 4분 동안 또는 마지막 얼음 결정 해동 직전에 해동합니다.
   참고: 원하는 경우, 섹션 4에 자세히 설명된 대로 세포 계수 및 생존도 측정을 위해 부분 표본을 채취할 수 있습니다.
3. 해동 후 각 극저온 1mL에 용액 4(PBS + 2mM EDTA)를 추가합니다. 그런 다음 해동된 모든 PBMC 튜브에 대해 10mL의 용액 4가 들어 있는 사전 라벨이 부착된 50mL 튜브에 내용물을 붓습니다. 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
4. 빈 50mL 튜브에 세포 여과기를 놓고 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 붓습니다.
   알림: 필요한 경우 가볍게 두드려 표면 장력을 끊습니다.
5. 변형된 세포가 포함된 각 튜브를 실온에서 400 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다.
6. 원심분리 후 DMSO가 함유된 상층액을 붓습니다. 필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
7. 다운스트림 실험 요구 사항(예: 세포 배양 배지, 유세포 분석 항체 칵테일 등)에 적합한 원하는 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.

4. 세포 계수 및 생존력

1. 3.2단계에서 동결 PBMC를 해동한 직후 20μL의 세포를 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 동일한 부피의 0.4% Trypan Blue 용액을 추가하고 피펫을 위아래로 부드럽게 3-4회 추가하여 혼합합니다.
2. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 계수하고 생존 가능성을 평가합니다. 희석 계수 2가 고려되었는지 확인합니다.
   주의: 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 혈구측정기는 세포 수 및 생존율을 평가하기 위한 대체 방법으로 사용될 수 있다²³.

PBMC 수집 및 동결 보존 후, 56개의 고유한 샘플에서 해동된 PBMC, 단핵구 및 림프구의 생존력을 제조업체의 지침에 따라 표 4에 나열된 시약을 사용하여 유세포 분석으로 평가했습니다(그림 2A-F). PBMC, 단핵구 및 림프구의 평균 ±SD 생존율은 각각 94± 4.0%, 98± 1.1%, 93± 5.6%로 달성되었습니다(그림 2G). Trypan Blue 배제에 의한 생존도 측정은 평균 생존율이 88 ± 7.5%이고 세포 수가 2.3 x 106 ± 1.9 x 106이었습니다. 유세포 분석 분석은 또한 살아있는 단핵구가 17 ± 5.9%를 차지하고 림프구가 전체 PBMC의 53 ± 13.0%를 구성한다는 것을 보여주었습니다.

이어서, 유세포 분석에 의해 59개의 고유한 샘플로부터 해동된 PBMC로부터 단핵구를 분류하고, 다른 문헌24에 기술된 바와 같이 라이브러리 준비 및 RNA-시퀀싱을 위해 제출하였다. 93 ± 6.3%의 판독 정렬과 49.6 ± 1.4%의 GC 함량으로 평균 ±18.0 ± 1,630만 개의 SD 총 염기서열 수가 달성되었습니다(그림 3A-B). 56개의 고유 샘플의 하위 집합에서 평균 SD 고유 매핑 읽기 비율이 88 ± 3.6%인 것으로 나타났습니다.± 이러한 매개변수는 고품질 RNA 염기서열분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 적합한 실행 가능한 PBMC가 이 프로토콜을 사용하는 모든 수준의 실험실 교육을 받은 작업자가 얻을 수 있음을 보여줍니다.

표 1: 전혈의 성분을 밀도가 감소하는 순서로 나열.

표 2: PBMC를 수집하고 동결 보존하기 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 물질 체크리스트.

표 3: PBMC의 해동 및 계수를 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 재료의 체크리스트.

표 4: 유세포 분석에 의한 PBMC에서 단핵구 분리를 위한 시약 표.

그림 1: 밀도 구배 원심분리 또는 EDTA 튜브에서 원심분리로 분리한 전혈 성분. (A) 밀도 구배 원심분리 튜브에서 전혈을 원심분리하면 밀도 구배 배지 위의 혈장, 혈소판 및 PBMC가 밀도 구배 배지 아래에 다핵 및 적혈구가 분리됩니다. (B) EDTA 튜브에서 전혈을 원심분리하면 최상층에서 혈장을, 최하층에서 적혈구를, 계면에서 버피코트를 분리합니다. Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 해동된 동결 보존된 PBMC의 생존력은 활성/데드 플로우 염색 및 유세포 분석으로 평가되었습니다. (A) 별표 *로 표시된 파편은 전방 및 측면 산란 게이팅에 의해 PBMC에서 제외됩니다. (B) 전체 PBMC의 대표적인 살아있는/죽은 분석 (C) Pan-monocyte는 다음 FITC 표지 표면 항원(CD3, CD19, CD56 및 CD66b)에 대해 HLA-DR 양성 및 음성으로 gated. (D) 단핵구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (E) 다음 FITC 표지된 표면 항원에 의해 차단된 림프구: CD3, CD19, CD56 및 CD 66b. (F) 림프구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (G) 56개 샘플에서 정량화된 각 세포 유형의 생존율(%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 냉동 보존된 PBMC에서 분류된 단핵구의 RNA 염기서열 분석 품질. 56개의 고유한 샘플이 염기서열 분석되었고 총 염기서열 1,630만 ± 평균 SD 18.0± 생성되었습니다. (A) 염기서열의 92.5% ± 6.3%가 기준 게놈과 일치하여 정렬률이 높았습니다. (B) 이들 서열의 GC 함량은 49.6 ± 1.4%였다. FastQC25로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 비디오 1: 원심분리기 사용 방법 시연 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 비디오 2: 다중 디스펜서 피펫 작동 방법 시연. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 관련 재정적 또는 비재정적 이해관계가 없습니다.