방법 논문

전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드

DOI:

10.3791/66794

⸱

2024년 10월 25일

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 유세포 분석 및 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석 및 워크플로우에 적합한 말초 혈액 단핵 세포를 수집, 보관 및 해동하기 위한 접근 가능한 가이드를 제공합니다. 플라즈마와 버피 코트 컬렉션도 시연됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 면역 체계와 질병 및 병원체에 대한 면역 체계의 반응에 대한 생물 의학 연구에 일반적으로 사용됩니다. 이 상세 프로토콜은 유세포 분석 및 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 응용 분야에 적합한 전혈구에서 고품질의 생존 가능한 PBMC를 분리, 동결 보존 및 해동하기 위한 장비, 공급품 및 단계를 설명합니다. 전혈에서 혈장 및 버피 코트를 PBMC와 병렬로 동시에 처리하는 프로토콜도 설명되어 있습니다. 밀도 구배 원심분리를 활용하여 PBMC를 분리하는 이 따르기 쉬운 단계별 프로토콜에는 공급품, 장비 및 준비 단계에 대한 체크리스트가 함께 제공됩니다. 이 프로토콜은 실험실 기술에 대한 사전 경험이 있는 개인에게 적합하며 임상 또는 연구 실험실에서 구현할 수 있습니다. 고품질 세포 생존율 및 RNA 염기서열분석은 이 프로토콜을 사용한 실험실 경험이 없는 작업자가 수집한 PBMC에서 비롯되었습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하기 위한 접근 가능한 방법과 워크플로우를 보여줍니다. 이 프로토콜은 특히 실험실 기술에 대한 사전 교육을 받지 않고 PBMC의 수집 및 냉동 보존을 용이하게 하기 위한 목적으로 초보 연구 기술자, 학생 및 임상 실험실 직원을 대상으로 합니다.

이 프로토콜은 원심분리를 사용하여 밀도에 따라 전혈 성분을 분리합니다. 전혈은 적혈구/적혈구(부피의 ~45%), 백혈구(부피의 <1%), 혈소판(부피의 <1%), 혈장(부피의 ~55%)1,2,3,4,5,6의 4가지 주요 성분으로 구성됩니다. 백혈구는 핵 특성에 따라 원형 또는 다핵6의 두 가지 범주로 나눌 수 있다. PBMC는 둥근 핵을 가진 백혈구로 정의되며 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포), 수지상 세포 및 단핵구로 구성됩니다6. 다핵 백혈구에는 과립구가 포함되며, 과립구는 호중구, 호염기구, 호산구 등의 세포 유형으로 구성된다6. 다핵 백혈구는 PBMC보다 밀도가 높다6. 전혈의 각 성분의 밀도는 표 1에 자세히 나와 있습니다.

이 프로토콜에서는 전혈이 밀도 구배 원심분리 튜브에 수집됩니다. 이 튜브에는 밀도가 1.077g/mL인 사전 충전된 밀도 구배 매체가 포함되어 있습니다. 원심분리 후, 다핵 백혈구 및 적혈구를 포함한 밀도가 높은 세포는 밀도 구배 배지에 의해 PBMC 및 혈소판에서 분리됩니다(그림 1A)6,7. 그런 다음 PBMC 및 혈소판 분획을 수집, 세척 및 원심분리하여 혈소판을 제거합니다. 생성된 정제된 PBMC는 -80°C 또는 액체 질소에서 수집 및 보관됩니다. 동결 보존된 PBMC는 실행 가능하게 해동하여 다운스트림 분석에 직접 사용하거나 특정 구성 세포 유형을 분리하기 위해 추가로 처리할 수 있습니다.

이 프로토콜은 생존율이 높은 PBMC의 고품질 RNA 염기서열분석에 최적화되었습니다. 이 기사에서는 PBMC를 외래 환자 클리닉에서 환자로부터 분리하고 냉동 보존했습니다. 그 후, FACS에 의해 PBMC에서 단핵구를 분리하고 RNA 시퀀싱을 통해 분석했습니다. 그러나 프로토콜은 세포 배양, 유전자 편집, 생체 외 기능 연구, 단일 세포 분석, 유세포 분석에 의한 표현형 분석 또는 비행 시간에 의한 세포 분석, DNA/RNA 또는 단백질의 분리, 면역조직화학을 위한 슬라이드 등과 같은 다른 실험적 요구에 널리 적용될 수 있습니다 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

밀도 구배 원심분리 튜브에서 PBMC 수집 외에도 이 프로토콜은 EDTA 튜브를 사용하여 원심분리를 통해 플라즈마 및 버피 코트를 수집하는 방법을 검토합니다. 원심분리 후 전혈은 혈장, 적혈구 및 백혈구를 포함하는 버피 코트(buffy coat)라고 하는 얇은 계면층으로 분리됩니다(그림 1B)6. 버피 코트는 일반적으로 DNA 추출 및 후속 게놈 분석에 사용됩니다19,20. 형질층은 전혈의 cell-free 성분을 포함하며 바이오마커 분석에 사용할 수 있습니다21,22.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구 프로토콜은 UCSD와 KUMC Human Protections Program의 승인을 받았으며 헬싱키 선언을 준수합니다. 모든 개인은 참여 및 혈액 채취에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. PBMC의 처리 및 냉동 보존

  1. 채혈 하루 전에 표 2 에 나열된 재료 및 시약의 체크리스트를 인쇄하고 그에 따라 준비하고 라벨을 부착합니다.
    참고: 이 프로토콜은 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브를 수집하기 위해 설계되었습니다. 각 튜브는 약 1,200만 개의 PBMC를 생성하며, 그 중 약 50%와 20%는 각각 살아있는 림프구와 단핵구입니다. 실험적 요구 사항에 따라 확장할 수 있습니다. 세포의 절대 수는 환자 또는 치료 조건에 따라 크게 다를 수 있습니다.
  2. 표준 정맥 절개술 기법을 사용하여 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브와 1개의 EDTA 튜브에 약 6mL의 부피가 채워질 때까지 전혈을 수집합니다.
    참고: 여러 환자 또는 치료 조건의 샘플이 필요한 경우 수집된 튜브를 최대 4시간까지 보관한 다음 동시에 처리할 수 있습니다.
  3. 채취 후 모든 튜브를 1,800 x g 에서 실온에서 20분 동안 원심분리합니다.
    알림: 원심분리기 작동 방법에 대한 데모는 추가 비디오 1 을 참조하십시오.
  4. 원심분리 후 밀도 구배 원심분리 튜브를 조심스럽게 엽니다. 전사 피펫을 사용하여 플라즈마가 포함된 반투명 노란색 층을 제거하고 폐기합니다. 밀도 구배 매체 바로 위에 있는 흐릿한 세포 층을 방해하지 마십시오. PBMC를 버리지 않고 과도한 플라즈마를 남겨 두는 것이 좋습니다. 모든 튜브에 대해 반복합니다.
    참고: 밀도 구배 매체를 포함하는 튜브의 원심분리 후 플라즈마 및 PBMC는 밀도 구배 매체 위에 있습니다. 적혈구와 과립구는 바닥에 가라앉습니다. 시각화에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오.
  5. 새로운 전사 피펫을 사용하여 각 튜브에 세포와 잔류 혈장을 포함하는 나머지 부피를 밀도 구배 매체 위로 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다.
  6. 재현탁 후, 튜브의 재현탁 내용물을 라벨이 부착된 50mL 코니컬 튜브에 피펫팅합니다. 모든 튜브에 대해 반복합니다.
  7. 용액 1(RPMI 배지)을 50mL 라인에 도달할 때까지 50mL 튜브에 붓습니다.
  8. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 1.4-1.7단계를 반복합니다.
    알림: 다른 샘플이 혼합되지 않았는지 확인하고 오염을 방지하기 위해 새 이송 피펫을 사용하십시오.
  9. 50mL 튜브를 300 x g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다.
    참고: 섹션 2에 자세히 설명된 혈장 및 버피 수집 프로토콜은 이 시간 동안 완료될 수 있습니다.
  10. 가능한 한 많은 상층액을 버리십시오. 필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
    참고: 원심분리 후 펠릿에는 PBMC가 포함되고 상층액에는 혈소판과 잔류 혈장이 포함됩니다.
  11. 용액 2(RPMI 배지 + 12.5% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌) 15mL 튜브를 PBMC 펠릿이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  12. 전사 피펫을 사용하여 용액 3(RPMI 배지 + 11.25% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌 + 10% DMSO) 15mL를 흡입합니다. 50mL 튜브에 적하에 추가합니다.
    참고: 솔루션 3에는 실온에서 세포에 독성이 있는 DMSO가 포함되어 있습니다. 즉시 처리할 준비가 될 때까지 솔루션 3을 추가하지 마십시오.
  13. 튜브를 부드럽게 3번 뒤집어 섞습니다.
  14. 다중 분주 피펫을 사용하여 사전 라벨링되고 사전 냉각된 각 cryovial을 1mL의 PBMC로 채웁니다.
    참고: 다중 분주 파이펫을 작동하는 방법에 대한 데모는 추가 비디오 2 를 참조하십시오.
  15. 미리 냉각된 냉동 용기에 극저온을 넣습니다. 그런 다음 용기를 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.
  16. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 1.9-1.13단계를 반복합니다.
  17. 냉동 용기 내부에 극저온을 최소 12시간 동안 보관한 다음 -80°C의 라벨이 부착된 보관 상자로 옮깁니다.
    알림: 또는 장기 보관을 위해 냉동 극저온을 액체 질소(<-135 °C)로 옮기십시오.

2. EDTA 튜브의 플라즈마 및 버피 코트 처리

  1. 실온에서 1,800 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다.
    참고: 원심분리 후 최상층은 혈장으로 구성되고 하단층은 적혈구가 포함되며 계면은 버피 코트가 됩니다. 시각화에 대해서는 그림 1B 를 참조하십시오.
  2. 새로운 전사 피펫을 사용하여 버피 코트 층을 방해하지 않고 가능한 한 많은 플라즈마를 흡입합니다. 그런 다음 0.5mL 분취액을 사전 라벨링된 극저온 저장고에 분주합니다. 버피 코트 층을 흡인하고 적절하게 라벨이 지정된 cryovial로 옮깁니다.
    참고: 일부 혈장과 적혈구는 버피 코트 컬렉션을 오염시킬 수 있습니다.
  3. 필요에 따라 각 환자 또는 치료 상태에 대해 2.2단계를 반복합니다.
  4. 채취 후에는 극저온을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
    알림: 또는 장기 보관을 위해 액체 질소(<-135 °C)에 보관하십시오.

3. PBMC 해동

  1. 해동 하루 전에 표 3 에 나열된 재료 및 시약의 체크리스트를 인쇄하고 그에 따라 준비하고 라벨을 붙입니다.
    참고: 이 프로토콜은 1mL의 PBMC를 포함하는 1.5mL 튜브 1개의 해동을 위해 설계되었습니다. 각 튜브는 약 200만 개의 PBMC를 생성하며, 그 중 약 50%와 20%는 각각 살아있는 림프구와 단핵구입니다. 실험적 요구 사항에 따라 확장할 수 있습니다. 세포의 절대 수는 환자 또는 치료 조건에 따라 크게 다를 수 있습니다.
  2. 드라이아이스를 사용하여 냉동 PBMC를 보관에서 옮기고 37°C 인큐베이터에서 4분 동안 또는 마지막 얼음 결정 해동 직전에 해동합니다.
    참고: 원하는 경우, 섹션 4에 자세히 설명된 대로 세포 계수 및 생존도 측정을 위해 부분 표본을 채취할 수 있습니다.
  3. 해동 후 각 극저온 1mL에 용액 4(PBS + 2mM EDTA)를 추가합니다. 그런 다음 해동된 모든 PBMC 튜브에 대해 10mL의 용액 4가 들어 있는 사전 라벨이 부착된 50mL 튜브에 내용물을 붓습니다. 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
  4. 빈 50mL 튜브에 세포 여과기를 놓고 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 붓습니다.
    알림: 필요한 경우 가볍게 두드려 표면 장력을 끊습니다.
  5. 변형된 세포가 포함된 각 튜브를 실온에서 400 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다.
  6. 원심분리 후 DMSO가 함유된 상층액을 붓습니다. 필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다.
  7. 다운스트림 실험 요구 사항(예: 세포 배양 배지, 유세포 분석 항체 칵테일 등)에 적합한 원하는 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.

4. 세포 계수 및 생존력

  1. 3.2단계에서 동결 PBMC를 해동한 직후 20μL의 세포를 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 동일한 부피의 0.4% Trypan Blue 용액을 추가하고 피펫을 위아래로 부드럽게 3-4회 추가하여 혼합합니다.
  2. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 계수하고 생존 가능성을 평가합니다. 희석 계수 2가 고려되었는지 확인합니다.
    주의: 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 혈구측정기는 세포 수 및 생존율을 평가하기 위한 대체 방법으로 사용될 수 있다23.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMC 수집 및 동결 보존 후, 56개의 고유한 샘플에서 해동된 PBMC, 단핵구 및 림프구의 생존력을 제조업체의 지침에 따라 표 4에 나열된 시약을 사용하여 유세포 분석으로 평가했습니다(그림 2A-F). PBMC, 단핵구 및 림프구의 평균 ±SD 생존율은 각각 94± 4.0%, 98± 1.1%, 93± 5.6%로 달성되었습니다(그림 2G). Trypan Blue 배제에 의한 생존도 측정은 평균 생존율이 88 ± 7.5%이고 세포 수가 2.3 x 106 ± 1.9 x 106이었습니다. 유세포 분석 분석은 또한 살아있는 단핵구가 17 ± 5.9%를 차지하고 림프구가 전체 PBMC의 53 ± 13.0%를 구성한다는 것을 보여주었습니다.

이어서, 유세포 분석에 의해 59개의 고유한 샘플로부터 해동된 PBMC로부터 단핵구를 분류하고, 다른 문헌24에 기술된 바와 같이 라이브러리 준비 및 RNA-시퀀싱을 위해 제출하였다. 93 ± 6.3%의 판독 정렬과 49.6 ± 1.4%의 GC 함량으로 평균 ±18.0 ± 1,630만 개의 SD 총 염기서열 수가 달성되었습니다(그림 3A-B). 56개의 고유 샘플의 하위 집합에서 평균 SD 고유 매핑 읽기 비율이 88 ± 3.6%인 것으로 나타났습니다.± 이러한 매개변수는 고품질 RNA 염기서열분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 적합한 실행 가능한 PBMC가 이 프로토콜을 사용하는 모든 수준의 실험실 교육을 받은 작업자가 얻을 수 있음을 보여줍니다.

구성 요소밀도인용
혈장1.022 g/mL 내지 1.026 g/mL1
혈소판<1.061 g/mL - >1.070 g/mL2
PBMC (폴리엠비엠비)<1.077g/mL6
저밀도 호중구*<1.077g/mL3
과립구(호중구*, 호염기구 및 호산구)>1.077g/mL6
적혈구1.11g/mL4

표 1: 전혈의 성분을 밀도가 감소하는 순서로 나열.

레이건트/소재금액(CPT 튜브 6개 및 EDTA 튜브 1개당)팁주의 문구
CPT 튜브6환자 또는 샘플 ID에 따라 라벨을 부착합니다.
EDTA 튜브1환자 또는 샘플 ID에 따라 라벨을 부착합니다.
50 mL 코니컬 튜브2환자 또는 검체 ID 외에도 PBMC용 튜브 1개와 폐기물용 튜브 1개에 라벨을 부착합니다.
크라이오비얼39PBMC의 경우 라벨 30, EDTA 플라즈마의 경우 8, 버피 코트의 경우 1. 모든 극저온을 사용할 수 있는 것은 아닙니다.
미스터 프로스티2이소프로판올을 중간 지점까지 채우고 -20°C에서 밤새 미리 식힙니다.이소프로판올은 가연성 자극제입니다. 스파크/화염으로부터 멀리하십시오. 흡입을 피하고 장갑을 끼고 주의하십시오.
플라보피리돌100 μL의 1000X 스톡1000X 플라보피리돌 스톡을 제조하려면 DMSO 1.14mL에 플라보피리돌 5mg을 10mM 농도로 현탁시킵니다. 200 μL를 개별 용기에 분취 한 다음 얼립니다. 사용하려면 개별 부분 표본을 해동하고 DNase/RNase가 없는 증류수에 1:10으로 희석한 다음 1000X 용액으로 사용합니다.플라보피리돌은 자극제입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.
해결 방법 150mLRPMI 중간.
50mL의 원액을 만들려면 50mL의 RPMI 배지를 사용합니다.
해결 방법 215mLRPMI 배지 + 12.5% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌.
50mL의 원액을 만들려면 25mL RPMI 배지 + 25mL 인간 혈청 알부민 + 50μL 1000X 플라보피리돌을 사용합니다.		플라보피리돌은 자극제입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.
해결 방법 315mLRPMI 배지 + 11.25% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌 + 10% DMSO.
50mL의 원액을 만들려면 22.5mL RPMI 배지 + 22.5mL HSA + 5mL DMSO + 50μL 1000X Flavopiridol을 사용합니다.		플라보피리돌(Flavopiridol)은 자극제이며 DMSO는 독성이 있어 피부를 통해 쉽게 흡수됩니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.

표 2: PBMC를 수집하고 동결 보존하기 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 물질 체크리스트.

레이건트/소재양(냉동 PBMC 1mL 분취액당)팁주의 문구
해결 방법 410mLPBS + 2mM EDTA

50mL의 원액을 만들려면 5mL 10X PBS + 200μL 0.5M EDTA + 44.8mL DNase/RNase-free 증류수를 사용합니다.
50 mL 코니컬 튜브3환자 또는 검체 ID 외에도 사전 변형된 PBMC의 경우 튜브 1개, 변형 후 PBMC의 경우 1개, 폐기물의 경우 1개의 튜브에 라벨을 부착합니다. 사전 염색된 PBMC용으로 라벨이 부착된 튜브에 동결 PBMC의 mL당 9mL의 용액 4를 채웁니다.
1.5 mL 튜브1세포 계수용; 환자 또는 샘플 ID가 있는 라벨
0.4% 트리판 블루 용액20 μL세포 계수용; 전날 미리 1.5mL 튜브에 추가할 수 있습니다.트리판 블루는 발암 물질입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.

표 3: PBMC의 해동 및 계수를 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 재료의 체크리스트.

시약/재료금액(100만 셀당)
살아있는 죽은 얼룩5 μL
휴먼 트러스트 테인 FcX5 μL
CD3 항체5 μL
CD19 항체5 μL
CD56 항체5 μL
CD66b 항체5 μL
HLA-DR 항체5 μL
CD14 항체5 μL
CD16 항체2.5 마이크로리터
RNA신100개 유닛

표 4: 유세포 분석에 의한 PBMC에서 단핵구 분리를 위한 시약 표.

밀도 구배 원심분리 다이어그램의 혈액 성분 분리; 플라즈마, PBMC, 버피 코트 레이어.
그림 1: 밀도 구배 원심분리 또는 EDTA 튜브에서 원심분리로 분리한 전혈 성분. (A) 밀도 구배 원심분리 튜브에서 전혈을 원심분리하면 밀도 구배 배지 위의 혈장, 혈소판 및 PBMC가 밀도 구배 배지 아래에 다핵 및 적혈구가 분리됩니다. (B) EDTA 튜브에서 전혈을 원심분리하면 최상층에서 혈장을, 최하층에서 적혈구를, 계면에서 버피코트를 분리합니다. Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유세포 분석 산점도; PBMC, 단핵구, 림프구; 생존력 분석, 세포 유형 그래프.
그림 2: 해동된 동결 보존된 PBMC의 생존력은 활성/데드 플로우 염색 및 유세포 분석으로 평가되었습니다. (A) 별표 *로 표시된 파편은 전방 및 측면 산란 게이팅에 의해 PBMC에서 제외됩니다. (B) 전체 PBMC의 대표적인 살아있는/죽은 분석 (C) Pan-monocyte는 다음 FITC 표지 표면 항원(CD3, CD19, CD56 및 CD66b)에 대해 HLA-DR 양성 및 음성으로 gated. (D) 단핵구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (E) 다음 FITC 표지된 표면 항원에 의해 차단된 림프구: CD3, CD19, CD56 및 CD 66b. (F) 림프구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (G) 56개 샘플에서 정량화된 각 세포 유형의 생존율(%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FastQC 데이터 분석 그래프; 백만 개의 시퀀스 대 정렬 가능한 GC 콘텐츠 배포.
그림 3: 냉동 보존된 PBMC에서 분류된 단핵구의 RNA 염기서열 분석 품질. 56개의 고유한 샘플이 염기서열 분석되었고 총 염기서열 1,630만 ± 평균 SD 18.0± 생성되었습니다. (A) 염기서열의 92.5% ± 6.3%가 기준 게놈과 일치하여 정렬률이 높았습니다. (B) 이들 서열의 GC 함량은 49.6 ± 1.4%였다. FastQC25로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 비디오 1: 원심분리기 사용 방법 시연 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 비디오 2: 다중 디스펜서 피펫 작동 방법 시연. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMC 수집 및 동결 보존을 위한 이 프로토콜은 사전 연구 실험실 교육을 받은 개인에 관계없이 개인에 의해 성공적으로 구현되었습니다. 당사의 응용 분야에서는 저장된 PBMC에서 정제된 생존력이 높은 단핵구의 FACS 및 RNA 염기서열분석을 통해 고품질 염기서열을 도출했습니다.

이 프로토콜의 가장 큰 장점은 접근성입니다. 프로토콜에 제시된 기술은 고체 밀도 그래디언트 매체로 사전 충전된 튜브를 사용합니다. 그 결과, 전혈을 튜브에 직접 채취한 후 즉시 처리하여 PBMC를 분리할 수 있습니다. 상대적으로 적은 수의 사전 제작된 솔루션과 특수 장비가 필요하며, 이는 시약을 준비할 수 있는 연구 실험실과 샘플을 수집하고 처리하는 임상 실험실 간의 협업을 용이하게 합니다. 서면 및 비디오 프로토콜은 모든 수준의 교육을 받는 작업자를 대상으로 합니다.

이 프로토콜은 PBMC를 분리하기 위해 신선한 전혈을 사용하므로 상대적으로 높은 기대 수율과 >90%의 순도를 가지지만 >98%26,27의 매우 높은 순도가 필요한 응용 분야에는 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 밀도 구배 원심분리 튜브는 특히 많은 수의 샘플을 수집해야 하는 경우 얻는 데 비용이 많이 들 수 있습니다.

PBMC 포집의 다른 방법으로는 액체 밀도 구배 매체 또는 면역자기 파괴28,29의 사용이 있다. 간단히 말해서, 전자는 헤파린화된 전혈 아래에 미리 만들어진 밀도 구배 매체를 층화한 다음 원심분리를 수행하는 것을 포함합니다. 후자는 자기 태그가 부착된 항체를 사용하여 비 PBMC를 라벨링한 다음 자기 기둥에 유지되고 라벨링되지 않은 PBMC는 영향을 받지 않고 통과합니다.

제시된 프로토콜에 비해, 액체 밀도 구배 매체의 사용은 비용이 적게 들고 밀도 구배 원심분리 튜브의 부족으로 인해 훨씬 더 적은 재료를 필요로 합니다. PBMC 분리는 표준 50mL 튜브8에서 수행할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 더 정교하고 처리 시간이 더 길며 사용자 오류의 위험이 더 높을 수 있습니다. 헤파린은 과도한 희석을 피하기 위해 정밀하게 첨가되어야 하며, 밀도 구배 매질은 양호한 PBMC 분리를 보장하기 위해 올바른 양으로 조심스럽게 적층되어야 한다26.

제시된 프로토콜에 비해, 면역자기 고갈의 사용은 더 높은 수율과 순도를 제공하고, 원심분리 부족으로 인한 취급 감소, 더 빠른 처리 시간을 제공하며, 훨씬 더 적은 재료를 필요로 한다30,31,32. 그러나 가장 큰 단점은 이 방법이 설명된 세 가지 방법 중 특히 대규모로 가장 비용이 많이 든다는 것입니다.

이 프로토콜은 강력하지만 특정 중요한 단계에 추가 주의가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 샘플이 혼합되지 않고 특히 여러 환자 또는 상태를 동시에 치료하는 경우 적절하게 라벨이 부착된 튜브에 배치되도록 합니다. 1.4단계에서는 PBMC가 삭제되지 않는지 확인합니다. 과도한 혈장은 PBMC의 농도를 감소시킬 뿐이며, 이는 시료 생존율과 품질을 유지하는 데 덜 중요합니다. 이와는 별도로, 수집된 PBMC에 침전물이 존재한다는 것은 밀도 구배 매체의 조각이 제거되었음을 시사합니다. 이 문제를 방지하기 위해 1.5단계에서 더 부드럽게 파이펫팅하십시오. 1.10 및 3.6단계에서 원심분리된 셀 펠릿이 폐기되지 않았는지 확인합니다. 솔루션 3에는 실온(33)에서 세포에 독성이 있는 DMSO가 포함되어 있으므로 단계 1.12 및 3.3에서는 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 또한 PBMC를 액체 질소에 보관하는 것이 -80°C에서 보관하는 것보다 권장된다는 점에 유의해야 합니다. -80°C에서 장기간 보관하면 세포 생존력이 감소하고 유전자 발현이 변경되는 것과 관련이 있습니다34,35.

이 프로토콜은 실험적 필요에 따라 조정될 수 있습니다. 용액 2 및 3에 RNA 중합효소 및 mRNA 합성 억제제인 플라보피리돌(flavopiridol)을 추가하는 것은 RNA 염기서열분석36에서 핸들링 및 스트레스 유발 아티팩트를 방지하기 위한 것입니다. 그러나, 플라보피리돌은 PBMC를 활용한 기능적 또는 생체외 연구가 필요한 경우 생략될 수 있다.

EDTA 튜브에서 수집된 혈장은 킬레이트제인 EDTA로 오염됩니다. 결과적으로 EDTA 플라즈마는 응고 또는 칼슘 이온37,38과 관련된 분석에 적합하지 않습니다. 원하는 경우, 원심분리 후 밀도 구배 배지 튜브의 플라즈마 층을 대신 1.4단계에서 수집할 수 있습니다. 이 튜브에는 항응고제로서 나트륨 헤파린이 포함되어 있으며, 이는 헤파리나제39를 첨가하여 제거할 수 있습니다. 특히, 헤파린은 역전사효소 및 PCR 증폭을 억제하여, 수집된 혈장을 헤파린-차단제(40)의 첨가 없이는 PCR 실험에 적합하지 않게 만든다.

EDTA 튜브에서 수집된 버피 코트는 DMSO 또는 플라보피리돌을 함유한 용액에 저장되지 않습니다. DMSO는 얼음 결정 형성 및 세포 사멸을 줄이는 데 중요하다41. 플라보피리돌은 RNA 합성 억제에 중요하다36. 따라서 버피 코트는 생체 외 및 전사체 분석에 적합하지 않습니다. 원하는 경우, 세포 생존력을 최대화하고 RNA 합성을 억제하기 위해 수집된 버피 코트를 사용하여 단계 1.6 내지 1.15를 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 RNA 염기서열분석을 위해 설계되었지만, 이 프로토콜을 사용하여 수집 및 냉동보존된 PBMC의 추가적인 잠재적 응용 분야에는 세포 배양, 유전자 편집, 생체 외 기능 연구, 단일 세포 분석, 유세포 분석에 의한 표현형 분석 또는 비행 시간에 의한 세포 분석, DNA/RNA 또는 단백질 분리, 면역 조직화학을 위한 슬라이드 등이 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 관련 재정적 또는 비재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자발적으로 동의와 시간, 혈액 샘플 기증을 해주신 환자들께 감사드립니다. 또한 Kansas University Medical Center의 Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton 및 Mark McClellen 박사의 협력과 원격 사이트에서 이 프로토콜을 구현한 것에 감사드립니다. CY는 NIH 보조금 1K08HL150271로부터 연구 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1000 &마이크로; L TipsGilsonF174501PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tubeBiopioneeerCNT-15To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012에 대한 환자/치료 조건 당 2 팁 필요PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 20 µ에 대해 환자/치료 조건당 약 40개의 cryovials
가 필요합니다. L TipsGilsonF174201세포 계수에 사용; 필요한 부피는 사용된 세포 계수 방법에 따라 다릅니다. 해동할 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 팁
50mL Conical TubeCEM Corporation50-187-7683PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 3개가 필요합니다.
CD14 항체Biolegend325621
CD16 항체Biolegend360723
CD19 항체Biolegend363007
CD3 항체Biolegend300405
CD56 항체Biolegend318303
CD66b 항체Biolegend305103
세포 여과기BiopioneeerDGN258367해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 1
필요 CPT 단핵 세포 준비 튜브BD Biosciences362753PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Cryo Freezer Box에 대한 환자/치료 조건당 6개의 튜브 필요
Southern LabwareSB2CC-81PBMCBuffy Coat Collection
05-669-4550개의 cryovial 보유
DMSOInvitrogen15575020PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자/치료 조건당 약 2.5mL 필요
DNase/RNase-Free 증류수Invitrogen10977015PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection의 환자/치료 조건당 약 2mL 필요
해동
할 냉동 PBMC 1mL당 약 9mL 필요EDTA 튜브BD Biosciences366643PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자/치료 조건당 1개의 튜브 필요
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR 항체Biolegend307609
Human Serum AlbuminGeminiBio800-120PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자 또는 치료 조건당 약 25mL 필요
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KMr. Frosty
라벨 프린터PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001에 사용최대 18개의 튜브를 수용할 수 있습니다.
PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection의 환자/치료 조건에 따라 2개의 Mr. Frostys가 필요합니다.
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056M세포 계수에 사용; 필요한 부피는 사용된 세포 계수 방법에 따라 다릅니다.
프린터 라벨PhomemoPM-M110-3020PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 약 5개의 라벨 필요
RNase-Free EDTA (0.5 M)InvitrogenAM9260G약 40 &마이크로; L 해동할 냉동 PBMC 1mL당 필요
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625해동할 냉동 PBMC 1mL당 약 1mL 필요
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVPBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Transfer Pipettes Fisherbrand에 대한 환자 또는 치료 조건당 약 80mL 필요
13-711-7MPBMC/Plasma/Buffy Coat 수집 튜브 홀더에 대한 환자/치료 조건당 약 5개 필요
Endicott-Seymour14-781-15최대 80개의 CPT/EDTA 튜브 보유
1개가 필요합니다. 개 Cryotube Rack Fisherbrand에 대한 환자/치료 조건당 1개 필요 최대 에 대해 환자/치료 조건당 약 3개의 팁이 필요합니다.

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